Notre étude est consacrée à la caractérisation des mécanismes d'adaptation métabolique des neutrophiles au cours de l'inflammation et plus particulièrement au cours de leur recrutement dans les voies aériennes des patients atteints de mucoviscidose (cystic fibrosis ou CF en anglais). Dans la mucoviscidose, nous avons précédemment décrit que les neutrophiles présents dans la lumière du poumon sont viables et soumis à une reprogrammation, notamment via l'activation de la voie anabolique mTOR. Ce travail est fondé sur les propriétés spécifiques de ligands solubles dérivés des domaines liant le récepteur (RBD, pour Receptor-Binding Domain) des glycoprotéines d'enveloppes rétrovirales permettant leur utilisation pour la détection de transporteurs métaboliques à la surface des cellules. Dans un premier temps, nous avons validé l'utilisation de ce nouveau groupe de marqueurs pour identifier et caractériser le phénotype métabolique des leucocytes CF obtenus à partir d'échantillons de différents compartiments (sang et expectorât pulmonaire). Dans un deuxième temps, l'étude de l'expression de ces transporteurs métaboliques sur les neutrophiles sanguins de patients atteints de CF ou de polyarthrite rhumatoïde et de sujets contrôles, a permis la distinction de phénotypes métaboliques au niveau systémique selon différents états inflammatoires. Ensuite, nous avons comparé l'expression des transporteurs métaboliques entre les neutrophiles sanguins et pulmonaires de patients CF et révélé une adaptation métabolique de ces cellules lors de leur recrutement vers les poumons. Enfin, les neutrophiles présents dans les voies aériennes des patients CF présentent une modulation de leur activité transcriptionnelle. De façon surprenante, nos travaux démontrent que malgré leur reprogrammation, les neutrophiles recrutés vers les poumons CF sont fonctionnellement compétents, ajoutant ainsi un nouvel angle d'approche dans l'étude des neutrophiles au cours de l'inflammation, notamment dans le cas de la pathologie pulmonaire liée à la mucoviscidose. / The present study focuses on adaptive metabolic steps adopted by neutrophils during inflammation, particularly during their recruitment into the cystic fibrosis (CF) airways. In CF, we previously described that airway neutrophils are alive and undergo reprogramming, featuring notably the activation of the anabolic mTOR pathway. The present work is based on specific properties of soluble ligands derived from the receptor-binding domains (RBD) of retroviral glycoprotein envelopes, which can be used for the detection of metabolite transporters at the cell surface. First, we validated the use of this new set of markers for the identification and characterization of the metabolic phenotype of CF leukocytes obtained from distinct compartments (blood and sputum). Second, by studying the metabolite transporter expression on blood neutrophils from CF or rheumatoid arthritis patients and control subjects, we distinguished metabolic phenotypes characteristic of specific inflammatory states. Then, we compared metabolite transporter expression between CF blood and airway neutrophils and showed that neutrophils undergo significant metabolic adaptation upon recruitment into the lungs. Finally, we demonstrated that CF airway neutrophils display significant transcriptional modulation and that despite their metabolic reprogramming, they remain functionally competent, thus adding an additional angle of approach to neutrophil studies with regard to inflammation, notably during CF airway disease.

Certains enfants souffrant de maladies bronchopulmonaires et de maladies neuromusculaires présentent lors de l'évaluation de la force des muscles respiratoires des valeurs anormales et évaluent mal leur état dyspnéique. Le peu de gène respiratoire ressenti par ces patients permet d'émettre l'hypothèse qu'une anomalie de l'intégration corticale des afférences somesthésiques d'origines respiratoires serait responsable. Une nouvelle technique d'exploration neurophysiologique, les potentiels évoqués respiratoires (PER) provoqués par l'occlusion des voies aériennes permet d'investiguer cette voie.Des manoeuvres volitionnelles d'évaluation de la force des muscles respiratoires (Sniffs et SNIP) et non volitionnels (stimulation magnétique) ainsi que les PER ont été enregistrés chez des enfants sains et atteints de pathologies respiratoires et neuromusculaires.Les valeurs de force des muscles respiratoires enregistrées dans les différents groupes étaient semblables. Les composantes des PER enregistrées au sommet de la pariétale ascendante (C3-Cz ; C4-Cz) ont toutes été retrouvées chez les enfants sains et les enfants malades. Seules N1 et P2 ont été plus souvent recueillies chez les patients atteints de maladies neuromusculaires que chez les enfants souffrant de pathologies bronchopulmonaires (p < 0,005).Ces études ont montré que la force des muscles respiratoires peut être évaluée par différentes manœuvres chez les enfants atteints de maladies pulmonaires chroniques et de maladies neuromusculaires et que ces enfants présentent des altérations des PER. / Some children with chronic lung and neuromuscular diseases showed abnormal values of respiratory muscle strength and misjudge their dyspneic state. These breathing difficulties allow us to hypothesize an abnormal integration of cortical somatosensory afferents. A new neurophysiological approach, Respiratory Related Evoked Potentials (RREPs) caused by upper airways occlusion allows to investigate this pathway.Volitional manoeuvres assessment of the strength of respiratory muscles (Sniff and SNIP) and non-volitional (Magnetic stimulation) and RREPs were recorded in healthy and children suffering from respiratory and neuromuscular diseases.Respiratory muscle strength values recorded in different groups by these techniques were similar. The components of RREPs recorded at C3-Cz and C4-Cz have all been found in healthy children and patients. Only N1 and P2 were more often collected from patients with neuromuscular diseases than in children with lung disease (p <0.005).These studies have shown that muscle strength breathing can be assessed by different manoeuvres in children with chronic lung diseases, neuromuscular diseases and thatChildren show alterations of RREPs.

La mucoviscidose est une maladie génétique autosomique causée par une mutation dans le gène CFTR (Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator). Mon travail s’est décomposé en deux parties principales : d’une part j’ai réalisé une revue de la littérature sur l’analyse des génomes bactériens isolés de patients mucoviscidosiques comparativement aux génomes des mêmes espèces isolées dans d’autrescontextes et d’autre part j’ai analysé les génomes de trois espèces bactériennes (Microbacterium yannicii, Chryseobacterium oranimense et Haemophilus parahaemolyticus). L’analyse exhaustive des génomes bactériens issus de patients atteints de mucoviscidose a révélé une extraordinaire évolution de ces génomes en fonction du temps et des traitements reçus par ces patients qui témoigne de la capacité qu’ont ces bactéries à s’adapter à leur écosystème notamment par l’acquisition de nouveaux gènes par transfert latéral de gènes. Ce travail montre l’extraordinaire plasticité des génomes bactériens dans un milieu donné et à ce titre le poumon de patients atteints de mucoviscidose représente un modèle unique pour comprendre l’évolution des génomes bactériens. De plus, notre travail a permis d’identifier leurs mécanismes moléculaires de résistance aux antibiotiques. Les travaux à venir sur l’étude des métagénomes de prélèvements chez ces patients pourrait permettre de répondre à ces questions dans le futur. La découverte de nouvelles espèces et / ou émergentes va nous permettre d’avoir une image plus complète de la mucoviscidose qui pourrait conduire à une meilleure connaissance de la maladie et donc à une meilleure prise en charge thérapeutique. / Cystic fibrosis is an autosomal genetic disorder caused by a mutation in the CFTR (Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator) gene. Pulmonary infection is the major problem faced by patients with cystic fibrosis. My work is divided into two main parts: first I made a review of the literature on the analysis of bacterial genomes isolated from CF patients compared to the genomes of the same species isolated in autrescontextes and other part I analyzed the genomes of three species of bacteria (Microbacterium yannicii, Chryseobacterium oranimense and Haemophilus parahaemolyticus). The comprehensive analysis of bacterial genomes from cystic fibrosis patients revealed an extraordinary evolution of these genomes with time and treatment received by these patients reflects the ability of these bacteria to adapt to their particular ecosystem the acquisition of new genes by lateral gene transfer. This work shows the extraordinary plasticity of bacterial genomes in a given environment and as the lungs of patients with cystic fibrosis represents a unique model for understanding the evolution of bacterial genomes. In addition, our work has identified their molecular mechanisms of resistance to antibiotics. Future work on the study of metagenomes sampling in these patients could help to answer these questions in the future. The discovery of new species and / or emerging will allow us to have a more complete picture of cystic fibrosis which could lead to a better understanding of the disease and thus a better therapeutic management.

Contexte : Les maladies pulmonaires comme l'asthme ou la mucoviscidose représentent des problèmes majeurs de santé publique. Elles se manifestent par une inflammation chronique avec une production accrue de cytokines pro-inflammatoires et à terme une dégradation de la fonction respiratoire. Les efforts thérapeutiques tentent, d'un côté, de contrôler la réaction inflammatoire et aussi d'améliorer la biodisponibilité médicamenteuse. Objectif : Notre objectif est d'explorer l'implication des phospholipases dans l'inflammation et le rôle des transporteurs peptidiques dans le transport des antibiotiques dans la mucoviscidose. Nous avons aussi cherché à comprendre l'effet d'une supplémentation en cobalamine sur l'efficacité de la dexaméthasone dans un contexte inflammatoire. Méthodes : Des techniques immunologiques, électrophorétiques, de culture cellulaire, d'immunoprécipitation et d'expression génique sont utilisées sur des lignées bronchiques humaines normales ou mucoviscidosiques. Résultats : 1) La PC-PLC est constitutivement suractivée dans les cellules mucoviscidosiques et conduit à une surproduction d'arachidonate, à une surexpression de Cox-2, une surproduction de PGE2, une surexpression d'interleukine-8, et au défaut de régulation beta-adrénergique de la sécrétion. L'inhibition de cette enzyme par le D609 permet de corriger tous ces défauts. 2) L'activité du transporteur peptidique, impliquée dans le transport d'antibiotiques, PEPT2, a été caractérisée dans les cellules bronchiques normales (Vm = 115 pmol/106 cellules/min ; Km = 15µM). Ce transporteur n'est pas influencé par un contexte inflammatoire. Ce transporteur est inactif dans les cellules CF. 3) La cobalamine potentialise l'effet de la déxaméthasone sur la sécrétion et l'expression des cytokines pro-inflammatoires induite par le TNFa et l'histamine. Conclusions/perspectives : Cette étude devrait permettre 1) de mettre en lumière l'importance de la PC-PLC comme cible pharmacologique potentielle dans la mucoviscidose. 2) de comprendre la relative faible efficacité de l'antibiothérapie dans cette maladie et 3) de mettre en évidence une possible participation du cycle de la méthionine dans le processus inflammatoire / Background: Lung diseases such as asthma or cystic fibrosis are major public health problems. They are manifested by chronic inflammation with increased production of proinflammatory cytokines leading to respiratory failure. Current therapeutic is aimed at controling the inflammatory response and also at improving drug bioavailability. Objective: The objective is to explore the involvement of phospholipases in inflammation and the role of peptide transporters in the transport of antibiotics in cystic fibrosis. We also sought to understand the effect of cobalamin supplementation on the effectiveness of dexamethasone in an inflammatory context. Methods: immunological techniques, electrophoresis, cell culture, immunoprecipitation and gene expression are used on normal or cystic fibrosis human bronchial cell lines. Results : 1) PC-PLC is constitutively overactivated in cystic fibrosis cells and leads to overproduction of arachidonate, to overexpression of Cox-2 , an overproduction of PGE2 , an interleukin -8 overexpression , and to alteration of beta-adrenergic secretion. Inhibition of this enzyme by D609 corrects these defects. 2) The activity of the dipeptide carrier involved in the transport of antibiotics, PEPT2, was characterized in normal bronchial cells (Vm = 115 pmol/106 cells / min, Km = 15µM). This transporter is not affected by an inflammatory context. However, it was shown to be inactive in CF cells. 3) Cobalamin potentiates the effect of dexamethasone on the expression and secretion of pro-inflammatory cytokines induced by TNFa and histamine. Conclusions : This study should help 1) to highlight the importance of PC-PLC as a potential pharmacological target in cystic fibrosis. 2) to understand the relative ineffectiveness of antibiotics in this disease , and 3) to highlight a possible involvement of methionine cycle in the inflammatory process

Mycobacterium abscessus est une mycobactérie responsable principalement d’infections pulmonaires, en particulier chez les patients atteints de mucoviscidose ou de dilatation des bronches. M. abscessus est naturellement résistante aux antituberculeux, laissant peu d’options thérapeutiques. Le traitement de référence associait classiquement un aminoside, un macrolide (clarithromycine) et une β-lactamine (céfoxitine ou imipénème), avec un taux de succès d’environ 50 %. Cependant, des souches résistantes à la clarithromycine sont fréquemment isolées, remettant en cause l’utilisation de cet antibiotique. M. abscessus produit naturellement une β-lactamase à large spectre (BlaMab) mais les mécanismes d’action des β-lactamines n’ont pas été étudiés chez cette espèce, ce qui constitue une entrave à l’optimisation des traitements par cette classe d’antibiotiques. Le premier objectif était d’identifier et de caractériser les cibles des β-lactamines chez cette espèce. Inhibant la dernière étape de polymérisation du peptidoglycane, les cibles potentielles des β-lactamines sont trois familles d’enzymes : les D,D-transpeptidases et les D,D­carboxypeptidases appartenant à la famille des protéines de liaison à la pénicilline (PLP), ainsi que les L,D-transpeptidases qui sont majoritairement responsables de cette dernière étape chez cette espèce. Pour identifier les cibles, des mutants résistants aux β-lactamines ont été sélectionnés à partir de la souche de référence M. abscessus CIP104536 et d’un dérivé portant une délétion du gène blaMab (∆blaMab). Pour les deux souches, l’émergence de la résistance aux β-lactamines a requis de multiples étapes, ce qui constitue un atout pour leur utilisation thérapeutique. Pour les mutants obtenus à partir de la souche CIP104536, les analyses phénotypiques ont montré que la résistance aux β-lactamines n'est pas due à une augmentation de l’efficacité catalytique de BlaMab, à une surproduction de cette enzyme, ou à une diminution de la perméabilité. Le séquençage des génomes de mutants résistants n’a pas révélé de mutations dans les gènes codant pour les L,D-transpeptidases, mais des mutations ont été trouvées dans des gènes codant pour deux PLP. D’autres mutations se situent dans des gènes codant en particulier pour des protéines non caractérisées. L’acquisition de la résistance pourrait donc dépendre de mutations affectant des facteurs essentiels à l’activité des cibles des β­lactamines. Le deuxième objectif était d’étudier et de comparer l’activité in vitro des β-lactamines sur M. abscessus. Des expériences de bactéricidie et d’activité intracellulaire chez le macrophage infecté ont été effectuées pour les souches CIP104536 et ∆blaMab. Parmi les antibiotiques étudiés (amikacine, céfoxitine, imipénème, ceftaroline, et amoxicilline), l’imipénème est le plus efficace sur les deux souches. Sur la souche ∆blaMab, l’association d’imipénème et d’amikacine est bactéricide. En l’absence de BlaMab, l’amoxicilline est aussi efficace que l’imipénème. L’avibactam augmente l’activité de la ceftaroline mais l’inhibition de BlaMab est seulement partielle en intracellulaire. Les résultats obtenus in vitro montrent que l’imipénème est supérieur à la céfoxitine pour des concentrations atteignables dans le sérum. L’inhibition de BlaMab pourrait augmenter l’efficacité de l’imipénème et d’autres composés utilisés pour traiter les infections pulmonaires à M. abscessus. / Mycobacterium abscessus is an important pathogen responsible for pulmonary infections in cystic fibrosis patients or in patients suffering from bronchiectasis. The treatment of infections due to M. abscessus is complicated since this bacterium is naturally resistant to the anti­tuberculous agents. The recommended treatment includes an aminoglycoside, a macrolide (clarithromycin) and a β-lactam (cefoxitin or imipenem), with a success rate of about 50 %. However, strains resistant to clarithromycin are frequently isolated, questioning the use of this antibiotic. M. abscessus naturally produces a broad spectrum β-lactamase (BlaMab) but the mechanisms of action of the β-lactams have not been studied in this species, impairing the optimization of the treatment by these antibiotics. The first objective was to identify and characterize the targets of β-lactams antibiotics in this species. Inhibiting the final stage of the peptidoglycan polymerization, the potential targets of β-lactams are three families of enzymes: the D,D-transpeptidases and D,D­carboxypeptidases belonging to the family of penicillin-binding proteins (PBP), and the L,D-transpeptidases which are mainly responsible for this final stage in this species. To identify the targets, mutants resistant to β-lactams have been selected from the reference strain M. abscessus CIP104536 and from its β-lactamase-deficient derivative ΔblaMab. For both strains, the emergence of resistance to β­lactams has required multiple steps, which is an advantage for the therapeutic use of these antibiotics. For the mutants derived from the strain CIP104536, phenotypic analyzes showed that the resistance to β-lactams is not due to an increase in the catalytic efficiency of BlaMab, to an overproduction of this enzyme, or to a decrease in permeability. Genomes sequencing of the resistant mutants did not reveal mutations in the genes encoding the L,D-transpeptidases, but mutations have been found in genes encoding two PBPs. Other mutations have been detected in genes encoding uncharacterized proteins. Acquisition of resistance could therefore depend on mutations affecting key factors essential for the activity of β-lactams targets. The second objective was to study and compare the in vitro activities of β-lactams against M. abscessus. Bactericidal experiments and intracellular activity in the infected macrophage were performed for the strains CIP104536 and ΔblaMab. Among the antibiotics tested (amikacin, cefoxitin, imipenem, ceftaroline, and amoxicillin), imipenem is the most effective agent against the two strains. Combination of imipenem and amikacin was bactericidal against the ΔblaMab mutant. In the absence of BlaMab, amoxicillin was as active as imipenem. Avibactam increased the intracellular activity of ceftaroline but inhibition of BlaMab was only partial intracellularly. Evaluation of the killing and intracellular activities of β-lactams indicates that imipenem is superior to cefoxitin at clinically achievable drug concentrations. Inhibition of BlaMab could improve the efficacy of imipenem and extend the spectrum of drug potentially useful to treat pulmonary infections.

La mucoviscidose est une maladie monogénique, caractérisée par des mutations survenant au niveau du gène CFTR (Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator). Le clonage en 1989 du gène CFTR a permis d’envisager de traiter cette maladie par thérapie génique. Cela consiste à transférer à l’aide d’un vecteur, une version normale du gène CFTR dans les cellules atteintes des patients. En raison de la gravité des complications pulmonaires, c’est l’épithélium respiratoire qui constitue aujourd’hui le tissu cible pour le transfert de gènes. Le principe de la thérapie génique est évidemment très séduisant et un certain nombre d’essais cliniques ont d’ores et déjà été réalisés. La thérapie génique nécessite des outils de vectorisation efficaces et compatibles avec une utilisation répétée en clinique.Mon sujet de thèse a porté donc sur le développement, la biodistribution et l’optimisation de vecteurs synthétiques (lipides cationiques) pour le transfert de gènes dans l’épithélium respiratoire. Au cours de mes travaux, nous avons donc pu mettre au point des lipophosphoramidates KLN47 fluorescents utiles pour les études de biodistribution in vivo. Comparés au KLN47 non fluorescent, ces nouveaux composés présentent les mêmes propriétés physicochimiques, à savoir une taille relativement petite et un potentiel zêta positif. Sur lignées cellulaires, nous avons montré que les nouvelles formulations étaient aussi efficaces que le KLN47, et pas ou peu toxiques. Ensuite, sur modèle animal, les profils de biodistribution de lipoplexes pégylés et non-pégylés ont été comparés après injection systémique. Les profils de biodistribution des lipoplexes pégylés et non-pégylés étaient similaires, cependant, la pégylation des complexes a conduit à une circulation prolongée dans la circulation sanguine, alors que l’expression du transgène (luciférase) était équivalente dans les deux cas. De plus, l’activité luciférase était similaire à celle obtenue avec le KLN47 non fluorescent. Nous avons ainsi démontré que l’ajout des sondes lipidiques fluorescentes dans la solution liposomale du KLN47, ne modifie pas ses propriétés physicochimiques et transfectantes. L’ensemble des résultats montre que nous disposons d’outils prometteurs pour les études de biodistribution in vivo. D’autres molécules ont également été testées avec succès. / Cystic fibrosis is a monogenic disease characterized by mutations occurring at the CFTR (Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator) gene. The clonining in 1989 of the CFTR gene has enabled to consider treating this disease by gene therapy. This consists of transferring a normal version of the CFTR gene in the affected patients’ cells, using a vector. Due to the severity of pulmonary complications, it is obvious that the respiratory epithelium constitutes the target tissue for the gene transfer. The principle of gene therapy is indeed very attractive and a number of clinical trials have already been made. Gene therapy requires vectorization tools that are efficient and compatible with repeated clinical use.My thesis has focused on the development, biodistribution and optimization of synthetic vectors (cationic lipids) for gene transfer in the respiratory epithelium. During my work, we were able to develop useful fluorescent KLN47 lipophosphoramidates for in vivo biodistribution studies. Compared to non fluorescent KLN47, these new compounds exhibit the same physicochemical properties: a relatively small size and a positive zeta potential. On cell lines, we found that the new formulations were as effective as the KLN47, with little or no toxicity. Then, in animal models, the biodistribution profiles of pegylated and non-pegylated lipoplexes were compared after systemic injection. The biodistribution profiles of pegylated and non-pegylated lipoplexes were similar. However, the pegylation of the complex resulted in prolonged circulation in the bloodstream, whereas transgene expression (luciferase) was equivalent in both cases. In addition, luciferase activity was similar to that obtained with the non-fluorescent KLN47. We have demonstrated that the addition of fluorescent lipid probes in the liposomal solution KLN47, does not change its physicochemical and transfectant properties. The overall results show that we have promising tools for in vivo biodistribution studies. Other molecules have also been tested successfully.

Notre génome contient des centaines de milliers de variants génétiques, qui pour la plupart, n’ont aucun impact sur notre santé. Après séquençage, il faut les filtrer pour ne conserver que ceux qui sont potentiellement impliquées dans une maladie. On utilise des annotateurs qui prédisent l’impact des variants. Ces prédictions sont faites sans tenir compte des variants en cis dans le même gène. Pourtant, des variants neutres peuvent, lorsqu’ils sont réunis chez un individu, devenir délétères. J’ai donc développé l’outil bioinformatique GEMPROT qui permet de visualiser l’effet des variants génétiques sur la séquence protéique et de mettre en évidence les combinaisons de variants touchant un même domaine fonctionnel.J’ai ensuite étudié l’impact de deux variants associés à la p.Phe508del (508del) sur la protéine CFTR.Le variant p.Val470M est présent sur tous les haplotypes portant la délétion mais pas sur la séquence de référence, qui est généralement utilisée pour la construction de plasmides. Nous avons montré des différences de fonction de la protéine CFTR selon l’acide aminé en position 470. La fonction est augmentée avec une Valine et il convient donc de s’assurer, lors de la construction de plasmides, que le contexte haplotypique des variants étudiés est bien respecté. Le variant p.Ile1027Thr conduit à une dégradation de la fonction de la protéine 508del.Ce variant n’est présent que sur une partie des haplotypes 508del et pourrait donc avoir un effet modificateur de l’expression de la délétion. En conclusion, nous montrons l’importance de la prise en compte des contextes haplotypiques dans l’étude des maladies et proposons un outil bioinformatique pour le faire. / We all carry hundreds of thousands genetic variations in our genome that, for the most of them, have no impact on our health. After sequencing, they must be filtered to only retain those potentially involved in a disease. We use annotators that predict the impact of variants.These predictions are done for each variant taken independently without considering cis variants in the same gene. However, neutral variants can become deleterious when associated together. I have developed the bioinformatics tool GEMPROT, which makes it possible to visualize the effect of genetic variants on the protein sequence and to highlight combinations of variants affecting the same functional domain.I then studied the impact of two variants associated with p.Phe508del (508del) on CFTR protein function.The variant p.Val470M is present on all carrying deletion haplotypes but not on the reference sequence, which is generally used for the construction of plasmids. We have shown differences in the function of the mutated CFTR protein 508del according to the amino acid at position 470. The function is increased with a Valine and it is therefore necessary to ensure, when constructing plasmids, that the haplotype context of the studied variants is well respected.The variant p.Ile1027Thr leads to a degradation of the function of the 508del protein. This variant is present only on a portion of the 508del haplotypes and could therefore have a modifying effect on deletion expression. In conclusion, we show the importance of considering haplotype contexts in the diseases studies and propose a bioinformatics tool to do so.

L'étude des courbes débit/volume d'exercice permet d'étudier la réponse ventilatoire d'un sujet et d'apporter des informations sur l'origine et la sévérité des contraintes mécaniques ventilatoires potentiellement observées au cours de l'exercice. Très peu d'études se sont focalisées sur l'effet d'un exercice sur l'adaptation de la réponse ventilatoire chez l'enfant prépubère à l'aide de cette méthodologie. Or, les caractéristiques du système pulmonaire de l'enfant pourraient induire une adaptation de la réponse ventilatoire à l'exercice spécifique chez l'enfant prépubère par rapport à l'adulte. De plus, l'exposition à une pathologie respiratoire chronique telle que la mucoviscidose pourrait accentuer la spécificité de la réponse ventilatoire à l'exercice chez l'enfant prépubère. Le premier objectif de ce travail de thèse a été d'étudier l'adaptation de la réponse ventilatoire lors d'un exercice incrémental chez des enfants sains et des enfants atteints de mucoviscidose. Nos résultats ont confirmé l'existence d'une spécificité de la réponse ventilatoire chez l'enfant prépubère et l'apparition de contraintes mécaniques ventilatoires lors de l'exercice incrémental, la mucoviscidose n'ayant pas d'effets sur l'adaptation de la réponse ventilatoire à ce type d'exercice. Toutefois, l'exercice incrémental n'est pas représentatif du type d'activité physique réalisé quotidiennement par les enfants. Aussi, le second objectif de ce travail était d'analyser l'effet de la modalité d'exercice: continue vs. intermittente, sur l'adaptation de la réponse ventilatoire. Ceci s'est traduit dans un premier temps par la recherche de correspondances entre les intensités d'exercices continus et intermittents afin de proposer des intensités d'exercices induisant des réponses cardiorespiratoires similaires entre les deux modalités d'exercice. Dans un second temps, nos résultats ont montré l'existence de contraintes mécaniques ventilatoires pour les deux modalités d'exercice, quelque soit l'intensité d'exercice, sans toutefois induire de fatigue des muscles respiratoires. Toutefois, la modalité d'exercice n'aurait aucune influence sur la sévérité de ces contraintes. De plus, comme pour l'exercice incrémental, la présence d'une pathologie respiratoire chronique légère n'influencerait pas l'adaptation de la réponse ventilatoire lors d'exercices continus et intermittents. Les enfants sains ou atteints de mucoviscidose présentent une régulation de la ventilation réalisée de manière prédominante par une augmentation de la fréquence respiratoire.

La pyocyanine (PYO) est une phénazine de couleur bleu-vert, produite spécifiquement par la bactérie pathogène opportuniste Pseudomonas aeruginosa (Pa). La toxicité aérobie de la PYO envers les cellules de mammifères, les levures et les bactéries a été décrite de longue date, mais la compréhension des mécanismes d'action est encore lacunaire, en particulier en conditions de limitation en O2 (conditions rencontrées dans le contexte infectieux). De plus, il a récemment été montré que la PYO peut apporter des effets bénéfiques pour la souche productrice en hypoxie. Au cours de ce travail, nous avons réexaminé les effets de la PYO sur un large panel de bactéries dont son propre producteur (Pa) ainsi que sur un modèle cellulaire eucaryote Saccharomyces cerevisiae exposées à différentes tensions en O2. Nos données suggèrent que la toxicité aérobie de la PYO envers S. cerevisiae est multifactorielle, impliquant à la fois une interaction avec le complexe III de la chaîne respiratoire et l'induction d'un stress oxydatif. Pour la première fois, nous avons mis en évidence une toxicité de la PYO exacerbée en anaérobiose chez un eucaryote (S. cerevisiae). Le mécanisme d'action impliquerait le PYO radical. Nous avons également montré que la PYO peut inhiber la croissance aérobie et anaérobie des microorganismes concurrents, plus particulièrement S. aureus en bloquant le complexe III de la chaîne respiratoire. A l'inverse, la PYO peut stimuler la respiration de Pa surtout dans les conditions mimant le contexte infectieux (hypoxie, vie ralentie). Le complexe III et/ou les oxydases terminales cbb3 serait impliqué favorablement. En conclusion, la PYO jouerait à la fois un rôle de poison hypoxique mais aussi un rôle de navette redox bénéfique pour la survie et la virulence de Pa en hypoxie.

70% des mutations identifiées sur le gène responsable de la mucoviscidose correspondent à la délétion de la phénylalanine en position 508 du domaine NBD1 de la protéine CFTR. Cette mutation est responsable, à 37°C, d'un mauvais repliement, du blocage et de la dégradation rapide de CFTR au niveau du réticulum endoplasmique (RE). Plusieurs études ont montré que CFTR-F508del est dégradée au niveau du cytoplasme par le protéasome après translocation à travers le canal Sec61. Cependant cette dégradation n'est pas affectée par l'ATP et n'est inhibée que partiellement par les inhibiteurs les plus spécifiques du protéasome. Par ailleurs, une série d'observations a suggéré que la dégradation de CFTR-F508del est un processus impliquant d'autres voies protéolytiques dont la nature reste encore inconnue.<br />Au cours de mon doctorat, j'ai essayé de caractériser ces voies de dégradation en approfondissant le rôle de l'ATP et du protéasome et surtout en mettant en évidence l'implication de voies dépendantes du GTP. Mon travail a été réalisé en deux étapes. La première a porté sur l'étude de la dégradation de CFTR mutée au niveau microsomale, et la deuxième sur la caractérisation de cette voie au niveau cellulaire. L'ensemble des résultats montre, pour la première fois, qu'il n'y a pas de corrélation entre l'activité protéasomale et la dégradation de CFTR-F508del au niveau du RE. Cette dernière est dégradée par une voie GTP-dépendante impliquant les protéines G hétérotrimériques et localisée au niveau du RE.