Pseudomonas aeruginosa is resistant to many clinically-relevant antibiotics and this is partly attributable to multidrug efflux systems in this organism. One of these, MexEF-OprN, exports chloramphenicol, fluoroquinolones and trimethoprim and is positively regulated by MexT, encoded by the mexT gene that is located upstream of the efflux genes. MexT also positively regulates the mexS gene that encodes an oxidoreductase of unknown function and whose loss increases expression of mexEF-oprN. A null mutation in the mexS gene of P. aeruginosa increased expression of two 3-gene operons, PA4354-PA4355-PA4356 and PA2813-2812-2811. This increased expression, which paralleled an increase in mexEF-oprN expression in the same mutant, was, like mexEF-oprN, MexT-dependent. The PA4356 (xenB) gene product is homologous to a xenobiotic reductase in P. fluorescens shown to remove nitro groups from trinitrotoluene and nitroglycerin. As nitration is a well-known result of nitrosative stress, a role for xenB (and the co-regulated mexEF-oprN and PA2813-2812-2811) in a nitrosative stress response was hypothesized and tested. Using S-nitrosoglutathione (GSNO) as a source of nitrosative stress, expression of mexEF-oprN, xenB and PA2811 was shown to be GSNO-inducible, though in the case of xenB and PA2811 this was only seen in a mutant lacking MexEF-OprN and only for xenB, this GSNO-inducible expression was dependent upon MexT. Consistent with MexT being required for mexEF-oprN and PA4354-PA4355-PA4356 expression, MexT bound to their promoter regions. Chloramphenicol, a nitroaromatic antimicrobial that is a substrate for MexEF-OprN and resembles a nitrosated nitrosative stress product accommodated by this efflux system induced expression of mexEF-oprN, but not xenB, or PA2811, and this was dependent upon the MexT regulator. In addition to MexT positive-regulating activity of genes in response to nitrosative stress, MexT also negatively regulates the expression of mexAB-oprM through direct binding to its promoter region and the oprD gene, encoding an outer membrane porin that provides a portal of entry for basic amino acids and carbapenem, whose expression was reduced only by GSNO. / Thesis (Ph.D, Microbiology & Immunology) -- Queen's University, 2011-05-15 20:59:57.018

Pseudomonas aeruginosa est un pathogène opportuniste à Gram-négatif, responsable d’infections nosocomiales chez des patients immunodéprimés et principale cause de morbidité et de mortalité chez les patients atteints de mucoviscidose. Les traitements utilisés contre P. aeruginosa peuvent être mis en échec en raison des nombreux mécanismes de résistance développés par la bactérie tels que les systèmes d’efflux RND, capables d’exporter les antibiotiques à l’extérieur de la cellule. Parmi ces systèmes, MexEF-OprN est très peu produit dans les souches sauvages mais il est surproduit chez les mutants appelés nfxC et conduit à une résistance aux fluoroquinolones, au chloramphénicol et au triméthoprime. Ces mutants ont également la particularité de résister de façon concomitante aux carbapénèmes et d’être peu virulents. Notons enfin que la pompe MexEF-OprN est codée par un opéron à trois gènes, mexEF-oprN, dont la transcription est activée par MexT, un régulateur appartenant à la famille LysR.Les mutants nfxC étant peu décrits dans le contexte clinique, nous avons évalué leur prévalence et caractérisé les événements génétiques conduisant à la surexpression de mexEF-oprN. A partir d’une collection de 221 souches cliniques isolées au CHRU de Besançon, et sélectionnées en raison de leur sensibilité diminuée à la ciprofloxacine et à l’imipénème, 19.5% surexprimaient mexEF-oprN. Nous avons par la suite caractérisé 22 souches non-redondantes et montré que seulement 13.6% d’entre elles possédaient des mutations inactivatrices dans le gène mexS alors que 40.9% avaient des mutations conduisant à la substitution d’un seul acide-aminé. Il est apparu que ces dernières mutations avaient des effets modérés sur les profils de résistance et de virulence alors que les mutations inactivatrices donnaient des hauts niveaux de résistance mais aucune virulence. Enfin, nous n’avons pas pu identifier de mutations génétiques pouvant expliquer la surexpression de mexEF-oprN des 45.5% de souches restantes, suggérant l’existence des mécanismes de régulation encore inconnus de cet opéron.Nous avons donc étudié des mutants résistants au chloramphénicol, sélectionnés in vitro à partir de la souche de référence PA14. Leur caractérisation nous a permis de découvrir un nouveau type de mutants surproducteurs de MexEF-OprN que nous avons appelé nfxC2. Tous possédaient des mutations gain-de-fonction sur le gène PA14_38040 (nommé cmrA) codant pour un régulateur de la famille AraC, jamais étudié auparavant. Chez les mutants nfxC2, l’expression de cmrA est augmentée, ainsi que celle de l’opéron mexEF-oprN et ceci, d’une façon MexS- et MexT-dépendante. De façon intéressante, ces mutations dans cmrA font apparaître un phénotype résistant sans toutefois altérer la virulence de la souche. Une analyse transcriptomique a montré que CmrA pouvait activer l’expression de 11 gènes parmi lesquels PA14_38020 apparaît comme étant nécessaire pour l’activation indirecte de mexEF-oprN. Ce gène code pour une quinol monooxygenase partageant des domaines conservés avec YgiN, une enzyme d’Escherichia coli qui participe à la réponse contre les électrophiles. D’ailleurs, l’exposition de la souche PA14 à des concentrations sub-inhibitrices d’électrophiles toxiques (glyoxal, méthylglyoxal et cinnamaldéhyde) active suffisamment la pompe MexEF-OprN pour générer un phénotype de résistance et ce, de façon CmrA-dépendante. Enfin, cette même exposition aux électrophiles active également deux autres pompes RND, à savoir MexAB-OprM et MexXY/OprM. Les voies de régulation conduisant à l’activation de ces deux opérons d’efflux seront étudiées prochainement au laboratoire. / Pseudomonas aeruginosa is a Gram negative opportunistic pathogen, responsible for several nosocomial infections in immunocompromised patients, and the main cause of mortality and morbidity of patients suffering from cystic fibrosis. Treatment of P. aeruginosa infections turns to be difficult due to its natural resistance to antibiotics, increased in part by the overproduction of RND efflux pumps capable to export antibiotics out of the cell. Amongst these systems, MexEF-OprN exports several antibiotics such as fluoroquinolones, chloramphenicol and trimethoprim. This efflux pump is quiescent in wild-type strains but it is highly produced in nfxC mutants, making them resistant to MexEF-OprN substrates. In addition, these mutants are characterized by their concomitant resistance to carbapenems and their low-virulence profile. MexEF-OprN is encoded by a three-gene operon, mexEF-oprN, whose transcription is activated by MexT, a member of the LysR family of transcriptional regulators. In the clinical context, nfxC mutants being poorly described, we evaluated their prevalence and characterized the genetic events responsible for mexEF-oprN overexpression. A collection of 221 clinical isolates from the University Hospital of Besançon exhibiting a reduced susceptibility to ciprofloxacin and imipenem was screened. We found that 19.5% of these strains overexpressed mexEF-oprN and further characterization of the 22 non-redundant mutants showed that only 13.6% of these mutants harbored a disrupted mexS gene. Moreover, 40.9% of nfxC clinical strains harbored missense mutations in mexS conducing to the substitution of a single amino-acid residue in the encoding protein. Interestingly, these mutations were associated to moderate effects on resistance and virulence factor production while disruptive mutations produced highly resistant but completely non-virulent strains. For the 45.5% of remaining strains, we failed to identify genetic mutations, which could explain mexEF-oprN overexpression; this indirectly suggested that there might be additional regulatory loci controlling the expression of this operon.We thus studied chloramphenicol resistant mutants selected in vitro derived from reference strain PA14 and found a new class of MexEF-OprN overproducers, which we called nfxC2, harboring gain-of-function mutations in a so-far uncharacterized gene, PA14_38040 (hereafter called cmrA) coding for an AraC transcriptional regulator. In nfxC2 mutants, the mutated CmrA increases its proper gene expression and upregulates the expression of mexEF-oprN through MexS and MexT, resulting in a multi-drug resistant phenotype without altering virulence factor production. Transcriptomic experiments showed that CmrA positively regulates the expression of 11 genes, including PA14_38020, which is required for the MexS/MexT-dependent activation of mexEF-oprN. Gene PA14_38020 is predicted to code a quinol monooxygenase sharing conserved domains with YgiN of Escherichia coli, which was reported to be involved in the response of the bacterium to electrophiles. Interestingly, exposure of strain PA14 to sub-inhibitory concentrations of toxic electrophiles (glyoxal, methylglyoxal or cinnamaldehyde) strongly activates the CmrA-pathway and upregulates mexEF-oprN sufficiently to provoke the resistance to the pump substrates. Finally, we found that the same exposure to electrophiles is capable to activate two other RND pumps, MexAB-OprM and MexXY/OprM. The regulatory pathways conducing to activation of these two efflux operons will be elucidated at the laboratory.

Pseudomonas aeruginosa est un pathogène opportuniste majeur des patients atteints de mucoviscidose. Les infections à P. aeruginosa sont souvent difficiles à traiter, notamment en raison de sa capacité à développer des résistances à plusieurs familles d'antibiotiques. Dans les années 1980, les carbapénèmes font leur apparition dans l'arsenal anti-pyocyanique. Toutefois, les premiers cas de résistance apparaissent rapidement en raison de la« perte» de la porine OprD, voie d'entrée spécifique de ces antibiotiques dans la bactérie. L'étude de 173 souches cliniques de P. aeruginosa, a permis de caractériser les mécanismes à l'origine de cette résistance. La perte de la porine résulte de mutations inactivant le gène oprD ou se traduisant par des substitutions d'acides aminés responsables d'altérations structurales de la porine. Le gène oprD peut également être réprimé par certains régulateurs de pompes d'efflux telles que MexEF-OprN. La surproduction de ce système suite à l'inactivation d'une oxydoréductase, MexS, chez les mutants nfxC in vitro, confère une résistance conjointe à plusieurs familles d'antibiotiques ainsi que la perte de la production de nombreux facteurs de virulence. Toutefois, les altérations retrouvées dans la protéine MexS de 22 mutants nfYC cliniques sont majoritairement des substitutions d'acides aminés qui compromettent peu la virulence. L'origine de la surproduction de la pompe MexEF-OprN et de la multi-résistance qui lui est associée chez les souches cliniques s'est révélée indépendante de mutations dans le gène mexS chez près de la moitié des isolats, indiquant indirectement la participation d'autres gènes dans la régulation de ce système d' efflux. / Pseudomonas aeruginosa is an opportunistic pathogen which contributes to the decline of respiratory function in cystic fibrosis patients. Shortly after infection, the bacterium is able to develop various strategies to resist antibiotics of different classes. ln 1980's, new antibiotics, called carbapenems, are developed for anti-pyocyanic treatments. However, isolation of carbapenem resistant clinical strains of P. aeruginosa increases. Resistance to carbapenem mainly results from loss of porin OprD, the major route of entry of these molecules in the bacteria. Aim of this study is to characterize the mechanisms of this resistance through 173 clinical isolates of P. aeruginosa. Loss of porin OprD is mostly due to mutations inactivating oprD gene or generating deleterious amino-acid substitutions in the porin structure. Gene oprD can also be down-regulated by efflux system regulators such as Mexî, the transcriptional activator of MexEF-OprN efflux pump. Overexpression of mexEF-oprN in laboratory-selected nfxC mutants is caused by inactivation of an oxydoreductase, MexS, leading to resistance to fluoroquinolones, chloramphenicol and carbapenem and loss of production of several virulence factors. Analysis of 22 non-redundant clinical nfxC mutants showed that (i) in contrast to in vitro selected counterparts only 3 of them harbored a disrupted gene mexS, (ii) 9 contained amino-acid substitutions in MexS associated with moderate effects on resistance an virulence factors production and (iii) 1 O did not display mutations in any of the regulators known to control mexEF-oprN expression, indicating that other loci are responsible for the pump upregulation.

Les pompes d'efflux sont des complexes macromoléculaires qui permettent l'efflux des antibiotiques à travers les deux membranes (interne et externe). Ces pompes, spécifiques des bactéries Gram négatif, constituent l'un des acteurs majeurs du phénomène de résistance aux antibiotiques, en contribuant ainsi à la résistance intrinsèque et acquise de ces bactéries à de nombreuses molécules utilisées en antibiothérapie. Chez P. aeruginosa, ces pompes appartiennent pour la plupart à la famille des transporteurs RND. Ce sont des complexes tripartites constitués d'un transporteur de la membrane interne (RND), d'un adaptateur périplasmique (MFP) et d'un canal de la membrane externe (OMF). Ces composants ont été caractérisés individuellement chez de nombreuses bactéries. Cependant, les mécanismes qui régissent l'assemblage et la dissociation de la pompe, essentiels pour son fonctionnement, demeurent mal compris. Nous nous sommes donc intéressés au cours de ce travail aux pompes à efflux de Pseudomonas aeruginosa. Nous avons notamment procédé à la caractérisation structurale du canal OprN de la pompe MexEF-OprN impliquée dans la résistance aux fluoroquinolones et à la caractérisation biophysique du transporteur RND MexY de la pompe MexXY-OprM, spécifique des aminoglycosides. Nous avons étudié en parallèle le mécanisme d'ouverture du canal OprM seul in vitro (aspects structuraux) et in vivo (aspects fonctionnels) au sein de la pompe assemblée. Nos résultats montrent que les OMFs de P. aeruginosa présentent des similitudes avec les OMFs d'autres bactéries Gram négatif, mais également des différences, notamment pour OprN et OprM au niveau de l'interaction avec leurs partenaires ou encore pour OprM concernant l'ouverture du canal. Nous avons par ailleurs participé à l'étude in vitro de l'assemblage et du transport à travers la pompe MexAB-OprM, reconstituée au sein de protéoliposomes, confirmant l'importance de l'acylation de la MFP dans la formation du complexe et montrant l'importance de la force proto-motrice dans l'assemblage de la pompe mais pas dans sa dissociation. En parallèle de l'étude des pompes à efflux, nous nous sommes intéressés à un autre système de résistance, impliqué dans la dégradation des antibiotiques. Nous avons donc réalisé, en collaboration avec le Pr Patrick Plésiat (laboratoire de Bactériologie de Besançon), la modélisation de mutants de la beta-lactamase AmpC de P. aeruginosa, permettant de lier les effets fonctionnels observés à des hypothèses de modifications conformationnelles. / Multidrug efflux systems are membrane transport proteins that are used to translocate a wide variety of drugs across the inner and the outer membranes of Gram-negative bacteria, leading to natural and acquired antimicrobial resistances.Most of the multidrug transporters of P. aeruginosa belong to the resistance-nodulation-cell division (RND) superfamily.They function as three-component assemblies made of an inner membrane transporter (RND), a periplasmic membrane fusion protein (MFP) and an outer membrane factor channel (OMF). Along with functional studies, many crystal structures of the individual components of the pump have been solved but the interactions underlying the complex assembly and the opening mechanism of the outer channel remain unclear. In this study, we investigated structural and functional insights of P. aeruginosa efflux pumps. We solved the crystal structure of the MexEF-OprN efflux pump outer membrane channel OprN mainly involved in fluoroquinolones resistance. Our new structure highlights the differences between P. aeruginosa and other Gram-negative bacteria OMFs that could explain their specific interaction with the cognate MFP partners. We also purified and characterized the inner membrane transporter MexY from the MexXY-OprM efflux pump, which is the major determinant of aminoglycosides resistance in P. aeruginosa. Besides, we solved the crystal structure of a mutatedform of the outer membrane channel OprM in order to understand its opening mechanism. We also investigated in vivo effect of the OprM mutants in antibiotics resistance by MIC measurements and tried to correlate with the observed structural modifications leading to the open state. Moreover, we set up a new in vitro test allowing the investigation of the assembly of the MexAB-OprM efflux pump. Our results showed the importance of MexA and its lipid anchor in promoting and stabilizing the complex assembly. In addition, as a side project with the group of Pr Plésiat (laboratoire de Bactériologie de Besançon), we built different structural models of AmpC mutants from overproducing clinical isolates,showing the possible conformational changes that lead to the resistance increase.