Reproduction de : Thèse d'exercice : Médecine. Pneumologie : Nantes : 2009. / Bibliogr.

Les dérivés aminostéroïdiens (DASs) comme la squalamine et ses analogues ont démontré une activité antimicrobienne évaluée in vitro contre des bactéries et des champignons de référence et jamais contre des souches cliniques et/ou multi résistantes. Il a été montré que la squalamine agit contre des bactéries à Gram négatif en perturbant l’intégrité de leur membrane externe. Au contraire, son mécanisme contre les bactéries à Gram-positif n’a pas été étudié. Ainsi, l’objectif de ce travail a été d’évaluer d’une part l’activité antimicrobienne in vitro de la squalamine et de dérivés aminostéroïdiens (DAS 1-2, Figure 1) contre un panel de souches cliniques de bactéries et de champignons filamenteux isolés des crachats des patients atteints de mucoviscidose et des levures impliquées dans des fongémies, et d’autre part de mieux comprendre leur mécanisme d’action vis-à-vis des bactéries à Gram-positif et à Gram-négatif. Nous avons trouvé que les DASs possèdent une activité antibactérienne intéressante qui était d’autant plus importante que la bactérie est non mucoïde et/ou sensible à la colistine laissant supposer qu’une corrélation existe entre l’activité des DASs et celle de la colistine vis-à-vis des bactéries à Gram-négatif. Malgré cette corrélation, les DASs ont été plus actifs contre les bactéries à Gram-positif suggérant la présence de deux mécanismes d’action différents à l’égard des deux groupes de bactéries. Alors que les agents antifongiques classiques ont montré des activités hétérogènes vis-à-vis des champignons filamenteux et des levures testés d’une manière dépendante de l’espèce, les DASs ont présenté des activités homogènes indiquant que ces molécules possèdent un mécanisme d’action différent e ceux rapporté avec les antifongiques classiques. Ainsi, nous données préliminaires ont indiqué que la squalamine induit une rupture de la membrane de levures par, probablement, un effet "mécanique". L’analyse du mécanisme d’action antibactérien de la squalamine a montré que cette molécules agit en perturbant l’intégrité de bactéries à Gram-négatif d’un mécanisme comparable à celui d’un détergeant et en dépolarisant la membrane des bactéries à Grampositif conduisant à la rupture totale de cette membrane et au drainage de la matière cytoplasmique. Finalement, la faisabilité d’une forme galénique aérosol contenant un composé aminostéroïdien a été démontrée. / Aminosterol derivatives (ASDs) such as squalamine and its analogs have demonstrated an interesting in vitro antimicrobial activity evaluated against bacterial and fungal reference strains and never against clinical and / or multiresistant pathogens. It was shown that squalamine acts against Gram-negative bacteria by disrupting the integrity of their outer membrane. Instead, its mechanism of action against Gram-positive bacteria has never been studied. Thus, the aim of this study was firstly to evaluate in vitro antimicrobial activity of squalamine and two synthesized ASDs (ASD 1-2, Figure 1) against a panel of clinical strains of bacteria and filamentous fungi isolated from sputum of cystic fibrosis patients and yeasts involved in fungemia, and secondly to better understand their mechanism of action against Gram-positive and Gram-negative bacteria. We found that ASDs possess an interesting in vitro antibacterial activity which was more important against non-mucoid and/or colistin sensitive strains suggesting that a correlation exists between the activity of ASDs and that of colistin against Gram-negative bacteria. Despite this correlation, ASDs were more active against Gram-positive bacteria indicating the presence of two different mechanisms of action against both groups of bacteria. While classical antifungal agents showed heterogeneous activities against tested filamentous fungi and yeasts specie-dependent manner, ASDs presented homogeneous activities indicating that these molecules may possess a mechanism of action different from those reported with conventional antifungals. Thus, our preliminary data indicated that squalamine induced the disruption of yeast membrane, probably via a "mechanical" effect. Analysis of the antibacterial mechanism of action of squalamine has shown that this molecule acts by disrupting the integrity of bacterial membrane of Gram-negative bacteria via a detergent-like mode of action and by depolarizing the membrane of Grampositive leading to a total disruption of this membrane. Finally, the suitability of one of our compounds to be integrated in an aerosol formulation has been demonstrated.

Les cathepsines à cystéine (CP) participent à la dégradation du tissu bronchique ainsi qu’à l’inactivation de protéines de l’immunité innée lors de maladies inflammatoires. Lors de la mucoviscidose (CF), on observe un déficit de la protéine du surfactant pulmonaire SP-A, qui participe à la défense antimicrobienne. Nous avons caractérisé les CP dans des expectorations CF et analysé leur capacité à hydrolyser le SP-A. La balance CP/inhibiteurs est déséquilibrée en faveur des CP et la cathepsine B participe à ce déséquilibre en hydrolysant leurs inhibiteurs, les kininogènes. Cependant, les CP ne sont pas des marqueurs de colonisation par Pseudomonas aeruginosa. De plus, la cathepsine S clive sélectivement SP-A dans son site de liaison aux sucres et aux lipides, induisant la perte de ses propriétés antibactériennes et d’agrégation, contribuant au déficit de la défense innée, à la perte d’homéostasie du surfactant et à l’exacerbation de l’inflammation au cours de la mucoviscidose. / Cysteine cathepsins (CP) that are implicated in bronchial tissue injuries and inactivation of antibacterial proteins emerge as key players in pulmonary inflammations. A decrease of pulmonary surfactant protein SP-A which is involved in innate host defence has been reported in patients suffering from cystic fibrosis (CF). We characterized sputum CP and their ability to hydrolyze SP-A. There is an imbalance CP/inhibitor tipped in favor of CP proteolytic activities. Furthermore, cathepsin B, which is able to degrade major plasma CP inhibitor, kininogens, favors this imbalance. However, CP are not biomarkers of colonization by Pseudomonas aeruginosa. Moreover, Cat S cleaves SP-A specifically in its lectin-like domain (CRD) that conducts to the loss of antibacterial and aggregation properties. So, CP, especially cathepsin S, participate to the deficiency of innate immunity, surfactant homeostasis defect and to the exacerbation of inflammatory response in cystic fibrosis.

L’infection broncho-pulmonaire représente le problème majeur des malades atteints de la mucoviscidose. Plusieurs bactéries sont connues depuis des dizaines années comme les principaux agents responsables de ces infections (par exemple Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, Burkholderia cepacia, Achromobacter xylosoxidans…). Récemment, certains genres fongiques notamment les champignons filamenteux (comme Aspergillus, Scedosporium…) ont été identifiés comme des pathogènes émergeants ou ré-émergeants pouvant être responsables d’infection invasive. Ainsi, la détection des microorganismes impliqués dans ces colonisations et/ou infections respiratoires demeure importante sur le plan physiopathologique et clinique.Si la culture microbiologique reste la méthode la plus utilisée à ce jour pour le diagnostic des infections microbiennes, elle ne permet pas d’identifier les microbes non-cultivables ou difficiles à cultiver. Depuis quelques années, grâce au développement de la technique moléculaire de séquençage à haut-débit (next generation sequencing ou NGS), plusieurs études ont montré que l’écologie microbienne du poumon des patients atteints de la mucoviscidose est très complexe et correspond à une flore poly-microbienne, appelée le microbiote pulmonaire, comprenant non seulement des bactéries mais également des micromycètes (levures et/ou champignons filamenteux) et des virus et phages. Une dysbiose (modification en abondance et diversité) de cette flore pourrait influencer la fonction respiratoire et l’état clinique du patient.Alors que le microbiome bactérien et son rôle en pathogenèse sont largement étudiés, peu d’études ont porté sur la composante fongique (mycobiote/mycobiome) du microbiote pulmonaire. Notre travail de thèse s’inscrit dans les différents projets développés au sein de l’axe de recherche « Microbiote pro- et eucaryote pulmonaire » coordonné par le Pr Laurence Delhaes dans l’équipe Biologie et Diversité des Pathogènes Eucaryotes Emergeants (BDPEE) dirigée par le Dr Eric Viscogliosi. Il se focalise sur l’analyse NGS du microbiote pro- et eucaryotique respiratoire chez les patients atteints de la mucoviscidose et notamment la comparaison de différentes approches méthodologiques en vue d’une optimisation et standardisation de la méthode.Dans un premier temps, nous présenterons une synthèse des connaissances actuelles d’une part des phénomènes de colonisations/infections fongiques chez les patients atteints de mucoviscidose et d’autre part dans le domaine du microbiote pulmonaire et surtout du mycobiote pulmonaire autour duquel notre équipe se focalise.2Dans un deuxième temps, nous avons travaillé à mieux adapter l’approche NGS aux études du microbiote pulmonaire dans la mucoviscidose. En effet, le séquençage à haut-débit est une technique puissante mais pour laquelle des biais peuvent être introduits à de nombreuses étapes méthodologiques. Un des biais les plus importants est que l’approche NGS ne permet pas de différencier les microorganismes vivants, des cellules mortes ou endommagées, ni de l’ADN extracellulaire. Dans le contexte de notre travail –celui du microbiote pulmonaire chez des patients atteints de mucoviscidose et souvent exposés aux antibiotiques par voie intraveineuse à forte dose, l’analyse NGS pourrait évaluer incorrectement l’abondance et la diversité de ce microbiote pulmonaire. Un prétraitement des échantillons par propidium monoazide (PMA), qui permet de cibler sélectivement l’ADN des cellules vivantes, pourrait être une solution pour palier à cette limite. Notre étude avait donc comme objectif de déterminer si un prétraitement par PMA des expectorations modifiait le microbiote pro- et eucaryote pulmonaire analysé par NGS. Nous discutons l’intérêt et la relevance clinique de cette approche « PMA - NGS » permettant une quantification isolée des microorganismes vivants dans le contexte de la mucoviscidose. / Chronic pulmonary infection results in an irreversible decline in lung function in patients with cystic fibrosis (CF). While several bacteria are known as main causes for these infections (for example: Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, Burkholderia cepacia, Achromobacter xylosoxidans...), more recently some fungal genera including filamentous fungi (such as Aspergillus, Scedosporium...) have also been identified as emerging or re-emerging pathogens able to cause invasive mycosis. Thus, the identification of the microorganisms involved in the respiratory colonizations and/or infections has become essential.Still now culture methods remain the gold standard for diagnostic of microbial infections. However, it could not identify non-culturable or difficult-to-cultivate microorganisms. Thanks to the development of high-throughput sequencing (next generation sequencing or NGS), recent studies have shown that the lung of patients with CF is a complex poly-microbial flora, also called the CF lung microbiota, which includes not only bacteria but also fungi (yeast and/or filamentous fungi), and viruses and phages. Dysbiosis (loss of abundance and/or diversity) of the lung microbiota has been associated with the patient's decreased lung function and poor clinical status.While lung bacteriota and its role in pathogenesis have widely been studied, few research studies focus on the fungal component (mycobiota/ mycobiome) of the lungs. Our thesis (PhD work) focuses on NGS analysis of pro- and eukaryotic lung microbiota in CF patients, in particular on the comparison of different methodological approaches to optimize and standardize the NGS protocol. This project has been developed under the supervision of Pr. Laurence Delhaes in the “Biology and Diversity of Eukaryotic Emerging Pathogens” team directed by Dr. Eric Viscogliosi.Firstly, we present a state of art on the current knowledge on the fungal colonization/infections risk in CF as well as the development of new concepts of lung microbiota and lung mycobiota on which our team focuses.Secondly, we applied the NGS approach to study the pro- and eukaryotic microbiota in the sputum samples of CF patient lung. Indeed, NGS is a powerful technique that may introduce biases on numerous methodological steps. One of the most important biases is that this technique could not differentiate among the living microorganisms, the dead or damaged cells, and the extracellular DNA. In the context of the CF lung microbiota which is often exposed to high-dose intravenous antibiotics, the analysis by NGS might evaluate4inaccurately the abundance and the diversity of the lung microbiota. Pretreatment of samples by propidium monoazide (PMA), which can target selectively the DNA of viable cells, could be a solution to overcome this limitation. Our study aimed to determine whether a sample pretreatment with PMA modified the lung pro- and eukaryotic microbiota analyzed by NGS. We discuss the clinical relevance of this approach "PMA - NGS" in the context of CF patients to a better quantification of living microorganisms.

Thèse d'exercice : Pharmacie : Nantes : 2003. Mémoire DES : Biologie médicale : Nantes : 2003. / Thèse : 2003NANT026P. Bibliogr. f. 105-115 [129 réf.].

Reproduction de : Thèse doctorat : Pharmacie. Biologie moléculaire et cellulaire : Reims : 2005. / Titre provenant de l'écran-titre. Bibliogr. p.161-195.

Reproduction de : Thèse doctorat : Médecine. Biologie cellualire : Reims : 2006. / Titre provenant de l'écran-titre. Bibliogr. p.163-218.

Reproduction de : Thèse doctorat : Pharmacie. Immunologie : Reims : 2008. / Titre provenant de l'écran-titre. Bibliogr.

Thèse (Ph. D.)--Université Laval, 2007. / Titre de l'écran-titre (visionné le 5 mai 2008). Bibliogr.

Les macrophages sont en première ligne de la défense innée et jouent un rôle important dans l’initiation de la réponse immunitaire puisque régulant l’inflammation et permettant la clairance des pathogènes. Dans la mucoviscidose, ces phénomènes sont exacerbés et deviennent chronique sans pouvoir être résolus. Les objectifs de cette thèse ont été de déterminer des cibles potentielles responsables des altérations du macrophage dans la mucoviscidose. Dans le contexte inflammatoire, la forme soluble du CD14 (sCD14), dont la sécrétion est augmentée par les macrophages de patients atteints de la mucoviscidose, est caractérisé comme un DAMP puisqu’il contribue à l’entretien de l’inflammation au niveau tissulaire. Dans le contexte infectieux, l’activité de TRPV2, impliqué dans la phagocytose, est altérée. Dans la mucoviscidose, l’inflammation et l’infection sont aussi intimement liées par l’intermédiaire d’une altération des microstructures de la membrane plasmique impliquée dans la production du sCD14 et dans le processus de phagocytose. En conclusion, les modifications des fonctions du macrophage affaiblissent la défense innée des patients atteints de mucoviscidose et peuvent être impliqués dans la progression de la maladie. Par conséquent, les interventions visant à réduire l’inflammation et l’infection pourraient être bénéfiques afin de préserver la fonction pulmonaire des patients. Ainsi, les approches thérapeutiques visant à corriger les dysfonctions du macrophage de patients atteints de mucoviscidose pourrait fournir une meilleure résolution de l'infection et l'inflammation. / Macrophages play a significant role in the initiating stages of immune responses regulating inflammation and clearance of the pathogens. In cystic fibrosis, inability of the macrophage to act as a suppressor cell leading to chronic inflammation/infection cannot be resolved. The aims of this work was to find new targets responsible for alterations in cystic fibrosis macrophages. Regarding inflammation, the soluble form of CD14 (sCD14), find overproduced by cystic fibrosis macrophages, is characterized to be a DAMP as it contributes for maintenance of inflammation in tissues. Regarding infection, the activity of TRPV2, involved in phagocytic capacity of macrophage, is impaired. In cystic fibrosis, inflammation and infection were closely linked to the alteration of the plasma membrane microstructures involved in the production of sCD14 and in the phagocytosis process. In conclusion, the alterations of macrophage weaken innate defense of cystic fibrosis patients and may be involved in cystic fibrosis disease progression and lung damage. Consequently, interventions aimed to reduce ongoing infection and destructive inflammatory response may be beneficial in order to preserve their lung function. In this way, therapeutic approaches aimed to correct cystic fibrosis macrophages dysfunctions might provide improved resolution of infection and inflammation.