Leishmania est un parasite eucaryote divergent responsable d’un large spectre de maladies à travers le monde. Ce parasite est caractérisé par une aneuploïdie mosaïque, constitutive, c’est-à-dire qu’au sein d’une population chaque cellule comporte une combinaison unique de mono-, di- et trisomies de chacun de ses 36 chromosomes. L’aneuploïdie mosaïque est générée et maintenue chez les générations suivantes grâce à un taux élevé de répartition asymétrique des chromosomes lors de la mitose, entrainant le gain ou la perte de chromosomes entiers. Ceci implique une régulation non-conventionnelle de la réplication, suivie d’une ségrégation permissive des chromosomes.L’objectif général de cette étude était de comprendre la dynamique de la réplication de l’ADN ainsi que de cartographier les sites d’initiation de la réplication chez Leishmania, en utilisant la technique du peignage moléculaire d’une part et celle du ChIP-seq d’une autre part. Nous avons ainsi pu caractériser les différents paramètres de progression de la fourche de réplication. Un des résultats majeurs qui ressort de cette étude est que Leishmania possède les plus grandes distances inter-origines et la plus grande vitesse de réplication parmi les autres eucaryotes déjà étudiés. Nous avons également pu estimer que le génome de Leishmania possède environ 168 origines de réplication. Afin d’étudier les acteurs impliqués dans la réplication de l’ADN chez Leishmania, nous avons développé l’outil génétique CRISPR/Cas9. Pour développer cet outil, nous avons basé notre approche sur une stratégie à deux vecteurs : l’un permet l’expression du single guide (sg)RNA et l’autre celle de l’endonucléase Cas9. La validation de cet outil génétique a été réalisée par le knock-out du locus PFR2 codant une protéine flagellaire. Dans un second temps, nous avons fait évoluer le CRISPR/Cas9 vers un système inductible pour réaliser les knock-out et des étiquetages au locus endogène de protéines d’intérêt. Nous avons utilisé ce nouveau système pour étudier la fonction de deux protéines potentiellement impliquées dans le complexe de reconnaissance des origines de réplication. Malgré une fuite du système, nous avons pu réaliser le KO des gènes Orc1b et Orc1/Cdc6 et suivre la progression du cycle cellulaire. Nous avons pu constater que la perte de ces gènes conduisait à un défaut de croissance ainsi qu’à l’apparition de cellules sans noyau. L’insertion d’une étiquette au locus endogène d’Orc1b nous a parmi de confirmer la localisation que nous avions obtenue avec une construction épisomale et va permettre d’étudier plus précisément le rôle de cette protéine.En conclusion, nous avons mis en évidence des paramètres de réplication originaux et démontré, en utilisant le CRISPR/Cas9, que les protéines Orc1b et Ocr1/Cdc6 étaient impliquées dans la duplication du noyau de Leishmania, ce qui est en accord avec leur rôle putatif dans la réplication de l’ADN. / Leishmania, a protozoan parasite which causes a large range of diseases worldwide, is characterized by a constitutive 'mosaic aneuploidy', i.e. each cell in a population possesses a unique combination of mono-, di- and trisomies for each of its 36 heterologous chromosomes. Mosaic aneuploidy is generated and maintained via high rates of asymmetric chromosomal allotments during mitosis, leading to the gain or loss of whole chromosomes. This implies an unconventional regulation of the replication, followed by a permissive segregation.The main objective of this study was to unravel DNA replication dynamics and to map the replication initiation sites in Leishmania using DNA combing and ChIP-seq analyses. First, we have characterized DNA replication fork parameters. One of the major findings of this study was that Leishmania exhibits the fastest replication speed and the largest interorigin distances among the eukaryotes tested so far. We have also estimated that the Leishmania major genome possesses 168 origins of replication.To study the actors involved in DNA replication, we first had to develop novel genetic tools. The CRISPR/Cas9 (clustered regularly interspaced short palindromic repeats and CRISPR associated endonuclease 9) system is a recently discovered powerful technique for genome editing. In order to adapt this system to Leishmania, we have chosen a two-plasmid strategy: one for the expression of the single guide (sg) RNA and a second for the expression of the endonuclease CAS9. The proof of concept has been based on the disruption of the paraflagellar rod-2 (PFR2) loci by the CRISPR-Cas9 system. In a second attempt, we have developed an inducible CRISPR-Cas9 system, both to obtain knock outs and to perform marker-free endogenous gene tagging. We used the system to investigate the function of Origin Recognition Complex proteins. Although the system was leaky, the genome was edited as expected. We thus deleted Orc1b and Orc1/Cdc6 and monitored the cell cycle progression of the parasite. We found that the depletion of these nuclear proteins lead to a growth defect and to the appearance of zoids (anucleated cells). The endogenous tagging of Orc1b confirmed the localization previously obtained using an episomal expression vector, and will allow further investigation on the role of this protein.In total, we have shown the presence of original replication dynamics parameters in Leishmania, and using CRISPR Cas9, we have demonstrated that Orc1b and Orc1/Cdc6 are involved in the nuclear duplication of Leishmania, in agreement with their putative in DNA replication.

La division cellulaire est un processus biologique universel nécessaire à la reproduction, au développement, à la survie cellulaire ainsi qu’à la réparation des tissus. Une ségrégation chromosomique exacte pendant la mitose est essentielle pour une répartition égale des chromosomes répliqués entre les cellules filles. Des erreurs dans la ségrégation des chromosomes mènent à une condition appelée aneuploïdie, définie par un nombre inadéquat de chromosomes dans une cellule. L’aneuploïdie est associée à une altération de la santé cellulaire, la tumorigénèse, des malformations congénitales et l'infertilité. Contre toute attente, les embryons préimplantatoires de mammifères, dont les humains, consistent souvent en un mélange de cellules euploïdes et de cellules aneuploïdes. Ce mosaïcisme est inexorablement causé par des erreurs dans la ségrégation des chromosomes au cours des divisions mitotiques suivant la fécondation et est associé à un potentiel de développement réduit lors des traitements de fertilité. Malgré sa découverte il y a 25 ans, les mécanismes qui sous-tendent l’apparition de l'aneuploïdie mosaïque dans les embryons préimplantatoires sont toujours méconnus. Pour explorer les causes et les conséquences des erreurs de ségrégation chromosomique, des approches d'imagerie de fine pointe ont été utilisées sur des embryons préimplantatoires murins. L'analyse de la dynamique de la ségrégation des chromosomes via l’imagerie de cellules vivantes a permis d’identifier les chromosomes retardataires, lors de l’anaphase, comme la forme la plus répandue des erreurs de ségrégation. Ces chromosomes retardataires entraînent fréquemment une encapsulation de chromosome unique dans une structure appelée micronoyau. D'autres expériences d'imagerie par immunofluorescence sur des cellules vivantes ou fixées ont révélé que les chromosomes des micronoyaux subissent des dommages importants à l'ADN et sont mal répartis de manière récurrente lors des divisions cellulaires subséquentes dans la phase préimplantatoire. D’autres approches ont aussi permis d’examiner l'efficacité du mécanisme de contrôle de l’assemblage du fuseau mitotique, (SAC pour Spindle Assembly Checkpoint). Les résultats obtenus attestent que le SAC fonctionne, cependant la signalisation liée au SAC n’est pas efficace et ne permet pas de différer l'anaphase, malgré la présence de chromosomes retardataires et ce indépendamment de la taille des cellules. Les résultats présentés révèlent aussi qu’une inhibition partielle d’une cible du SAC, le complexe de promotion de l'anaphase (APC/C), cause une mitose prolongée et une réduction des erreurs de ségrégation. En outre, les études présentées démontrent que la fonction déficiente du SAC pendant le développement préimplantatoire est la cause principale d’une forte incidence de chromosomes retardataires qui entraînent une mauvaise ségrégation chromosomique répétée et qui causent une aneuploïdie mosaïque dans l’embryon. De plus, ce travail fournit la preuve que la modulation pharmacologique de la signalisation SAC-APC/C permet d’éviter les erreurs de ségrégation des chromosomes dans les embryons précoces. En conclusion, ces résultats apportent de nouvelles perspectives sur les causes et la nature des erreurs de ségrégation chromosomique dans les embryons. De plus, ce travail apporte de nouvelles explications mécanistiques sur l'apparition du mosaïcisme dans les embryons ce qui aura des implications importantes dans la détection et la prévention thérapeutique potentielle de l'aneuploïdie mosaïque dans les embryons préimplantatoires. / Cell division is a universal biological process necessary for reproduction, development, cell survival and the maintenance and repair of tissues. Accurate chromosome segregation during mitosis is essential to ensure replicated chromosomes are partitioned equally into daughter cells. Errors in chromosome segregation often result in cells with abnormal numbers of chromosomes, a condition termed aneuploidy, which is associated with impaired cellular health, tumorigenesis, congenital defects and infertility. Counterintuitively, preimplantation embryos from many mammalian species, including humans, often consist of a mixture euploid and aneuploid cells. Such mosaic aneuploidy in embryos is inexorably caused by errors in chromosome segregation during mitotic divisions following fertilization and has been associated with reduced developmental potential in fertility treatments. However, ever since its discovery 25 years ago, how and why mosaic aneuploidy arises in the preimplantation embryo has remained elusive. To explore the causes and consequences of embryonic chromosome segregation errors, advanced imaging approaches were employed in the mouse preimplantation embryo. Live cell imaging analysis of chromosome segregation dynamics identified lagging anaphase chromosomes as the most prevalent form of chromosome mis-segregation in embryos. Lagging chromosomes frequently result in the encapsulation of single chromosomes into micronuclei, which occur in embryos in vitro and in vivo. Further live imaging and immunofluorescence experiments revealed chromosomes within micronuclei are subject to extensive DNA damage and centromeric identity loss, failing to assemble functional kinetochores and being recurrently mis-segregated during ensuing cell divisions in preimplantation development. To uncover the underlying causes for the increased propensity for chromosome mis-segregation in embryos, live imaging and loss-of-function approaches were used to examine the effectiveness of the mitotic safeguard mechanism, the Spindle Assembly Checkpoint (SAC). These studies demonstrated that the SAC normally functions to prevent segregation errors during preimplantation development but SAC signaling at misaligned chromosomes fails to delay anaphase. Moreover, SAC failure in embryos is most evident during mid-preimplantation development, independent of cell size. Partial inhibition of SAC target, the Anaphase Promoting Complex (APC/C), extended mitosis and reduced chromosome segregation errors in embryos. These studies have uncovered deficient SAC function during preimplantation development as a major cause for the high incidence of lagging chromosomes in embryos, which result in repeated mis-segregation of single chromosomes in a manner that necessarily causes mosaic aneuploidy. Additionally, this work provides proof-of-principle demonstration that pharmacological modulation of SAC-APC/C signalling can avert chromosome segregation errors in the early embryo. Altogether, these findings present new insights into the causes and nature of chromosome mis-segregation in embryos, providing novel mechanistic explanations for the occurrence of mosaicism that will have substantial implications for the detection and potential therapeutic prevention of aneuploidy in preimplantation embryos.