Pseudomonas aeruginosa est un pathogène opportuniste majeur des patients atteints de mucoviscidose. Les infections à P. aeruginosa sont souvent difficiles à traiter, notamment en raison de sa capacité à développer des résistances à plusieurs familles d'antibiotiques. Dans les années 1980, les carbapénèmes font leur apparition dans l'arsenal anti-pyocyanique. Toutefois, les premiers cas de résistance apparaissent rapidement en raison de la« perte» de la porine OprD, voie d'entrée spécifique de ces antibiotiques dans la bactérie. L'étude de 173 souches cliniques de P. aeruginosa, a permis de caractériser les mécanismes à l'origine de cette résistance. La perte de la porine résulte de mutations inactivant le gène oprD ou se traduisant par des substitutions d'acides aminés responsables d'altérations structurales de la porine. Le gène oprD peut également être réprimé par certains régulateurs de pompes d'efflux telles que MexEF-OprN. La surproduction de ce système suite à l'inactivation d'une oxydoréductase, MexS, chez les mutants nfxC in vitro, confère une résistance conjointe à plusieurs familles d'antibiotiques ainsi que la perte de la production de nombreux facteurs de virulence. Toutefois, les altérations retrouvées dans la protéine MexS de 22 mutants nfYC cliniques sont majoritairement des substitutions d'acides aminés qui compromettent peu la virulence. L'origine de la surproduction de la pompe MexEF-OprN et de la multi-résistance qui lui est associée chez les souches cliniques s'est révélée indépendante de mutations dans le gène mexS chez près de la moitié des isolats, indiquant indirectement la participation d'autres gènes dans la régulation de ce système d' efflux. / Pseudomonas aeruginosa is an opportunistic pathogen which contributes to the decline of respiratory function in cystic fibrosis patients. Shortly after infection, the bacterium is able to develop various strategies to resist antibiotics of different classes. ln 1980's, new antibiotics, called carbapenems, are developed for anti-pyocyanic treatments. However, isolation of carbapenem resistant clinical strains of P. aeruginosa increases. Resistance to carbapenem mainly results from loss of porin OprD, the major route of entry of these molecules in the bacteria. Aim of this study is to characterize the mechanisms of this resistance through 173 clinical isolates of P. aeruginosa. Loss of porin OprD is mostly due to mutations inactivating oprD gene or generating deleterious amino-acid substitutions in the porin structure. Gene oprD can also be down-regulated by efflux system regulators such as Mexî, the transcriptional activator of MexEF-OprN efflux pump. Overexpression of mexEF-oprN in laboratory-selected nfxC mutants is caused by inactivation of an oxydoreductase, MexS, leading to resistance to fluoroquinolones, chloramphenicol and carbapenem and loss of production of several virulence factors. Analysis of 22 non-redundant clinical nfxC mutants showed that (i) in contrast to in vitro selected counterparts only 3 of them harbored a disrupted gene mexS, (ii) 9 contained amino-acid substitutions in MexS associated with moderate effects on resistance an virulence factors production and (iii) 1 O did not display mutations in any of the regulators known to control mexEF-oprN expression, indicating that other loci are responsible for the pump upregulation.

Dans la mucoviscidose (CF), Pseudomonas aeruginosa colonise les voies respiratoires, conduisant à une inflammation chronique de l’épithélium bronchique. Une analyse transcriptomique antérieure nous a permis d’identifier CHAC1 comme un gène différentiellement exprimé entre les cellules épithéliales bronchiques primaires de patients CF et non-CF, au niveau basal et au cours de l’infection à P. aeruginosa. CHAC1 est une protéine dégradant le glutathion et associée au stress du réticulum endoplasmique et à l’apoptose. L’objectif principal de ce travail était de comprendre la contribution de CHAC1, en particulier dans la réponse inflammatoire et l’apoptose des cellules épithéliales pulmonaires. Nous avons donc, dans un premier temps, confirmé que CHAC1 est surexprimé au niveau ARNm dans les cellules épithéliales bronchiques primaires non-CF par rapport aux cellules CF. Nous avons observé que P. aeruginosa et deux de ses facteurs de virulence, le LPS et la flagelline, induisent l’expression de CHAC1 dans les cellules non-CF. L’expression de CHAC1 induite par le LPS est indépendante de PERK mais implique ATF4. De plus, nous avons observé qu’une réduction de l’expression de CHAC1 est associée, après stimulation par du LPS et de la flagelline, à une modulation des marqueurs inflammatoires notamment l’IL-8, l’IL-6, CCL2 et PGE2. Enfin, nous avons montré que P. aeruginosa n’est pas capable d’induire de l’apoptose dans la lignée de cellules épithéliales bronchiques NCI-H292. Ces résultats suggèrent que la régulation de l’expression de CHAC1 dans les cellules CF pourrait contribuer à la réponse inflammatoire excessive et chronique observée chez les patients atteints de mucoviscidose. / In cystic fibrosis (CF), Pseudomonas aeruginosa colonizes the airways, leading to chronic inflammation of the bronchial epithelium. A previous transcriptomic analysis allowed us to identify CHAC1 as a gene differentially expressed between primary bronchial epithelial cells of CF and non-CF patients at the basal level and during P. aeruginosa infection. CHAC1 is a glutathione-degrading protein associated with endoplasmic reticulum stress and apoptosis. The main objective of this work was to understand the contribution of CHAC1, particularly in the inflammatory response and apoptosis of pulmonary epithelial cells. We therefore first confirmed that CHAC1 is overexpressed at the mRNA level in non-CF primary bronchial epithelial cells relative to CF cells. We observed that P. aeruginosa and two of its virulence factors, LPS and flagellin, induce CHAC1 expression in non-CF cells. The expression of CHAC1 induced by LPS is independent of PERK but involves ATF4. Moreover, we have observed that a reduction in the expression of CHAC1 is associated, after stimulation by LPS and flagellin, with a modulation of the inflammatory markers, in particular IL-8, IL-6, CCL2 and PGE2. Finally, we have shown that P. aeruginosa is not capable of inducing apoptosis in the NCI-H292 bronchial epithelial cell line. These results suggest that CHAC1 is involved in the regulation of bronchial cell inflammation during P. aeruginosa infection and the regulation of CHAC1 expression in CF cells may contribute to the observed excessive and chronic inflammatory response in patients with cystic fibrosis.

70% des mutations identifiées sur le gène responsable de la mucoviscidose correspondent à la délétion de la phénylalanine en position 508 (F508del) de la protéine CFTR (Cystic Fibrosis Transmembrane conductance Regulator). Cette mutation est responsable, à 37°C, d'un mauvais repliement, du blocage et de la dégradation rapide de CFTR au niveau du réticulum endoplasmique (RE), et par conséquent de l'absence de sécrétion des ions Cl- au niveau de la membrane apicale des cellules épithéliales. Deux conséquences principales de cette mutation sont un épaississement important du mucus bronchique et une diminution de l'intégrité de la barrière luminale de l'épithélium bronchique. Ces deux phénomènes participent à l'invasion et à l'infection du tissu pulmonaire par des bactéries pathogènes comme Pseudomonas aeruginosa, exacerbant l'inflammation et la destruction tissulaire au niveau des poumons. L'objectif de cette étude a été de déterminer le rôle de deux protéines appartenant à la famille des protéines G hétérotrimériques, G12 et G13, dans la dégradation de la protéine CFTR-F508del ainsi que dans le contrôle des complexes jonctionnels au niveau de l'épithélium bronchique sain et mucoviscidosique. Nos travaux démontrent pour la première fois que dans la mucoviscidose, l'expression des protéines G12 et G13 est faible. Nous avons aussi montré que G12, et non G13, est impliquée dans le contrôle de la dégradation de la protéine CFTR-F508del via les protéines chaperonnes Calnexine et HSP90, et dans la formation et le maintien des jonctions cellulaires bronchiques via E-cadhérine et ZO-1 de manière inverse par rapport à l'épithélium rénale. Ces travaux placent donc G12 comme un acteur non négligeable de la maladie de la mucoviscidose. / F508del, the most frequent mutation found in cystic fibrosis (CF) population, impacts CFTR (Cystic Fibrosis Transmembrane conductance Regulator) trafficking and causes its rapid degradation at the endoplasmic compartment, resulting in a significant decrease in Cl- secretion at the apical membrane of epithelial cells. F508del has two main features, significant thickening of the bronchial mucus and a reduction in the integrity of the luminal barrier of the bronchial epithelium. These two phenomena are involved in the invasion and infection of lung tissue by pathogenic bacteria such as Pseudomonas aeruginosa, exacerbating the inflammation and lung destruction. The objective of this study was to determine the role of two proteins member of the heterotrimeric G proteins family, G12 and G13, in the degradation of the F508del CFTR, and in the control of junctional complexes in the normal and CF bronchial epithelium. Our results show for the first time that G12 and G13 are down expressed in CF. G12, but not G13, is involved in the control of F508del-CFTR degradation through its interaction with Calnexin and HSP90 chaperones. Unlike kidney epithelia cells, G12 promotes the formation and maintenance of cell junctions in the bronchial epithelium by affecting E-cadherine and ZO-1 stability. Altogether, our results set therefore G12 as a significant actor of the CF disease.

L’infection pulmonaire chronique à Pseudomonas aeruginosa (P. a.) est considérée comme la principalecause de morbidité et de mortalité liée à la mucoviscidose. Au cours de cette infection persistante, labactérie s'adapte à l’environnement pulmonaire caractéristique de ces patients et évolue avec son hôtependant des décennies. Cette évolution adaptative est portée par les phénotypes, avec notamment unediminution de la virulence et une augmentation de la résistance aux antibiotiques au cours du temps. Bienque plusieurs études aient tenté d’évaluer les mécanismes génétiques de cette évolution, il demeureaujourd’hui difficile d’expliquer les relations entre les mutations accumulées dans le génome bactérien etl’expression de phénotypes cliniquement pertinents, ou encore de corréler ces mutations avec l’état desanté du patient.Nous proposons dans ce travail d’étudier les mécanismes sous-tendant cette évolution adaptative à unniveau d’observation post-génomique : la métabolomique. Dernière-née des disciplines –omiques, lamétabolomique permet la prise de vue instantanée du métabolisme, et offre une vision au plus proche duphénotype. Pour cela, nous avons constitué une banque de lignées clonales évolutives de P. a. prélevéesau cours de l’infection pulmonaire chronique chez des patients atteints de mucoviscidose. Cette banque aensuite été caractérisée aux plans clinique, phénotypique et métabolomique. L’intégration de ces différentsniveaux d’information par des méthodes statistiques multi-tableaux nous a permis de mettre en évidencedes voies métaboliques impliquées dans la patho-adaptation de P. a. à son hôte.Nos résultats permettent de faire émerger de nouvelles hypothèses pour le développement d’outilsthérapeutiques et diagnostiques visant à améliorer la prise en charge de ces infections particulièrementrésistantes aux antibiotiques. De plus, nos travaux démontrent l’intérêt de la métabolomique pour l’étudede l’évolution adaptative bactérienne en conditions naturelles. / Chronic lung infection with Pseudomonas aeruginosa (P. a.) is considered as the leading cause of cysticfibrosis (CF) morbidity and mortality. During this persistent infection, the bacterium adapts to the typical lungenvironment of these patients and evolves within its host for decades. This adaptive evolution is driven byphenotypes, including a decrease in virulence and an increase in antibiotic resistance over time. Althoughseveral studies have attempted to elucidate the genetic mechanisms of this evolution, it remains difficulttoday to explain the relationships between the accumulated genomic mutations and the expression ofclinically relevant phenotypes, or to correlate these mutations with the patient’s health status.In this work, we propose to study the mechanisms underlying this adaptive evolution at a post-genomicobservation level: metabolomics. Metabolomics, the newest of the -omics disciplines, provides an instantview of the metabolic activities, and furnishes a vision as close as possible to the phenotype. To this end,we constructed a bank of evolutive clonal P. a. lineages sampled during chronic lung infection in patientswith CF. This bank was then clinically, phenotypically and metabolomically characterized. Integration ofthese different levels of information by multi-block statistical methods has allowed us to highlight metabolicpathways involved in within-host patho-adaptation of P. a. .Our results rise new hypotheses for the development of therapeutic and diagnostic tools with the aim ofimproving the management of these infections particularly resistant to antibiotics. In addition, our workdemonstrates the interest of metabolomics to study bacterial adaptive evolution under natural conditions.

Dans la mucoviscidose, le tableau clinique est dominé par les infections respiratoires qui constituent la cause majeure de morbidité. Diverses espèces fongiques sont décrites dans ces infections, notamment les Scedosporium et le complexe Rasamsonia argillacea pour lesquels les connaissances restent limitées. Dans ce travail, nous avons évalué l’intérêt de l’amplification des séquences répétitives de l’ADN pour la différenciation spécifique et infraspécifique de ces champignons. La rep-PCR a d’abord été appliquée à l’analyse d'isolats du genre Scedosporium. La rep-PCR a produit des résultats concordants avec ceux obtenus par séquençage du gène de la bêta-tubuline, amplification aléatoire de fragments d’ADN polymorphes et séquençage multi-loci. Elle permet également l’identification précise des espèces au sein du complexe R. argillacea. L’analyse des résultats obtenus sur 116 isolats a montré la capacité de ces champignons à coloniser de manière chronique les voies respiratoires, un même profil électrophorétique étant observé généralement chez un même patient. Enfin, nous avons produit de nouvelles données sur l’écologie des Scedosporium en étudiant différents biotopes au Maroc. Comme précédemment rapporté,ces champignons préfèrent les environnements impactés parles activités humaines. On les rencontre dans des sols de pH neutre, riches en matières organiques et pauvres en sels. Enfin, si S. apiospermum était l’espèce la plus abondante, S. boydii, S. aurantiacum et S. dehoogii ont été rencontrés avec des fréquences comparables. En conclusion, les données générées renforcent nos connaissances sur l’épidémiologie des infections causées par ces pathogènes émergents. / In cystic fibrosis (CF), respiratory infections are the leading cause of morbidity and mortality. Bacteria are the most common causative agents of these infections, but an increasing number of fungal species may also be found, including Scedosporium species and species of the Rasamsonia argillacea complex. In order to improve our knowledge on the epidemiology of these infections, here we evaluated the interest of PCR amplification of repetitive DNA sequences (rep-PCR) for species identification and strain delineation. rep-PCR was applied to the retrospective analysis of a panel of 63 isolates belonging to the Scedosporiumgenus. Results were consistent with those obtained by beta-tubulingene sequencing, random amplification of polymorphic DNA and Multilocus Sequence Typing. rep-PCR also permitted precise species identification in the R. argillacea complex. Analysis of the data obtained on 116 isolates revealed the capacity of these fungi to chronically colonize the airways of patients with CF, a unique electrophoretic profile being observed usually for each patient. Finally, we produced in this thesis new data about the ecology of Scedosporium species by studying different biotopes in Morocco. As previously reported, these fungi are mainly found in human-impacted areas. Also they prefer soils with a neutral pH, a high organic matter content and a very low mineral salts content. In addition, if S. apiospermum was by far the predominant species, S. boydii, S. aurantiacum and S. dehoogii were encountered with similar frequencies. In conclusion, data provided here reinforce our knowledge on the epidemiology of the infections caused by these emerging pathogens.

Local delivery of medication to the lung is highly desirable as the principal advantages include reduced systemic side effects and higher dose levels of the applicable medication at the site of drug action. This administration could be particularly useful for patients with specifically chronic pulmonary infections or pulmonary diseases, such as cystic fibrosis, asthma or lung cancer.<p>In order to deliver a high dose range of medication for highly-dosed drugs such as antibiotics, “carrier-free” DPI formulations of tobramycin were developed with the aim of minimizing the use of excipients. Briefly, dry powders were prepared by spray drying various suspensions of tobramycin in isopropanol.<p><p>First, as particle size is a key parameter in defining drug deposition in the lungs, the new Spraytec® laser diffraction method specifically modified for measuring the PSD of aerosolized drug was evaluated. The dispersion properties of various dry powder formulations were investigated using different laser diffraction and impaction apparatuses at different flow rates and using different inhalator devices. Different correlations between geometric and aerodynamic size data were demonstrated in this study. As a potential application, for the flow rate, the different inhalation devices and the drug formulations examined, the tobramycin fine particle fraction could be predicted from measurements obtained from the Spraytec® using linear relationships. Correlations (R² > 0.9) between the MMAD and the percentage of particles with a diameter below 5 µm could be demonstrated between the results obtained from the laser diffraction technique and the impaction method. Consequently, the Spraytec® laser diffraction technique was proved to be an important tool for initial formulation and process screening during formulation development of DPIs.<p><p>In order to modify the surface properties of the raw tobramycin powder, different powder compositions were formulated with the aim of studying the influence of the concentration of tobramycin in drug suspensions used for spray-drying, the lipid film composition (cholesterol:Phospholipon ratio) and the coating level (in percentage) on the physicochemical and aerodynamic characteristics of the antibiotic.<p>The results indicated that the application of a lipid coating around the active particles allowed an improvement in particle dispersion from the inhalator, decreasing raw powder agglomeration and thus enhancing drug deposition deep in the lungs. Moreover, these results seemed to be influenced by the amount and composition of the lipids in the formulations. The evaluation of the influence of the coating level showed that the deposition of only 5% w/w lipids (on a dry basis) was sufficient to improve particle dispersion properties during inhalation. The FPF, which is around 36% for the uncoated micronized tobramycin, was increased to up to about 68% for the most effective lipid-coated formulation. Of particular importance, these results revealed the need to add sufficient amounts of covering material in order to significantly modify the particle surface properties and reduce their tendency to agglomeration, while limiting the lipid level in the formulations in order to avoid any undesirable sticking and to allow the delivery of more of the active drug to the deep lung. <p><p>Another approach used to modify the surface properties of raw tobramycin was to coat the micronized particles with nanoparticles of the drug, produced by high pressure homogenization. The evaluation of the influence of the level of nanoparticle coating of the micronized particles showed that the presence of nanoparticles in the formulations improved the particle dispersion properties during inhalation. One microparticle was completely covered with a single layer or several layers of nanoparticles, in function of the percentage of nanoparticles in the mixture. Coating the fine drug particles with particles in the nanometer range was believed to reduce Van Der Waals forces and powder agglomeration. These various layers of nanoparticles also allowed a decrease in the cohesion of the powder by improving the slip between the particles.<p>On the other hand, suspensions containing solely nanoparticles were spray dried with various concentrations of surfactant in order to produce easily dispersible and reproducible micron-size agglomerates of nanoparticles during inhalation. The evaluation of the influence of the concentration of surfactant showed that deposition of only 2% w/w (on a dry basis) of Na glycocholate is sufficient to improve particle dispersion properties during inhalation. Consequently, the use of nanoparticles in dry powder formulations increased the FPF from 36% for the uncoated micronized tobramycin to about 61% for this latter formulation.<p>To modify the balance between the different forces of interactions without the need for any excipient, the influence of formulation components on the aerosolization characteristics of spray-dried tobramycin through the use of various proportions of water in the solvent used to prepare initial suspensions was investigated. These results showed that it is possible to modify the surface properties of the particles by coating the particles of drug with a homogeneously distributed film of the active compound dissolved in a solvent system containing a mixture of different solvents such as isopropanol and water. During nebulization of the suspension, droplets are composed of one or more particles in solid state surrounded with solvent containing the dissolved drug. It is hypothesized that during the drying step, dissolved tobramycin forms a coating of the amorphous drug around particles in suspension. The coating of drug particles can thus be used as an alternative approach that permits the modification of the surface properties of the particles, increasing the flowability, the desagglomeration tendency and the fine particle fraction deposited in the deep lung. So, the evaluation of the influence of the water content of the suspensions and the effect of the inlet temperature during spray-drying showed that the addition of 2% water v/v is sufficient to improve particle dispersion during inhalation. Of particular interest, as tobramycin is a very hygroscopic drug, the addition of water turned out to be a critical step. It was thus important to add a small amount of water to the solvent system and to process the drying step at a high temperature to produce formulations containing solely the active drug and showing a FPF of up to 50%.<p><p>Moreover, stability studies demonstrated that these optimized formulations (lipid-coated formulation, nanoparticle formulation and amorphous drug-coated formulation) were stable over a long time period at various ICH temperature and relative humidity storage conditions (25°C/60% RH, 30°C/65% RH and 40°C/75% RH). The formulations were shown to keep their crystalline state, initial PSD, redispersion characteristics and deposition results for more than twelve months.<p><p>In order to confirm these encouraging results, two optimized formulations (one with a lipid coating and another with amorphous drug coating) were selected and compared to the only commercially available tobramycin formulation for inhalation, Tobi® (nebulizer solution), by performing a combined in vivo scintigraphic and pharmacokinetic evaluation of tobramycin DPIs in nine CF patients.<p>In comparison with Tobi®, it was estimated that lung deposition, expressed as a percentage of the nominal dose, was 7.0 and 4.5 times higher for the lipid-coated and amorphous tobramycin-coated formulations, respectively. Moreover, the pharmacokinetic data, adjusted to the same drug dose as that of the Tobi® deposited in the lungs, showed that the AUC values were found to be 1.6 times higher for Tobi® than for DPI formulations. So this evaluation confirmed the superiority of dry powder formulations in terms of drug deposition and reduced systemic exposure in comparison with the conventional comparator product, Tobi®.<p><p>Thus, these new and orginal tobramycin DPI formulations based on the use of very low excipient levels and presenting very high lung deposition properties, were shown to offer very good prospects for improving the delivery of drugs to the pulmonary tract and to the widest possible patient population. <p><p> / Doctorat en Sciences biomédicales et pharmaceutiques / info:eu-repo/semantics/nonPublished

Réalisé en cotutelle avec l'Université de Cergy-Pontoise / La cholestase intra-hépatique familiale progressive de type 1 (PFIC1) humaine est une maladie génétique rare, provoquée par des mutations du gène ATP8B1, due à un défaut de sécrétion des acides biliaires. Un syndrome moins sévère, et épisodique, appelé Cholestase Intra-hépatique Récurrente Bénigne (BRIC) a pu être associé à des mutations au sein du même gène. Les patients PFIC1 souffrent de nombreuses manifestations extra-hépatiques. Certaines de ces manifestations sont communes aux patients mucoviscidosiques. Le niveau d’expression de CFTR, gène responsable de la mucoviscidose, est diminué chez les patients PFIC1. Cette étude a porté sur l’analyse des interactions/régulations entre CFTR et ATP8B1. Une première approche a été de montrer l’expression de ces gènes dans différentes lignées cellulaires puis d’identifier la présence de leurs protéines par western blot et immunofluorescence. Une seconde approche a été d’effectuer une analyse in silico de la structure d’ATP8B1 par rapport à sa fonction. Nous avons aussi localisés les modifications connues sur un modèle 2D. Cette analyse a permis de mettre en évidence en plus des sites connus (ATPase et domaines transmembranaires), deux sites de maturations par clivage ainsi qu’un domaine riche en phosphorylation, des domaines PDZ et un domaine d’interaction avec des récepteurs nucléaires et des facteurs de transcription. A partir d’un polypeptide de 180 kDa, le clivage au niveau des sites identifiés produit un peptide de 145 kDa puis un de 90 kDa, révélés par western blot avec un anticorps dirigé contre la partie CTerminale de la protéine. Ce peptide de 90 kDa, après myristoylation, pourrait interagir avec des récepteurs nucléaires et des facteurs de transcriptions. Ces interactions nous ont permis de monter un modèle qui pourrait expliquer la diminution d’expression génique de différents gènes observés chez les malades PFIC1. Cette analyse a été poursuivie par une étude de l’interactome d’ATP8B1 qui a montré une interaction possible avec CFTR directement ou par l’intermédiaire d’une protéine de liaison, PDZK1. Une dernière étude a porté sur la fonctionnalité de CFTR dans deux lignées portant des mutations différentes d’ATP8B1. L’ensemble des résultats montre qu’ATP8B1 participerait à la régulation de l’expression du gène CFTR mais aussi à sa maturation fonctionnelle. / Human Progressive Familial Intrahepatic Cholestasis type 1 (PFIC1) is a rare genetic disease provoked by mutations inside the ATP8B1 gene resulting in a general loss of bile acids secretion. An episodic and less severe syndrome called Benign Recurrent Intrahepatic Cholestasis (BRIC) have also been associated with mutations in this gene. PFIC1 patients are suffering from many extra-hepatic manifestations. Some of these manifestations are common to Cystic Fibrosis (CF) patients, carrying mutations in CFTR gene. Moreover, expression of CFTR is decreased for some PFIC1 patients. This study was carried out to define the role of ATP8B1 in the modulation of CFTR gene expression and protein function. A first approach was to identify both gene expression and protein synthesis among various cell lines. Then, we developed a second approach based on in silico analysis of structure and function of ATP8B1 to construct a 2D model of the protein. This approach was correlated with the localization of known mutations of ATP8B1. This analysis showed two possible protein maturation sites, a rich phosphorylation domain and a nuclear receptor interacting domain. The cleavage of the 180 kDa peptide generates a 145kDa (ATPase) and a second cleavage produces a 90 kDa, all identified with a specific antibody directed toward the C-Terminal region of the protein. The 90 kDa peptide should be readdressed to the nucleus after myristoylation to interact with nuclear receptors and transcription factors. This analysis was completed by an interactomic approach which has shown a possible interaction between CFTR and ATP8B1 proteins either directly or mediated by a linker, PDZK1. The last part of this work was dedicated to assess the role of ATP8B1 on the activity of CFTR using two cell lines expressing two different mutated ATP8B1 genes. From all these results, we concluded that ATP8B1 is probably involved in the regulation of CFTR gene expression and CFTR maturation and function. We therefore propose a schematic representation of ATP8B1 synthesis and maturation associated with its putative biological functions in the cell.

Achromobacter xylosoxidans est un bacille à Gram négatif non fermentaire émergent dans la mucoviscidose. A Dijon, la prévalence de patients colonisés est élevée au Centre de Ressources et de Compétences de la Mucoviscidose par rapport à la moyenne nationale, et augmente également chez des patients hospitalisés atteints d’autres pathologies. Les réservoirs et le mode de contamination des patients sont inconnus.Les objectifs de ce travail étaient de décrire la situation épidémiologique dans notre CRCM et de mettre en évidence d’éventuelles sources de contamination pour les malades en Bourgogne.Dans une première étude rétrospective, toutes les souches d’A. xylosoxidans isolées chez les patients du CRCM depuis le début de leur suivi jusqu’en 2010 ont été analysées. Sur 120 patients, 21 ont présenté au moins une culture positive. Le génotypage par électrophorèse en champ pulsé n’a montré que de rares cas de transmissions croisées. Les résistances acquises aux antibiotiques sont fréquentes : ciprofloxacine (dès primocolonisation), ceftazidime et carbapénèmes (colonisations chroniques). Notre protocole de détection d’A. xylosoxidans dans l’environnement a permis d’isoler 50 souches (lavabos, douches, rivières, lacs) : 33 à l’hôpital, 9 à domicile et 8 dans la nature. Ces isolats partagent des caractéristiques avec les souches cliniques : 6 génotypes communs et résistance constante à la ciprofloxacine. Le risque de contamination des patients à domicile ou à l’hôpital est donc réel.D’autres études sont en cours afin de mieux comprendre l’émergence de cette bactérie, ses mécanismes de résistance acquise aux antibiotiques et les facteurs favorisant sa sélection dans l’environnement. / Achromobacter xylosoxidans is an aerobic nonfermentative Gram-Negative rod considered as an important emerging pathogen among cystic fibrosis (CF) patients worldwide. In Dijon (Burgundy), the prevalence of colonised patients is high among CF patients and increasing among non-CF hospitalised patients. The natural habitat of this organism as well as the possible sources of patient contamination remain unknown.The aims of this study were to report the first epidemiological data about A. xylosoxidans in a French CF centre and to identify potential reservoirs of this organism in Burgundy. In a retrospective study, all the isolates recovered from the patients affiliated with our centre in 2010 since their first visit were analysed. Out of 120 patients, 21 (17.5%) had at least one positive culture with A. xylosoxidans. Genotyping analysis by Pulsed Field Gel Electrophoresis revealed that cross-Contamination was very rare. Acquired resistance was frequent to ciprofloxacin (since primocolonisation), to ceftazidime and to carbapenems (in persistent colonisations). Thanks to our protocol designed to detect A. xylosoxidans in environment, a total of 50 strains were isolated in hospital (33 isolates), domestic (9 isolates) and outdoor (8 isolates) samples, mainly in handwashing sinks, showers, and water. These environmental isolates shared characteristics with clinical ones: 6 genotypes in common and a constant resistance to ciprofloxacin. These results reveal potential sources of contamination for the patients at home or in hospital. Further studies are needed to help understanding the emergence of this bacterium and the mechanisms involved in acquired antibiotic resistance.

Les pompes d'efflux sont des complexes macromoléculaires qui permettent l'efflux des antibiotiques à travers les deux membranes (interne et externe). Ces pompes, spécifiques des bactéries Gram négatif, constituent l'un des acteurs majeurs du phénomène de résistance aux antibiotiques, en contribuant ainsi à la résistance intrinsèque et acquise de ces bactéries à de nombreuses molécules utilisées en antibiothérapie. Chez P. aeruginosa, ces pompes appartiennent pour la plupart à la famille des transporteurs RND. Ce sont des complexes tripartites constitués d'un transporteur de la membrane interne (RND), d'un adaptateur périplasmique (MFP) et d'un canal de la membrane externe (OMF). Ces composants ont été caractérisés individuellement chez de nombreuses bactéries. Cependant, les mécanismes qui régissent l'assemblage et la dissociation de la pompe, essentiels pour son fonctionnement, demeurent mal compris. Nous nous sommes donc intéressés au cours de ce travail aux pompes à efflux de Pseudomonas aeruginosa. Nous avons notamment procédé à la caractérisation structurale du canal OprN de la pompe MexEF-OprN impliquée dans la résistance aux fluoroquinolones et à la caractérisation biophysique du transporteur RND MexY de la pompe MexXY-OprM, spécifique des aminoglycosides. Nous avons étudié en parallèle le mécanisme d'ouverture du canal OprM seul in vitro (aspects structuraux) et in vivo (aspects fonctionnels) au sein de la pompe assemblée. Nos résultats montrent que les OMFs de P. aeruginosa présentent des similitudes avec les OMFs d'autres bactéries Gram négatif, mais également des différences, notamment pour OprN et OprM au niveau de l'interaction avec leurs partenaires ou encore pour OprM concernant l'ouverture du canal. Nous avons par ailleurs participé à l'étude in vitro de l'assemblage et du transport à travers la pompe MexAB-OprM, reconstituée au sein de protéoliposomes, confirmant l'importance de l'acylation de la MFP dans la formation du complexe et montrant l'importance de la force proto-motrice dans l'assemblage de la pompe mais pas dans sa dissociation. En parallèle de l'étude des pompes à efflux, nous nous sommes intéressés à un autre système de résistance, impliqué dans la dégradation des antibiotiques. Nous avons donc réalisé, en collaboration avec le Pr Patrick Plésiat (laboratoire de Bactériologie de Besançon), la modélisation de mutants de la beta-lactamase AmpC de P. aeruginosa, permettant de lier les effets fonctionnels observés à des hypothèses de modifications conformationnelles. / Multidrug efflux systems are membrane transport proteins that are used to translocate a wide variety of drugs across the inner and the outer membranes of Gram-negative bacteria, leading to natural and acquired antimicrobial resistances.Most of the multidrug transporters of P. aeruginosa belong to the resistance-nodulation-cell division (RND) superfamily.They function as three-component assemblies made of an inner membrane transporter (RND), a periplasmic membrane fusion protein (MFP) and an outer membrane factor channel (OMF). Along with functional studies, many crystal structures of the individual components of the pump have been solved but the interactions underlying the complex assembly and the opening mechanism of the outer channel remain unclear. In this study, we investigated structural and functional insights of P. aeruginosa efflux pumps. We solved the crystal structure of the MexEF-OprN efflux pump outer membrane channel OprN mainly involved in fluoroquinolones resistance. Our new structure highlights the differences between P. aeruginosa and other Gram-negative bacteria OMFs that could explain their specific interaction with the cognate MFP partners. We also purified and characterized the inner membrane transporter MexY from the MexXY-OprM efflux pump, which is the major determinant of aminoglycosides resistance in P. aeruginosa. Besides, we solved the crystal structure of a mutatedform of the outer membrane channel OprM in order to understand its opening mechanism. We also investigated in vivo effect of the OprM mutants in antibiotics resistance by MIC measurements and tried to correlate with the observed structural modifications leading to the open state. Moreover, we set up a new in vitro test allowing the investigation of the assembly of the MexAB-OprM efflux pump. Our results showed the importance of MexA and its lipid anchor in promoting and stabilizing the complex assembly. In addition, as a side project with the group of Pr Plésiat (laboratoire de Bactériologie de Besançon), we built different structural models of AmpC mutants from overproducing clinical isolates,showing the possible conformational changes that lead to the resistance increase.

La cholestase intra-hépatique familiale progressive de type 1 (PFIC1) humaine est une maladie génétique rare, provoquée par des mutations du gène ATP8B1, due à un défaut de sécrétion des acides biliaires. Un syndrome moins sévère, et épisodique, appelé Cholestase Intra-hépatique Récurrente Bénigne (BRIC) a pu être associé à des mutations au sein du même gène. Les patients PFIC1 souffrent de nombreuses manifestations extra-hépatiques. Certaines de ces manifestations sont communes aux patients mucoviscidosiques. Le niveau d’expression de CFTR, gène responsable de la mucoviscidose, est diminué chez les patients PFIC1. Cette étude a porté sur l’analyse des interactions/régulations entre CFTR et ATP8B1. Une première approche a été de montrer l’expression de ces gènes dans différentes lignées cellulaires puis d’identifier la présence de leurs protéines par western blot et immunofluorescence. Une seconde approche a été d’effectuer une analyse in silico de la structure d’ATP8B1 par rapport à sa fonction. Nous avons aussi localisés les modifications connues sur un modèle 2D. Cette analyse a permis de mettre en évidence en plus des sites connus (ATPase et domaines transmembranaires), deux sites de maturations par clivage ainsi qu’un domaine riche en phosphorylation, des domaines PDZ et un domaine d’interaction avec des récepteurs nucléaires et des facteurs de transcription. A partir d’un polypeptide de 180 kDa, le clivage au niveau des sites identifiés produit un peptide de 145 kDa puis un de 90 kDa, révélés par western blot avec un anticorps dirigé contre la partie CTerminale de la protéine. Ce peptide de 90 kDa, après myristoylation, pourrait interagir avec des récepteurs nucléaires et des facteurs de transcriptions. Ces interactions nous ont permis de monter un modèle qui pourrait expliquer la diminution d’expression génique de différents gènes observés chez les malades PFIC1. Cette analyse a été poursuivie par une étude de l’interactome d’ATP8B1 qui a montré une interaction possible avec CFTR directement ou par l’intermédiaire d’une protéine de liaison, PDZK1. Une dernière étude a porté sur la fonctionnalité de CFTR dans deux lignées portant des mutations différentes d’ATP8B1. L’ensemble des résultats montre qu’ATP8B1 participerait à la régulation de l’expression du gène CFTR mais aussi à sa maturation fonctionnelle. / Human Progressive Familial Intrahepatic Cholestasis type 1 (PFIC1) is a rare genetic disease provoked by mutations inside the ATP8B1 gene resulting in a general loss of bile acids secretion. An episodic and less severe syndrome called Benign Recurrent Intrahepatic Cholestasis (BRIC) have also been associated with mutations in this gene. PFIC1 patients are suffering from many extra-hepatic manifestations. Some of these manifestations are common to Cystic Fibrosis (CF) patients, carrying mutations in CFTR gene. Moreover, expression of CFTR is decreased for some PFIC1 patients. This study was carried out to define the role of ATP8B1 in the modulation of CFTR gene expression and protein function. A first approach was to identify both gene expression and protein synthesis among various cell lines. Then, we developed a second approach based on in silico analysis of structure and function of ATP8B1 to construct a 2D model of the protein. This approach was correlated with the localization of known mutations of ATP8B1. This analysis showed two possible protein maturation sites, a rich phosphorylation domain and a nuclear receptor interacting domain. The cleavage of the 180 kDa peptide generates a 145kDa (ATPase) and a second cleavage produces a 90 kDa, all identified with a specific antibody directed toward the C-Terminal region of the protein. The 90 kDa peptide should be readdressed to the nucleus after myristoylation to interact with nuclear receptors and transcription factors. This analysis was completed by an interactomic approach which has shown a possible interaction between CFTR and ATP8B1 proteins either directly or mediated by a linker, PDZK1. The last part of this work was dedicated to assess the role of ATP8B1 on the activity of CFTR using two cell lines expressing two different mutated ATP8B1 genes. From all these results, we concluded that ATP8B1 is probably involved in the regulation of CFTR gene expression and CFTR maturation and function. We therefore propose a schematic representation of ATP8B1 synthesis and maturation associated with its putative biological functions in the cell. / Réalisé en cotutelle avec l'Université de Cergy-Pontoise