A la suite de la découverte au laboratoire d'une nouvelle réaction entre le méthylglyoxal et un α-aminoazahétérocycle, une nouvelle famille de modulateurs (famille I) de la protéine CFTR (Cystic Fibrosis Transmembrane conductance Regulator) a été mise en évidence. Les dysfonctionnements de cette protéine, qui constitue un canal chlorure transmembranaire, sont responsables de plusieurs pathologies de la mucoviscidose résultant de mutations du gêne correspondant.<br />Nous avons tout d'abord cherché à confirmer la structure du pharmacophore supposé en sélectionnant et évaluant des petites molécules contenant le pharmacophore ou en modifiant les groupements à proximité du pharmacophore. Cette étude a permis l'accès à de nouveaux composés issus de la réaction entre un autre α-oxoaldéhyde (éthylglyoxal) et des α-aminoazahétérocycles et, à deux autres familles de composés dérivés de la première (familles II et III). <br />Par ailleurs, en nous basant sur la structure des deux « chef de files », l'inhibiteur GPinh-5a et le potentiateur/activateur GPact-11a, nous avons développé une pharmacomodulation de la structure de base des composés actifs qui sont des dérivés de purine. Un grand nombre d'analogues ont ainsi été synthétisés.<br />Ces deux approches ont permis la mise en évidence de plusieurs nouveaux inhibiteurs et de deux nouveaux potentiateurs de la protéine CFTR. <br />Au regard des caractéristiques et des propriétés des composés les plus actifs, leur étude biologique doit donc être poursuivie dans le but d'aboutir à une utilisation thérapeutique

La mucoviscidose est une maladie à transmission autosomique récessive, due à des mutations du gène CFTR. Les patients, partageant de mêmes mutations de CFTR et un même environnement, ont une expression phénotypique variable, suggérant l'influence d'autres gènes modifiant la sévérité de la maladie, appelés gènes modificateurs. L'atteinte respiratoire, caractérisée par une inflammation exacerbée, est un facteur principal de morbimortalité. L'haplotype ancestral AH8.1, impliqué dans la réponse inflammatoire, est constitué de 4 variants : LTa +252A/G, TNF -308G/A, HSPA1B +1267A/G et AGER -429T/C. Ainsi, l'objectif était de rechercher une association entre l'haplotype AH8.1 et la sévérité de l'atteinte respiratoire. Nous avons montré dans une cohorte de 404 patients européens, porteurs de différentes mutations de CFTR, que AH8.1 était associé au déclin de la fonction respiratoire. Nous avons taché de répliquer nos résultats dans une cohorte homogène de 1089 patients français, F508del homozygotes, sans succès à ce jour. Nous poursuivons cette étude chez des patients porteurs d'autres mutations de CFTR. Les variants de cet haplotype ont également été étudié séparément. Nous avons ainsi montré que AGER-429T/C, non seulement modulait la sévérité de l'atteinte respiratoire, mais, était également associé in vitro à une plus grande production de la protéine RAGE. L'ensemble de ces résultats suggère à ce jour que l'haplotype AH8.1 pourrait moduler la sévérité de l'atteinte respiratoire des patients non homozygotes pour la mutation CFTR F508del. De plus, le variant AGER-429T/C seul, modulant la sévérité de l'atteinte respiratoire, la protéine RAGE pourrait être envisagée comme biomarqueur dans la mucoviscidose. Mots clés : mucoviscidose - gène modificateur - haplotype ancestral AH8.1 - RAGE

La pentraxine longue PTX3, récepteur soluble de l'immunité innée, joue un rôle important dans la protection contre certains pathogènes, en favorisant leur élimination et l'initiation de réponses immunitaires protectrices. PTX3 a notamment un rôle protecteur lors d'infections par Aspergillus fumigatus et Pseudomonas aeruginosa. La mucoviscidose, maladie héréditaire grave à transmission autosomique récessive, est caractérisée par des infections pulmonaires récurrentes, notamment par ces deux pathogènes. Nous avons donc émis l'hypothèse que le statut de PTX3 pourrait être altéré chez ces patients. L'expression et l'intégrité de PTX3 ont été analysées dans les expectorations de 51 patients atteints de mucoviscidose et de 7 patients atteints de broncho-pneumopathie chronique obstructive (BPCO). Les résultats montrent que la concentration de PTX3 est augmentée dans les sérums de patients atteints de mucoviscidose. Au contraire, la concentration de PTX3 dans les expectorations de patients atteints de mucoviscidose est considérablement plus faible que celle des patients atteints de BPCO. Cette faible concentration de PTX3 résulte d'un clivage protéolytique par l'élastase du neutrophile et par les protéases sécrétées par Aspergillus fumigatus. De manière intéressante, le domaine N-terminal de PTX3, impliqué dans la protection contre Aspergillus fumigatus, est préférentiellement dégradé par ces protéases. Cette dégradation est spécifique de la pentraxine longue PTX3 car les pentraxines courtes, CRP et SAP, ne sont pas dégradées. Ces résultats indiquent que la protéolyse sélective de PTX3 au niveau des voies respiratoires des patients atteints de mucoviscidose peut expliquer, en partie, les infections pulmonaires récurrentes par certains pathogènes.

L'utilisation de virus de bactéries ou bactériophages pourrait être un complément efficace à l'antibiothérapie. Mon travail a porté sur la caractérisation de bactériophages dirigés contre l'espèce Pseudomonas aeruginosa, pathogène opportuniste responsable d'infections des voies respiratoires des patients atteints de mucoviscidose.J'ai tout d'abord déterminé la sensibilité des souches mucoviscidosiques au Pyophage (un cocktail de phages thérapeutiques Géorgien) et identifié six phages lytiques de quatre genres différents. Environ 15% des souches sont résistantes au Pyophage. Ensuite, en utilisant les souches cliniques multi-résistantes aux phages comme bactérie d'enrichissement, 32 phages ont été obtenus à partir des eaux usées de France et Côte d'Ivoire. Tous les phages analysés sont caudés et distribués au sein de dix genres parmi lesquels six exclusivement lytiques. J'ai identifié des souches bactériennes qui demeurent insensibles à tous les phages. J'ai montré que le système CRISPRs-Cas n'est pas associé à la résistance des souches aux phages lytiques.

La mucoviscidose est une maladie génétique dont l’atteinte respiratoire est responsable de 90 % de la morbidité et de la mortalité et est caractérisée par une infection chronique et une inflammation persistante. Cette inflammation non contrôlée participe de manière importante à la dégradation du tissu pulmonaire. Malgré les progrès récents, les thérapies actuelles ne permettent pas un traitement efficace de l’atteinte respiratoire. Il est donc indispensable d’identifier de nouveaux mécanismes moléculaires et cellulaires impliqués dans l’inflammation pulmonaire. Dans ce but, nous nous sommes intéressés au canal calcique "Transient Receptor Potential Vanilloid 4" (TRPV4) exprimé au niveau de l’épithélium respiratoire. A l’aide d’approches in vitro et in vivo, nous avons démontré que l’activation du TRPV4 déclenche la sécrétion de médiateurs inflammatoires cytokiniques et lipidiques et un recrutement leucocytaire dans les poumons. Nous avons également observé une altération de la signalisation dépendante du TRPV4 dans le contexte de la mucoviscidose, suggérant que le TRPV4 pourrait constituer une cible prometteuse pour le développement de nouvelles thérapies anti-inflammatoires applicables en santé respiratoire. / Cystic fibrosis (CF) is due to mutations in the gene encoding the Cystic Fibrosis Transmembrane conductance Regulator (CFTR). The pulmonary consequence of the disease accunts for over 90 % of the morbidity and mortality and is characterized by chronic infection and persistent inflammation. This uncontrolled inflammation participates significantly to the degradation of the lung tissue. Despite recent progress, current therapies do not allow effecgive treatment of CF lung disease. It is therefore necessary to characterize nex cellular and molecular mechanisms that could contribute to lung inflammation. In that purpose, we focused on the calcium channel "Transient Receptor Potential Vanilloid 4" (TRPV4) expressed by respiratory epithelium. Using in vitro and in vivo approaches, we found that TRP4 activation triggers the secretion of inflammatory mediators (including cytokines and lipids) and leukocytes recruitment into the lungs. We also observed a significant alteration of TRPV4-dependent signalling in the CF context, suggesting that TRPV4 could constitue a promising target for the development of new anti-inflammatory therapies in lung diseases such as CF.

La mucoviscidose est une maladie génétique caractérisée par une obstruction des voies respiratoires, des infections et une inflammation pulmonaire résultant du recrutement massif de neutrophiles qui sécrètent des protéases : l’élastase, la protéase 3 et la cathepsine G. Ces protéases peuvent être sécrétées selon deux voies, la dégranulation ou la sécrétion de NETs (Neutrophil Extracellular Traps), qui sont des fibres de chromatine auxquelles elles sont associées et décrites comme des structures antimicrobiennes. Dans le milieu extracellulaire, la dérégulation du contrôle de l’activité des protéases par leurs inhibiteurs conduit à la dégradation progressive du tissu pulmonaire. Nous avons montré que cette dérégulation était modulée par l’interaction des protéases avec l’ADN présent dans les sécrétions bronchiques des patients et que le ciblage de ces protéases par des inhibiteurs exogènes pouvait être amélioré in vitro par de la DNase ou de la polylysine qui compacte l’ADN. Ce polypeptide est également bactéricide vis-à-vis des pathogènes majeurs de la mucoviscidose, S. aureus et P. aeruginosa. Nos travaux montrent également que les NETs sont sécrétés dans les poumons des patients où ils constituent un réservoir de protéases actives potentiellement délétère et n’ont pas d’effet bactéricide vis-à-vis de S. aureus et P. aeruginosa. Nos travaux montrent que les voies de signalisation conduisant à la sécrétion des NETs varient selon le stimulus, générant des structures aux propriétés différentes. / Cystic fibrosis (CF) is a hereditary disease characterized by the obstruction of the airways, infections and a chronic lung inflammation due to a massive recruitment of neutrophils that secrete proteases: the elastase, the proteinase 3 and the cathepsin G. These proteases can be secreted by two mechanisms, namely degranulation and the secretion of NETs (Neutrophil Extracellular Traps), which are chromatin fibers to which they are bound and that have been described as antimicrobial structures. In the extracellular environment, the dysregulation of these proteases control by their inhibitors leads to progressive lung tissue degradation. We have shown that this dysregulation was influenced by the interaction of the proteases with the DNA found in the lung secretions of CF patients and that targeting these proteases with exogenous inhibitors could be improved in vitro by DNase or polylysine, which compacts DNA. This polypeptide also presents a bactericidal effect towards the major CF-associated pathogens, S. aureus and P. aeruginosa. Our work also shows that NETs are secreted in the lungs of CF patients, where they are a potentially deleterious reservoir of active proteases, and that they do not display any bactericidal effect towards S. aureus and P. aeruginosa. Our work shows that the signalization pathways leading to NETs secretion vary depending on the stimulus, generating structures that present different properties.

La mucoviscidose est une maladie causée par des mutations du gène cftr entraînant des défauts importants de la protéine CFTR. La mutation la plus fréquente (F508del) est caractérisée par un repliement incorrect conduisant à la rétention de la protéine dans le RE.L’accumulation de CFTR-F508del dans le RE, l’inflammation et les infections vont déclencher un stress du RE dans les cellules épithéliales ainsi que l’UPR. Cette dernière est une réponse adaptative déclenchée par le stress du RE et permet de rétablir l’homéostasie de ce compartiment. L’UPR est constituée de trois voies majeures dont l’une d’entre elles est activée dans les cellules exprimant un CFTR-F508del. Il s’agit de la voie ATF6 qui est de plus responsable de la répression transcriptionnelle du CFTR, ce qui en fait une cible thérapeutique potentielle. Nous avons montré que son inhibition conduit à l’amélioration de la fonction duCFTR-F508del et à l’augmentation de sa présence à la membrane des cellules.Nous nous sommes également intéressés au Mg2+ et au TRPM7, le régulateur principal de la [Mg2+]i dans les cellules. Nous avons émis l’hypothèse que TRPM7 était en partie responsable de l’activation d’ATF6 dans les cellules exprimant un CFTR-F508del. Le but de cette seconde partie du projet était donc tout d’abord d’étudier la relation existante entre le Mg2+, TRPM7 et le CFTR. Nous avons montré qu’il existait des différences de [Mg2+]i selon le type de mutation du CFTR exprimé par les cellules. Ces différences sont en partie dues à un défaut d’activation de TRPM7, lui-même probablement lié à un défaut du CFTR. En augmentant l’activité de TRPM7 par du Naltriben, nous avons pu montrer un effet potentialisant sur leCFTR-G551D. / Cystic fibrosis is caused by mutations in the cftr gene resulting in several defaults on the CFTR protein. The most frequent mutation is F508del which is characterized by an incorrect folding causing its retention within the ER. CFTR-F508del protein accumulation in the ER, inflammation and infections will trigger the ER stress in epithelial cells, as well as UPR. UPR constitutes an adaptive response of the ER in order to restore ER’s homeostasis. UPR consists in three major pathways. Among them, one is activated in cells expressing CFTR-F508del protein. The ATF6 pathway of UPR is responsible of the transcriptional repression of CFTR, which makes of it a potential therapeutic target. We showed that the inhibition of ATF6 leads to the improvement of CFTR-508del function, as well as its increased presence in the cellular membrane. We were also interested in Mg2+ and TRPM7, the main regulator of [Mg2+]i. We suspected that TRPM7 is, at least in part, responsible for the activation of ATF6 in cells expressing the mutant CFTR-F508del. Thus, the second part of my work was focused on the study of the relationship between Mg2+, TRPM7 and CFTR. We showed the existence of [Mg2+]I differences according to CFTR mutant expressed in cells. These differences are the result of an altered TRPM7 activation, probably in link with the mutated CFTR’s malfunction. We proved that increasing TRPM7 activity by Naltriben treatment potentiates CFTR-G551D.

PHARMACOLOGIE DU CANAL CFTR : SYNTHESE DE NOUVEAUX COMPOSES ACTIVATEURS DE L'EFFLUX DES IONS CHLORURE.Après la découverte dans notre laboratoire d'une nouvelle réaction entre le méthylglyoxal et les α-aminoazahétérocycles aromatiques, une nouvelle famille de modulateurs de l'activité de la protéine CFTR (« Cystic Fibrosis Transmembrane conductance Regulator ») a été mise en évidence en collaboration avec l'équipe de F. Becq à Poitiers. Les dysfonctionnements de cette protéine transmembranaire résultent de différentes mutations du gène correspondant et sont responsables de plusieurs pathologies dont la mucoviscidose. Les perspectives thérapeutiques de cette maladie grave impliquent l'utilisation et la recherche d'activateurs du canal CFTR.En nous basant sur la structure des composés ayant présenté les meilleurs effets activateurs de la protéine, nous avons conçu et synthétisé une série d'analogues du composé activateur le meilleur mis en évidence précédemment, GPact-11a. Les nouveaux composés préparés sont issus des réactions du méthylglyoxal ou de nouvelles voies de synthèse utilisant des acides aminés. La réactivité de GPact-11a a ensuite été étudiée et exploitée pour préparer des prodrogues potentielles et réaliser la séparation des quatre énantiomères formés lors de la préparation de GPact-11a. Un travail de modélisation des interactions des modulateurs synthétisés avec un modèle de la protéine CFTR construit par homologie de séquences par I. Callebaut, J.-P. Mornon et P. Lehn a également été développé afin de concevoir rationnellement de nouveaux activateurs et de comprendre les effets observés. / PHARMACOLOGY OF CFTR CHANNEL: SYNTHESIS OF NEW ACTIVATORS OF CHLORIDE ION EFFLUX.After the discovery in our laboratory of a new reaction of methylglyoxal with α-aromatic aminoazaheterocycles, a novel family of CFTR modulators (“Cystic Fibrosis Transmembrane conductance Regulator”) has been identified in collaboration with the group of F. Becq in Poitiers. The dysfunctions of this transmembranar protein that result from different genetic mutations lead to several pathologies and among them to the genetic disease Cystic Fibrosis. In the search for more efficient CFTR activators from the structure of the best activator GPact-11a identified previously, a series of GPact-11a analogues was designed and synthesised through reaction of adenine derivatives with methylglyoxal or amino acids. The GPact-11a reactivity was also studied and used for the preparation of potential prodrugs and for the separation of the four enantiomers formed in the reaction leading to GPact-11a. Works were also developed to model the interactions between the synthesised derivatives and a CFTR model built through sequence by I. Callebaut, J.-P. Mornon and P. Lehn in order to design more rationally new activators and understand the biological effects.

L'objectif de cette thèse a été de contribuer à la compréhension des stratégies d'infection du pathogène opportuniste Aspergillus fumigatus. Ce pathogène est une cause émergente de morbidité et de mortalité chez les patients dont l'immunité est compromise et dans les milieux hospitaliers. Une infection avec Aspergillus est en général appelée une Aspergillose et ellepeut se développer dans un certain nombre d'organes, le plus fréquemment dansl'appareil respiratoire (poumons et sinus). Outre les infections (Aspergillosis invasive), la colonisation par ce champignon peut causer des réactions allergiques (Aspergilloses broncho pulmonaire allergique) et de l'asthme. Le nombre de patients immunodéprimés augmente régulièrement à cause des avancées des traitements du SIDA, du cancer, de la mucoviscidose ainsi que par le nombre grandissant de transplantation d'organes. De nouveaux médicaments antifongiques et des médicaments préventifs sont nécessaires pour venir en soutienaux soins médicaux des patients. Bien que plusieurs fongicides existent déjà sur le marché, l'Aspergillosisinvasive reste souvent fatale. Ceci est lié d'une part à la difficulté d'établir le diagnostic, et d'autre part au fait que des résistances émergent rapidement. La motivation de cette thèse est de comprendre les mécanismes impliqués dans le premier contact entre les conidies et le tissu de l'hôte. Ces mécanismes d'adhésion initiaux sont souvent réalisés par des liaisons entre les lectines et les carbohydrates. Le tissu épithélial et la surface muqueuse du système respiratoire sont couverts de structures possédants des carbohydratestels que les glycoprotéines, les glycolipides et les glycosaminoglycanes. L'identification des lectines d'A. fumigatus et leurs caractérisations devraient dorénavant contribuer à la compréhension de la glycostratégie de ce pathogène opportuniste ainsi que des mécanismes impliqués dans l'adhésion et l'infection. L'analyse détaillée de la structure des lectines permettra d'établir le rôle de cesprotéinesdans la virulence et de guider la conception de glycomimétiques, afin d'inhiber le phénomène d'adhésion. Cettenouvelle approche consistant à bloquer l'adhésion de l'agent pathogène plutôt que sa prolifération, vise à diminuer les résistances par une réduction de la pression évolutive. Deuxstratégies différentes ont été utilisées pouridentifier de nouvelleslectines. Tout d'abord une purification des lectinesà partir d'extraits fongiques brutsa été tentée et d'autre part un criblage pour trouver des séquences similaires avec les protéines codées par A. fumigatusa été réalisé parmi une banque de lectines fongiques connues. / The aim of this thesis was to contribute to the understanding of infection strategies of the opportunistic pathogen Aspergillusfumigatus. This pathogenic mould is an emerging cause of morbidity and mortality in immuno-compromised patients and hospital environments. An infection with Aspergillus is generally referred to as Aspergillosis; it can develop in a variety of organs but the most common sites are the respiratory apparatus i.e. lungs and sinuses. Besides infections (invasive aspergillosis), colonization with the fungus can cause allergic reactions (allergic broncho pulmonary aspergillosis) and asthma. The number of immuno-suppressed patients is steadily increasing due to advancement in the HIV, cancer and cystic fibrosis medical care, as well as an increasing number of organ transplantations. Needless to say that new antifungal drugs and preventive medication is desperately needed to support medical care for those patients. Even though several fungicides already exist on the market, invasive aspergillosis remains to be often fatal. On one hand, this is due to difficulties in diagnosis and on the other hand, resistances are emerging rapidly. The motivation behind this thesis is to understand the underlying mechanisms that are involved in the first contact between conidial spores and host tissues. Initial adhesion steps often involve carbohydrate binding proteins, called lectins. They recognize glycoconjugates such as glycoproteins, glycolipids and glycosaminoglycans which cover the epithelial tissue and mucosal surface of the respiratory tract.. Identification and characterization of the lectins from A. fumigatus will therefore contribute to the understanding of the glycostrategy of this opportunistic pathogen and of the mechanisms involved in adhesion and infection. Detailed structural analysis of the carbohydrate-protein interactions will allow ascertaining the lectins role in virulence and guide the design of glycomimetics, as adhesion inhibitors. With this novel approach of targeting the pathogen adhesion rather than its proliferation, resistances are believed to be less frequent due to the lack of evolutionary pressure. In this work, two different strategies were employed to obtain novel lectins. Firstly, lectins were purified from crude fungal extracts and secondly the A. fumigatus genome was screened for encoded proteins showing sequence similarity with known fungal lectins. While lectin purification from the crude extracts was inconclusive due to low lectin activity in the starting material, genome screening showed that several putative lectins were present. One of these lectins, named AFL6, belonged to the cyanovirin-N homolog (CVNH) family and it was recombinantly expressed and purified. Glycan array and micro calorimetry techniques were carried out to investigate its carbohydrate binding specificityand the three dimensional structure was determined using X-ray crystallography. The structure showed an overall similarity with other CVNHs with slight differences in the presumed carbohydrate binding sites. Unlike other family members, it shows a low affinity for mannosides and an apparent affinity for lactosamine containing glycan structures.

La mucoviscidose est une maladie génétique mortelle qui limite ou empêche la production de composés antimicrobiens tels que l’hypothiocyanite (OSCN-) et la lactoferrine. L’objectif de cette étude est de produire un médicament contenant ces deux composés antimicrobiens (10 mL). Cependant l’hypothiocyanite est instable et nécessite une production juste avant administration. Pour cela, une unité de production de médicament portable, destinée à une utilisation par le patient à domicile, est développée avec un appareil réutilisable comprenant le système de pilotage du procédé et une cassette jetable composée par le circuit fluidique et le module membranaire. Le développement du circuit fluidique associé à un module membranaire nécessaire à la purification de l’hypothiocyanite, présent dans le milieu réactionnel, en prenant en compte les contraintes pharmaceutiques, constitue le verrou scientifique et technologique de cette thèse. Au travers de deux géométries membranaires testées, l’étude des paramètres opératoires pour la réalisation de la réaction enzymatique (mécanique des fluides, ultrafiltration, réaction) a permis de mieux appréhender et d’optimiser la production d’hypothiocyanite mais aussi de mettre en évidence les paramètres clés de l’élimination de la glycérine, présente initialement dans les membranes. En parallèle des essais cliniques modifiant les contraintes imposées, l’unité de production et la cassette jetable développées ont permis d’obtenir des résultats proches de ces nouvelles contraintes. / Cystic fibrosis is a fatal genetic disease that limits or prevents antimicrobial compounds such as hypothiocyanite (OSCN-) or lactoferrin. The aim of this study is to produce a drug with those two antimicrobial compounds (10 mL). However hypothiocyanite is unstable and requires production just prior to administration. In order to do so, a portable drug production unit, to be used by the patient at home, is developed. It is made with a reusable device including a control process system and a disposable cassette composed by a fluidic circuit and a membrane module. The scientific and technological challenge of this work is the development of a fluidic circuit incorporating the membrane module for the purification of hypothiocyanite present in a reaction medium while taking into account pharmaceutical constraints. Through two membrane geometries tested, the study of operating parameters to achieve enzymatic reaction (fluid mechanics, ultrafiltration and reaction) allowed to better understand and to optimize the hypothiocyanite production. Furthermore it highlighted the important parameters of the removal of glycerin, initially contained in the membranes. Finally the production unit and the disposable cassette allowed to obtain results close to the specifications. Even though these specifications were redefined and more stringent for clinical trials.