Les histidine kinases (HKs) représentent une vaste famille de protéines impliquées dans la perception des signaux environnementaux chez les bactéries, les champignons et les plantes. Ces protéines joueraient notamment un rôle majeur dans l’adaptation aux stresses, mais aussi dans la virulence de nombreux micro-organismes procaryotes et eucaryotes. Si les HKs sont à présent bien connues chez les bactéries et les plantes, tant sur un plan structural que fonctionnel, les connaissances concernant ces protéines chez les autres clades de l’arbre du vivant demeurent plus que fragmentaires. C’est ainsi que le premier objectif de ce travail a consisté en l’exploration in silico de la structure et de la distribution des HKs chez les organismes eucaryotes dans le cadre de plusieurs études bioinformatiques : i) chez les champignons inférieurs, ii)chez les levures bourgeonnantes et enfin iii) à travers l’ensemble des super-groupes eucaryotes. Les HKs n’étant pas retrouvées chez les mammifères, elles suscitent depuis quelques années une attention particulière de la communauté scientifique en tant que nouvelles cibles pour le développement d’antimicrobiens. C’est précisément dans ce contexte que la partie expérimentale de ce projet a été initiée au sein du GEIHP. Cette équipe porte en effet ses efforts sur le filamenteux multi-résistant Scedosporium apiospermum qui se situe au second rang parmi les moisissures capables de coloniser chroniquement les poumons des patients atteints de mucoviscidose. Ainsi, dans l’optique d’identifier de nouvelles cibles thérapeutiques du champignon, la seconde partie de ce projet s’est focalisée sur la caractérisation fonctionnelle des HKs chez Scedosporium apiospermum. En parallèle, cette étude nous a également amenés à développer de nouveaux outils moléculaires adaptés à S.apiospermum en vue de futures études d’imageries de fluorescence et de bioluminescence. / Histidine kinases (HKs) represent a broad family of proteins involved in the perception of environmental signals in bacteria, fungi and plants.These proteins play a major role in stress adaptation, but also in the virulence of many prokaryotic and eukaryotic microorganisms. Although HKs are now well known in bacteria and plants, both structurally and functionally, knowledge about these proteins in other clades of the living tree remains more than fragmentary. Thus the first objective of this work was the in silico exploration of the structure and distribution of HKs in eukaryotic organisms through several bioinformatics studies : i) in the lower fungi, ii)in budding yeasts, and finally iii) across all eukaryotic supergroups. Since HKs are not found in mammals, they have been attracting attention in recent years from the scientific community as new targets for the development of antimicrobials. It is precisely in this context that the experimental part of this project was initiated in the GHEIHP. This team is focusing on the multi-resistant filamentous Scedosporiumapiospermum, which ranks second among the molds capable of chronycally conolizing the lungs of cysticfibrosis patients. Thus, in order to identify new therapeutic targets of the fungus, the second part of this project focused on the functional characterization of HKs in S. apiospermum. In parallel, this study also led us to develop new molecular tools adapted to S. apiospermum for future studies of fluorescence or bioluminescence imaging.

Chez les patients mucoviscidosiques (CF), l'épithélium des voies aériennes est souvent lésé et remodelé. Que le remodelage soit lié à l'infection et/ou l'inflammation inhérentes à la pathologie ou à un processus de régénération dérégulée reste à déterminer. Le premier objectif de cette thèse a été de déterminer le rôle de l'inflammation dans le remodelage et la régénération de l'épithélium bronchique CF. Grâce à un modèle in vitro de culture en interface air-liquide, nous avons montré qu'en absence d'infection et d'inflammation exogènes, la régénération épithéliale CF est anormale et retardée, et que l'épithélium régénéré est remodelé, en comparaison d'un épithélium régénéré non-CF. En outre, en générant une inflammation chronique dans les cultures CF et non-CF, nous avons pu attribuer un rôle pour l'inflammation endogène (mémoire inflammatoire) des cellules CF dans l'augmentation de la hauteur épithéliale et dans le développement de l'hyperplasie des cellules basales, un rôle essentiel de l'inflammation exogène dans le développement de l'hyperplasie des cellules mucipares, et l'absence d'influence de l'inflammation dans le retard de différenciation des cellules ciliées épithéliales CF. Le second objectif de cette thèse a été d’identifier une molécule susceptible d’être anti-remodelage et/ou pro-régénératrice. Les résultats obtenus montrent qu’une molécule issue des agro-ressources régionales régule l'augmentation de la hauteur épithéliale et l'hyperplasie des cellules basales et sécrétoires, favorise la différenciation des cellules ciliées, et réduit l'inflammation et de synthèse de la mucine MUC-5AC, tant dans les cultures CF quand dans les cultures non-CF soumises à une inflammation chronique. Enfin, la molécule restaure la sécrétion des ions chlorure CFTR-dépendante dans les cultures CF. Cette molécule semble donc être un candidat médicament prometteur pour le traitement de la CF. / The airway epithelium of cystic fibrosis (CF) patients is frequently injured and remodeled. Whether these alterations are related to infection and/or inflammation or to a dysregulated regeneration process remains to be elucidated. The first objective of this study was to determine the involvement of inflammation in remodeling and regeneration of the CF airway epithelium. Using an in vitro model of airway epithelial cell culture at the air-liquid interface, we demonstrated that, in absence of exogenous infection and inflammation, the CF airway epithelium regeneration was abnormal, delayed, and led to the reconstitution of a remodeled epithelium, in comparison to a non-CF regenerated airway epithelium. Moreover, by inducing a chronic inflammation in non-CF and CF cultures, we were able to attribute a role of the endogenous inflammation of CF cells (inflammatory memory) in the airway epithelium height increase as well as in the basal cell hyperplasia development, an essential involvement of exogenous inflammation in the development of goblet cell hyperplasia, and the absence of implication of inflammation in the ciliated cell differentiation delay. The second objective of this study was to identify an anti-remodeling and/or pro-regenerative molecule. The results we obtained showed that a molecule derived agro-resources regulated the increase in the airway epithelium height as well as the basal and goblet cell hyperplasia development, favored the ciliated cell differentiation, decreased the inflammation and the production of the MUC5-AC mucin, in the CF cultures an in the chronically inflamed non-CF cultures. Finally, this molecule restored chloride secretion through CFTR in CF cultures. In conclusion, the chosen molecule seems to be a promising therapeutics for cystic fibrosis.

La mucoviscidose est la maladie génétique récessive la plus fréquente dans les populations caucasiennes. Elle est dûe à des mutations dans le gène CFTR qui code pour une protéine qui a une fonction canal chlorure et qui est exprimée au pôle apical des épithéliums sécrétoires. La mutation la plus fréquente F508del altère le repliement de la protéine, induisant sa dégradation précoce par le protéasome et son absence à la membrane plasmique. La recherche fondamentale se focalise sur la protéine mutée et cherche à découvrir des molécules capables d’adresser celle-ci au pôle apical des cellules épithéliales où elle pourra remplir sa fonction de canal chlorure. Au sein du laboratoire, nous nous intéressons aux interactions de la protéine CFTR/ F508del-CFTR avec d’autres protéines. Nous avons déjà montré l’existence d’une interaction non voulue entre F508del-CFTR et un filament intermédiaire, la cytokératine 8. En combinant une approche in-silico et du criblage haut débit, nous avons identifié des molécules capables d’interrompre ces interactions. Des tests fonctionnels sur des lignées cellulaires ainsi que sur des modèles murins ont montré une restauration de la fonction canal chlorure après traitements avec ces molécules. Au cours de ma thèse, je me suis intéressée à l’une d’entre elles qui est la molécule « c407 ». L’objectif de ma thèse était de comprendre les mécanismes d’action de cette molécule. J’ai également évalué l’efficacité des traitements actuels dans le contexte des allèles complexes de F508del-CFTR. Dans une seconde partie de ma thèse, j’ai étudié l’effet d’une cytokine (TNFα) sur la protéine mutée F508del-CFTR. De façon inattendue, j’ai observé que le TNFα, à des concentrations physiologiques, corrige le défaut de routage de la protéine F508del-CFTR. Cette observation pourrait expliquer une fonction résiduelle de la F508del-CFTR chez certains patients atteints de mucoviscidose. En conclusion, mes travaux ont permis de préciser les mécanismes d’action d’un correcteur et de découvrir un effet inattendu d’une cytokine pro-inflammatoire. Ces travaux permettent de relier la correction d’un défaut de routage au processus inflammatoire ouvrant ainsi un nouveau champ d’investigation. / Cystic fibrosis is due to the loss of epithelial chloride transport caused by mutations in the CFTR gene, the most frequent mutation being F508del. One of the strategies developed to find new treatment for Cystic fibrosis (CF) is to discover compounds that correct the trafficking of F508del-CFTR to the plasma membrane. Using hypothesis-driven approach and combining modeling of NBD1, molecular docking and functional assays, we identified 4 compounds that correct F508del-CFTR function in cells (including human primary bronchial cells in culture) and F508del mice. New correctors probably act by interrupting the interaction between F508del-CFTR with keratin 8 (Odolczyk et al EMBO Mol Med 2013). During my PhD, I focused on one of those molecules, the "c407" molecule. The aim of my thesis was to investigate the mechanisms of action of this molecule. I have also evaluated the effectiveness of current treatments in the context of complex alleles F508del-CFTR. In the second part of my thesis, I studied the effect of a cytokine (TNFα) on the protein F508del-CFTR. Unexpectedly, I observed that the TNFα at physiological concentrations, corrects the trafficking of F508del-CFTR protein. This observation could explain a residual function of F508del-CFTR in some CF patients. In conclusion, my thesis helped to clarify the mechanisms of action of new correctors of F508del-CFTR.

Un biomarqueur est une molécule (ou un ensemble de molécules) présente dans l’organisme qui témoigne de l’apparition d’un processus pathologique. Il permet ainsi de dépister une maladie, d’en prédire sa gravité ou encore d’évaluer l’efficacité d’un traitement. Les liquides biologiques représentent des milieux de choix pour la recherche de biomarqueurs en pathologie humaine car leur collection est habituelle dans la prise en charge des patients et moins invasive comparée aux biopsies d’organes ou de tissus. Dans cette thèse, nous nous sommes intéressés plus particulièrement aux exosomes présents dans ces liquides biologiques. Les exosomes sont des nanovésicules dont le diamètre est compris entre 30 et 100 nanomètres. Ils sont sécrétés par tous les types cellulaires et contiennent des protéines cytoplasmiques et membranaires spécifiques de leur cellule d’origine. L’intérêt majeur des exosomes isolés à partir des liquides biologiques, est qu’ils constituent une source de biomarqueurs. Ils peuvent donc être assimilés à une « biopsie liquide ». L’analyse des exosomes pourrait compléter utilement des examens classiques de dépistage, de diagnostic et de suivi d’une pathologie. Dans le cadre de projet de cette thèse, nous avons appliqué des techniques de protéomique à haut débit pour l’analyse des exosomes. Nous nous sommes tout d’abord intéressés à l’analyse du profil protéique des exosomes urinaires dans le contexte de deux pathologies du tractus urinaire : la cystinurie et le cancer du rein. La cystinurie est une néphropathie lithiasique d’origine génétique pour laquelle il y a peu de marqueurs biologiques pouvant prédire son évolution vers l’insuffisance rénale terminale. Nous avons développé une méthode de préparation des exosomes urinaire permettant d’analyser de façon reproductible leurs profils protéiques. Nous avons appliqué cette méthode à huit patients cystinuriques et comparé les résultats aux profils obtenus chez dix sujets sains. Un panel de 38 protéines différentiellement exprimé dans les exosomes des patients a été identifié et en partie validé par Western blot. Concernant le cancer du rein à cellules claires pour lequel le diagnostic nécessite des prélèvements invasifs par biopsie, nous avons analysé les exosomes urinaires de huit patients avant et après néphrectomie. Nous avons ainsi pu mettre en évidence un panel de 25 protéines surexprimées dans les exosomes des patients. Enfin, le dernier volet de cette thèse a été consacré à l’analyse des exosomes du lavage broncho-alvéolaire provenant de patients MV, maladie d’origine génétique qui atteint principalement les poumons. L’analyse des exosomes de lavage broncho-alvéolaire pourrait permettre de donner un éclairage nouveau sur la physiopathologie de la maladie. Nous avons réalisé la comparaison des profils protéiques des exosomes de quatre patients MV, et six patients asthmatiques. L’ensemble des résultats obtenus au cours de cette thèse montre que l’analyse protéomique des exosomes issus de fluides biologiques peut aider la recherche de biomarqueurs diagnostics ou pronostics de maladies. / A biomarker is a molecule (or a cluster of molecule) which will reflect the occurrence of a pathological state, giving us the ability to detect a disease, to predict its severity or to assess drug efficiency. Biological fluids are the golden standards for biomarker research in human as they are routinely collected for patients’ follow-up and are less invasive than biopsies. During my PhD, I focused on exosomes that can be found in these biological fluids. Exosomes are nanovesicles with a diameter ranging between 30 and 100 nanometers. Exosomes are secreted by all cell types and harbor cytoplasmic and membranous proteins specific of their cells of origins. One of the major interest of exosomes enriched from biological fluids is that they represent a valuable source of biomarkers. They can be considered as a « liquid biopsy ». Their analysis could complete classical diagnosis and follow-up tools. In this project, we applied high resolution, high throughput proteomic techniques for exosomes analysis. We firstly focused on protein profiles in urinary exosomes in the context of two urinary tract diseases: cystinuria and kidney cancer. Cystinuria is an inherited autosomal recessive disease that is characterized by the formation of cystine stones in the kidneys. To date, there are no markers to predict the evolution toward end stage renal disease. We developed a method to prepare exosomes in order to reproducibly analyze their protein profiles. We applied this method to eight cystinuria patients and compared their profiles to those of ten healthy subjects. A panel of 38 differentially expressed proteins in patients were found and validated by western blots. We also applied this method to patients with clear cell renal cell carcinoma, for which invasive biopsies are necessary for clear diagnosis. We analyzed urinary exosomes form eight patients before and after nephrectomy. We were able to highlight 25 overexpressed proteins in patients’ exosomes. Eventually, the last part of my thesis was dedicated to the analysis of exosomes enriched from bronchoalveolar lavage fluid collected in cystic fibrosis patients, a disease that affects mostly the lungs. Bronchoalveolar lavage fluid exosomes analysis could give a new insight on the mechanisms of this disease. We compared protein profiles in exosomes from four cystic fibrosis patients and six asthmatic patients. The whole point of this work is to show that proteomic analysis of exosomes isolated from biological fluids could become a golden standard for the discovery of diagnosis or prognosis biomarkers.

Introduction: les follicules lymphoïdes (FL) sont absents du poumon normal mais ont été décrits dans les poumons de patients atteints de mucoviscidose ou de dilatations de bronches non mucoviscidosiques, suggérant un rôle pour l’infection bronchique dans la néogenèse lymphoïde (NL). Nous avons étudié la dynamique de la néogenèse lymphoïde dans l’infection bactérienne. Méthodes: les souris C57BL/6 ont reçu une instillation intratrachéale de billes d’agarose contenant du PAO1 ou du S. aureus (106 CFU/animal) permettant une infection prolongée et ont été comparées à des souris contrôles (billes stériles ou absence de billes). Les souris ont été sacrifiées à J1, J4, J7 et J14. Résultats: l’instillation unique de billes d’agarose contenant du PAO1 ou du S. aureus induit en 14 jours des FL fonctionnels situés sous l’épithélium en regard des zones d’infection. Le marquage pour CXCL12 et CXCL13 est faible chez contrôles, mais présent dans l’épithélium (CXCL13) dès J1 et présent également dans les FL (CXCL12 et CXCL13) à J14 chez les souris infectées. Le traitement des souris par un anticorps anti CXCL12 ou anti CXCL13 n’inhibe pas la formation des FL induite par l’infection à PAO1. Conclusion: nos données suggèrent un rôle pour l’infection bactérienne prolongée et l’épithélium respiratoire dans la NL des bronchopathies chroniques. Notre modèle permet d’évaluer les mécanismes de la formation et de persistance des FL dans le poumon. / Introduction: lymphoid follicles (LF) are absent in normal lungs, but are described in lungs of subjects with cystic fibrosis (CF) or non-CF bronchiectasis, suggesting a role for bacterial infection in lymphoid neogenesis. We aimed to study the dynamic of pulmonary lymphoid neogenesis (LN) during bacterial infection. Methods: C57BL/6 mice were instilled intratracheally with PAO1- or S. aureus-coated (1.106 CFU/mouse) agarose beads (which produced prolonged airway infection) and compared to controls (sterile beads or no instillation). Mice were sacrificed on day (d)1, d4, d7, and d14 after instillation. Results: chronic pulmonary infection with PAO1 or S. aureus induced organised LF in 14 days after a single challenge with PAO1- or S. aureus-coated beads. Bacteria- induced LF were exclusively localized in the subepithelium of infected airways. Staining for CXCL12 and CXCL13 was weak in airway epithelium of controls, but was positive in airway epithelium (CXCL13) at 1 day and in LF (both) of infected mice at 14 days. Treatment with anti CXCL12 or anti CXCL13 Ab did not reduce LN induced by PAO1 infection. Conclusions: chronic bacterial infection and respiratory epithelium could contribute to LN in chronic airway diseases. Our unique model allows to study mechanisms for the formation and maintenance of lung LF.

La mucoviscidose est la maladie génétique autosomique récessive létale la plus fréquente dans la population caucasienne. Le gène muté code pour la protéine CFTR (Cystic Fibrosis Transmembrane conductance Regulator). CFTR est un canal anionique localisé dans la membrane apicale des épithélia. Il permet notamment le transport d’ions chlorure (Cl-) et bicarbonates (HCO3-). La délétion de la phénylalanine en position 508 (F508del) de CFTR est la mutation la plus fréquente et entraîne un défaut d’adressage de CFTR à la membrane plasmique. L’atteinte respiratoire réalise une bronchopathie obstructive surinfectée qui détermine le pronostic vital de la maladie. Deux mécanismes délétères présents dès la période néonatale vont notamment contribuer à la destruction du tissu pulmonaire : une inflammation exacerbée et auto-entretenue, et une colonisation bactérienne chronique du mucus notamment à Pseudomonas aerugonisa et Staphylococcus aureus. Les mécanismes à l’origine de l'initiation de ce double processus demeurent inconnus. De plus en plus d'arguments plaident pour l'implication des ions HCO3-, donc du pH, dans l'initiation de l'atteinte pulmonaire de la mucoviscidose. En effet, le défaut de CFTR entraîne une diminution de leur sécrétion dans le liquide de surface bronchique (ou Airway Surface Liquid : ASL), ce qui conduit à un pH local anormalement bas. Les ions HCO3- jouent un rôle important dans la physiopathologie bronchique pulmonaire. En effet, ils régulent la rhéologie du mucus et sont impliqués dans l’activité des peptides antimicrobiens, principaux facteurs de la bactéricidie locale et dont l'activité est pH dépendante. Cela a été démontré dans un modèle porcin de mucoviscidose. Ainsi une altération du transport de HCO3- pourrait contribuer à l'hyperviscosité des sécrétions muqueuses, initier la colonisation bactérienne en diminuant le pouvoir bactéricide du liquide de surface respiratoire. Cette hypothèse est la base de mon projet visant à étudier le rôle du transport transépithélial des ions bicarbonates dans la bactéricidie au sein de l’épithélium respiratoire dans la mucoviscidose. La mesure du pH de l’ASL a nécessité la conception d’une enceinte à atmosphère contrôlée. Cet outil a permis la mise en évidence d’une acidité de l’ASL F508del en comparaison du Wild Type (WT), due à un défaut de sécrétion des ions HCO3- dans l’ASL, lui-même induit par une inhibition fonctionnelle du transporteur Cl-/HCO3- SLC26A4 ou pendrine majoritairement et du canal CFTR minoritairement. L’évaluation de la bactéricidie de l’ASL après infection au Staphylococcus aureus révèle une déficience de bactéricidie chez les cellules épithéliales F508del, reliée à l’activité anormale de la pendrine. L’investigation des capacités d’adhésion et d’invasion du Staphylococcus aureus dans nos modèles montre que le défaut de bactéricidie épithélial observé se restreint à l’ASL et incite à poursuivre les recherches sur le rôle du pH de l’ASL dans l’activité de ses peptides antimicrobiens, principale ligne de défense de l’immunité innée respiratoire. Notre travail de restauration du pH de l’ASL avant infection de l’épithélium respiratoire démontre d’ores et déjà l’impact significatif du pH de l’ASL dans la modulation de sa bactéricidie, où la restauration du pH est corrélée à une amélioration de la bactéricidie. Ce travail met en lumière le rôle crucial du pH de l’ASL dans l’appréhension de la physiopathologie de la maladie et sensibilise à de nouvelles voies thérapeutiques, basées sur une restauration du pH de l’ASL et/ou l’utilisation de peptides antimicrobiens pH-indépendant. / Cystic fibrosis (CF) is a lethal autosomal recessive disorder caused by mutations in the CF Transmembrane Conductance Regulator (CFTR) gene encoding for a cAMP-activated anionic channel, secreting mainly chloride (Cl-) and bicarbonate (HCO3-) at the apical surface of the epithelia. Most patients are homozygous for the p.PHe508del mutation (F508del). The main cause of morbidity and mortality is obstructive lung disease characterized by exacerbated inflammation and bacterial infection of the airway surface liquid (ASL), a thin layer coating the luminal face of the airway epithelium. ASL bacterial colonization begins from the first hours of life with evidence of Staphylococcus aureus in airway secretions pointing to impaired local defense. However, the defect responsible for this defective bacterial clearance is not clearly understood. It was proposed to be related to decreased mucociliary clearance and abnormal inflammatory responses, but recent studies also show the contribution of ASL in the reduced antimicrobial capacity of ASL in CF airways. An abnormally low ASL pH impairs mucin hydration and solubilization, resulting in hyperviscous mucus, which impedes muco-ciliary clearance. It also reduces the activity of antimicrobial peptides by modulating their native charges and the bactericidal activity of antibiotics. This was supported by studies in newborn CF pigs, which highlighted an abnormally low ASL pH, in association with a defective short-term S. aureus antimicrobial activity. Restoring normal pH in the ASL of CF pigs improved ability to eradicate the bacteria, showing that reduced ASL pH is central to disease pathogenesis. However, there is still controversy about the value of ASL pH in humans. Very recently, a study in young CF children, based on in vivo measurements, showed similar ASL pH values in children with CF to that in children without CF. The mechanisms underlying the ASL pH homeostasis and in particular the balance between HCO3- and proton (H+) secretion are still not known. Shah et al highlighted the role of persistent H+ secretion by ATP12A concomitant to a CFTR-mediated reduced bicarbonate transport, but recent work overexpressing ATP12A in respiratory cells failed to find any pH modification in physiological conditions. Most importantly, there is no clear understanding of the initial host response, when S. aureus bacteria land on the pristine surface of a newborn airway, with a prolonged time of contact and continuous reseeding from infected mucus plugs. This is however crucial to clarify pathogenesis of this early steps to counteract pro-infectious vicious circle and define optimal therapeutic strategy in newborns. We focused on human airways and hypothesized that S. aureus clearance during the first hours of infection was impaired in human airway CF ASL because of lowered ASL pH. To test this hypothesis, we designed bacterial infection experiments within human airway epithelium to mirror the onset of initial S. aureus infection. We then studied the relationship between local bacterial clearance and ASL pH regulation in WT and F508del homozygous human bronchial epithelial cells, with special emphasis on physiologically relevant HCO3- and H+ transporters.

La mucoviscidose (CF, Cystic Fibrosis), maladie autosomique récessive la plus fréquente dans la population caucasienne, se manifeste par l’atteinte de plusieurs organes due à l’absence ou au dysfonctionnement du canal CFTR. Au niveau des poumons, la perte de l’activité du canal se traduit par une déshydration du mucus, des cycles d’infections et d’inflammation aboutissant à terme à la destruction du parenchyme pulmonaire. Les thérapeutiques proposées à l’heure actuelle, sont principalement symptomatiques et l’exploration de nouvelles pistes reste nécessaire. De récents travaux émanant de notre équipe ont révélé qu’une intervention au niveau de la stabilisation des transcrits pourrait être bénéfique pour améliorer la quantité de protéines nécessaires pour restaurer une activité suffisante du canal CFTR. Une autre piste qui pourrait être explorée serait de cibler, en plus de l’expression du gène CFTR, des régulateurs clés qui participent aux processus de réparation cellulaire ou à la réponse inflammatoire. Dans cet objectif, nous nous sommes focalisés sur des régulateurs clés comme les miARN et les ARE-BP (protéines de liaison à l’ARN) qui sont dérégulés dans les tissus CF et qui peuvent agir ensemble dans le contrôle de l’expression de nombreux gènes.Les travaux que nous avons réalisés nous ont permis d’une part, de montrer la dérégulation de miARN dans des échantillons CF ainsi que des isoformes de certains miARN. Deux miARN ont retenu notre attention, le miR-101 dont la distribution de ses séquences isomiR varient dans des cultures CF et le miR-181a-5p qui présente une dérégulation de son expression dans trois modèles ex-vivo CF que nous avons utilisés. Ces miARN ont la particularité de moduler l’expression de gènes clés dans les voies de signalisation PI3K-Akt/MAPK-Erk et Wnt. D’autre part, nos travaux ont révélé la dérégulation de la protéine ARE-BP TTP (Tristétraproline ou ZFP36) en contexte CF. Cette protéine est d’autant plus intéressante qu’elle est connue pour être un régulateur clé de l’inflammation. La suite de ce travail a donc été d’étudier sa régulation et son impact sur ses ARNm cibles. L’activité de cette ARE-BP a été principalement décrite pour être contrôlée par la voie p38-MAPK. Nous montrons l’implication de la voie p42/p44-MAPK (Erk1/2) dans la régulation de la phosphorylation de TTP dans des cultures bronchiques. La recherche des interactions entre TTP et ses cibles a également révélé que cette protéine agissait sur ses propres régulateurs ainsi que sur l’ARNm CFTR. Nous montrons ainsi pour la première fois que TTP se fixe au niveau de la région 3’UTR du transcrit CFTR et joue un rôle de stabilisateur sur ce transcrit.Identifier de nouveaux acteurs de la régulation du gène CFTR mais également des régulateurs centraux des processus altérés en contexte CF offre de nouvelles opportunités pour concevoir des outils ciblés pour combattre cette maladie. / Cystic fibrosis (CF), the most common life-shortening genetic disorder in Caucasians, affects many organs but chronic lung disease is the main cause of morbidity and mortality. This disease, characterized by CFTR gene alterations, results in ions transport dysfunctions that contribute to impair mucociliary clearance, favoring bacterial colonization and inflammation, and ultimately leading to lung destruction. Nowadays, therapeutic drugs have limited benefit, so development of new alternatives or complementary molecules remains essential. Recently, our team demonstrated that the intervention on CFTR mRNA stability leads to an increase in CFTR protein level and an improvement of the CFTR channel activity. An alternative way would be to target key actors such as miRNA and ARE-BP (RNA binding protein), deregulated in CF tissues, that display a pleiotropic activity and act together to control expression of several genes.Our findings led to the identification of dysregulated miRNA in CF samples and revealed multiple isoforms relative to miRNA of reference (i.e. isomiRs). We focused on two miRNA, miR-101, that displays a modification in isomiR distribution and miR-181a-5p that is highly deregulated, in three CF airways models. These miRNA modulate expression of key genes or related genes in PI3K-Akt/MAPK-Erk and Wnt signaling pathways.Our work also revealed the deregulation of an ARE-BP protein, TTP (Tristetraprolin, ZFP36), in CF context. This protein is a master regulator in inflammatory resolution. We next investigated the mechanism whereby this ARE-BP is regulated in bronchial cells and showed that TTP phosphorylation is regulated by MK2 through ERK activation. We also determined for the first time that TTP binds to the 3’UTR of CFTR mRNA where TTP binding stabilizes CFTR mRNA level.These data bring new insights into CF physiopathology and open new research opportunities in CF.

Ce travail scientifique a abordé la problématique de la communication cellulaire entre le pancréas exocrine et endocrine dans la mucoviscidose. La contribution des infections pulmonaires chroniques et des traitements immunosuppresseurs sur la dégénerescence pancréatique a été aussi étudiée. Les résultats obtenus ont montré que le LPS disséminé par des infections récurrentes peut cibler les cellules pancréatiques exocrines, en conduisant à la formation des microparticules membranaires qui sont nuisibles pour la survie et le fonctionnement des cellules endocrines. Dans cette communication intercellulaire, la protéine CFTR est un médiateur essentiel de la sévérité des signaux délivrés par les microparticules et de la réponse cellulaire à l'inflammation du pancréas, en participant à l'équilibre de la sécrétion d'insuline des cellules endocrines. En outre, les données ont mis en évidence que l'administration prolongée d’immunosuppresseurs chez les patients greffés pourrait différemment induire l'apoptose de manière dépendante de la mitochondrie, cela en favorisant l'entrée des cellules en sénescence prématurée, un état métabolique du dysfonctionnement cellulaire. / This scientific work tackled the issue of the communication between exocrine and endocrine pancreas in cystic fibrosis. Also, the contribution of recurrent lung infections and immunosuppressive therapy to the pancreatic cell degenerescence was studied in vitro. Results obtained showed that disseminated LPS released by recurrent infections could target pancreatic exocrine cells, leading to the formation of membrane microparticles that are deleterious for endocrine cell survival and function. In this intercellular cross-talk, CFTR is a critical mediator for the severity of the MP-delivered signals and for the pancreatic cell response to inflammation, also participating to the balance of insulin secretion of endocrine cells. Furthermore, data evidenced that long-term administration of immunosuppressive drugs in grafted patients may differently induce apoptosis in a mitochondrial-dependent fashion, possibly favoring cells to enter premature senescence, which is a metabolic state of cellular dysfunction.

L'observation que nous avons faite d'une plus grande fréquence de souches de Staphylococcus aureus hypermutables isolées chez les patients atteints de mucoviscidose que chez un panel de souches témoins nous a amené à étudier les mécanismes de l'hypermutabilité chez cette espèce. L'analyse des gènes du système de réparation des mésappariements, mutS et mutL, a montré pour quatre souches cliniques une relation de cause à effet entre l'altération de ces gènes et leur phénotype hypermutable. Nous avons montré que ces gènes étaient co-transcrits chez S. aureus et que l'invalidation de l'un ou l'autre conduisait à un phénotype hypermutable. Nous avons mis au point un modèle pour l'étude de l'effet de ces gènes sur la recombinaison chez S. aureus, qui semble montrer que tous deux n'ont qu'un rôle limité dans le phénomène chez cette espèce. Cette propriété d'hypermutabilité a aussi un impact sur la résistance aux antibiotiques des souches. En effet, la résistance aux antibiotiques du groupe des macrolides est de plus en plus fréquente chez les souches de S. aureus isolées lors de la mucoviscidose, et nous avons montré qu'elle n'était pas due à des gènes de résistance portés par des plasmides ou des transposons mais, de façon très inhabituelle, à des mutations de la cible ribosomale des macrolides. Nous avons ainsi mis en évidence des mutations dans les gènes rrl (codant l'ARN ribosomal), rplD et rplV (codant respectivement les protéines ribosomales L4 et L22).

Local delivery of medication to the lung is highly desirable as the principal advantages include reduced systemic side effects and higher dose levels of the applicable medication at the site of drug action. This administration could be particularly useful for patients with specifically chronic pulmonary infections or pulmonary diseases, such as cystic fibrosis, asthma or lung cancer. In order to deliver a high dose range of medication for highly-dosed drugs such as antibiotics, “carrier-free” DPI formulations of tobramycin were developed with the aim of minimizing the use of excipients. Briefly, dry powders were prepared by spray drying various suspensions of tobramycin in isopropanol. First, as particle size is a key parameter in defining drug deposition in the lungs, the new Spraytec® laser diffraction method specifically modified for measuring the PSD of aerosolized drug was evaluated. The dispersion properties of various dry powder formulations were investigated using different laser diffraction and impaction apparatuses at different flow rates and using different inhalator devices. Different correlations between geometric and aerodynamic size data were demonstrated in this study. As a potential application, for the flow rate, the different inhalation devices and the drug formulations examined, the tobramycin fine particle fraction could be predicted from measurements obtained from the Spraytec® using linear relationships. Correlations (R² > 0.9) between the MMAD and the percentage of particles with a diameter below 5 µm could be demonstrated between the results obtained from the laser diffraction technique and the impaction method. Consequently, the Spraytec® laser diffraction technique was proved to be an important tool for initial formulation and process screening during formulation development of DPIs. In order to modify the surface properties of the raw tobramycin powder, different powder compositions were formulated with the aim of studying the influence of the concentration of tobramycin in drug suspensions used for spray-drying, the lipid film composition (cholesterol:Phospholipon ratio) and the coating level (in percentage) on the physicochemical and aerodynamic characteristics of the antibiotic. The results indicated that the application of a lipid coating around the active particles allowed an improvement in particle dispersion from the inhalator, decreasing raw powder agglomeration and thus enhancing drug deposition deep in the lungs. Moreover, these results seemed to be influenced by the amount and composition of the lipids in the formulations. The evaluation of the influence of the coating level showed that the deposition of only 5% w/w lipids (on a dry basis) was sufficient to improve particle dispersion properties during inhalation. The FPF, which is around 36% for the uncoated micronized tobramycin, was increased to up to about 68% for the most effective lipid-coated formulation. Of particular importance, these results revealed the need to add sufficient amounts of covering material in order to significantly modify the particle surface properties and reduce their tendency to agglomeration, while limiting the lipid level in the formulations in order to avoid any undesirable sticking and to allow the delivery of more of the active drug to the deep lung. Another approach used to modify the surface properties of raw tobramycin was to coat the micronized particles with nanoparticles of the drug, produced by high pressure homogenization. The evaluation of the influence of the level of nanoparticle coating of the micronized particles showed that the presence of nanoparticles in the formulations improved the particle dispersion properties during inhalation. One microparticle was completely covered with a single layer or several layers of nanoparticles, in function of the percentage of nanoparticles in the mixture. Coating the fine drug particles with particles in the nanometer range was believed to reduce Van Der Waals forces and powder agglomeration. These various layers of nanoparticles also allowed a decrease in the cohesion of the powder by improving the slip between the particles. On the other hand, suspensions containing solely nanoparticles were spray dried with various concentrations of surfactant in order to produce easily dispersible and reproducible micron-size agglomerates of nanoparticles during inhalation. The evaluation of the influence of the concentration of surfactant showed that deposition of only 2% w/w (on a dry basis) of Na glycocholate is sufficient to improve particle dispersion properties during inhalation. Consequently, the use of nanoparticles in dry powder formulations increased the FPF from 36% for the uncoated micronized tobramycin to about 61% for this latter formulation. To modify the balance between the different forces of interactions without the need for any excipient, the influence of formulation components on the aerosolization characteristics of spray-dried tobramycin through the use of various proportions of water in the solvent used to prepare initial suspensions was investigated. These results showed that it is possible to modify the surface properties of the particles by coating the particles of drug with a homogeneously distributed film of the active compound dissolved in a solvent system containing a mixture of different solvents such as isopropanol and water. During nebulization of the suspension, droplets are composed of one or more particles in solid state surrounded with solvent containing the dissolved drug. It is hypothesized that during the drying step, dissolved tobramycin forms a coating of the amorphous drug around particles in suspension. The coating of drug particles can thus be used as an alternative approach that permits the modification of the surface properties of the particles, increasing the flowability, the desagglomeration tendency and the fine particle fraction deposited in the deep lung. So, the evaluation of the influence of the water content of the suspensions and the effect of the inlet temperature during spray-drying showed that the addition of 2% water v/v is sufficient to improve particle dispersion during inhalation. Of particular interest, as tobramycin is a very hygroscopic drug, the addition of water turned out to be a critical step. It was thus important to add a small amount of water to the solvent system and to process the drying step at a high temperature to produce formulations containing solely the active drug and showing a FPF of up to 50%. Moreover, stability studies demonstrated that these optimized formulations (lipid-coated formulation, nanoparticle formulation and amorphous drug-coated formulation) were stable over a long time period at various ICH temperature and relative humidity storage conditions (25°C/60% RH, 30°C/65% RH and 40°C/75% RH). The formulations were shown to keep their crystalline state, initial PSD, redispersion characteristics and deposition results for more than twelve months. In order to confirm these encouraging results, two optimized formulations (one with a lipid coating and another with amorphous drug coating) were selected and compared to the only commercially available tobramycin formulation for inhalation, Tobi® (nebulizer solution), by performing a combined in vivo scintigraphic and pharmacokinetic evaluation of tobramycin DPIs in nine CF patients. In comparison with Tobi®, it was estimated that lung deposition, expressed as a percentage of the nominal dose, was 7.0 and 4.5 times higher for the lipid-coated and amorphous tobramycin-coated formulations, respectively. Moreover, the pharmacokinetic data, adjusted to the same drug dose as that of the Tobi® deposited in the lungs, showed that the AUC values were found to be 1.6 times higher for Tobi® than for DPI formulations. So this evaluation confirmed the superiority of dry powder formulations in terms of drug deposition and reduced systemic exposure in comparison with the conventional comparator product, Tobi®. Thus, these new and orginal tobramycin DPI formulations based on the use of very low excipient levels and presenting very high lung deposition properties, were shown to offer very good prospects for improving the delivery of drugs to the pulmonary tract and to the widest possible patient population.