L’objectif de cette thèse a été d’élaborer une stratégie de détoxification la quantité d'un composé intracellulaire en permettant sa sortie hors de la cellule via l'utilisation d'un système d’efflux.L’hôte choisi pour cette étude est un nouvel organisme modèle, Deinococcus geothermalis. Nous avons utilisé les pompes d'efflux comme outils biologique pour permettre la sortie d'un composé devenu toxique en intracellulaire. Pour ce faire, nous avons dans un premier temps inséré par recombinaison homologue une sélection de gènes codant pour des pompes d’efflux hétérologues dans le chromosome de D. geothermalis. Puis la seconde étape a été de déterminé la susceptibilité des recombinants obtenus vis à vis de composés à forte valeur ajoutée. Un certain nombre de recombinants présentant une résistance plus élevée que la souche sauvage à plusieurs composés ont alors été sélectionnés. L'étape suivante a été de vérifier que le gain de résistance observé était effectivement dû à l’insertion dans l’enveloppe bactérienne d’une pompe d’efflux fonctionnelle. Pour ce faire, des tests d’efflux employant un marqueur fluorescent, le composé Hoechst 33342 ou avec un antibiotique fluorescent ont été réalisés. Nous avons réussi à obtenir la preuve de concept qu' un gène codant pour une pompe d'efflux hétérologue pouvait conduire à l'expression d'une protéine fonctionnelle chez D. geothermalis et cette protéine membranaire permettait la diminution la quantité intracellulaire d'un composé donné. / The objective of this thesis was to develop a strategy for detoxifying the amount of an intracellular compound by allowing its exit from the cell through the use of an efflux system.The host chosen for this study is a new model organism, Deinococcus geothermalis. We used efflux pumps as biological tools to allow the release of a compound that became toxic intracellularly. To do this, we first inserted by homologous recombination a selection of genes encoding heterologous efflux pumps into the D. geothermalis chromosome. Then the second step was to determine the susceptibility of the recombinants obtained to high value-added compounds. A number of recombinants with higher resistance than the wild multi-compound strain were then selected. The next step was to verify that the observed resistance gain was indeed due to the insertion of a functional efflux pump into the bacterial shell. To do this, efflux tests using a fluorescent marker, Hoechst compound 33342 or with a fluorescent antibiotic were performed. We were able to obtain proof of concept that a gene encoding a heterologous efflux pump could lead to the expression of a functional protein in D. geothermalis and that this membrane protein allowed the intracellular amount of a given compound to be decreased.

Burkholderia pseudomallei est l’agent causal de la mélioïdose, une maladie tropicale endémique dans le Nord de l’Australie et en Asie du Sud-Est. Nous avons analysé le système d’efflux, mécanisme majoritairement impliqué la multi-résistance aux antibiotiques. Nous avons chercher à identifier des mutations dans les pompes d’efflux et des modulation de l’expression de ces dernières afin d’expliquer ces phénotypes de résistance. Les techniques de séquençage de l’ADN et de transcriptomique par RT-qPCR nous ont permis d’identifier deux mécanismes chez des souches cliniques. Un mécanisme transitoire responsable d'une résistance croisée du Cotrimoxazole, avec les quinolones, et le chloramphénicol, pour lequel nous suspectons une modulation de l’expression de l’efflux. Le second, impliqué dans la résistance au méropénème, par surexpression de l'efflux suite à une mutation dans le régulateur de la pompe AmrAB-OprA.Dans un second axe de recherche, nous avons également criblé plusieurs molécules afin d'identifier des candidats inhibiteurs de l'efflux, dérivant de la famille des phénothiazines et capables de restaurer une sensibilité aux antibiotiques. Nous avons analysé l’impact de ces molécules sur des souches modèles de multi-résistance (Burkholderia thailandensis) et sur des souches cliniques et environnementales de B. pseudomallei. Ces molécules sont capables d’impacter l’expression de l’efflux, mais nous pensons que le mécanisme majeur d’inhibition de cette famille de molécules reste l’entrée en compétition avec les antibiotiques efflués. Nous avons identifié une molécule, AST17, capable de restaurer la sensibilité au Cotrimoxazole, ainsi qu'aux quinolones. / Burkholderia pseudomallei is thecausal agent of melioidosis, a tropical disease, endemic in Notrhern Australia and South-East Asia. We have analyzed efflux systeme, known to be one of the main mecanism implicated in antibiotic resistance phenotypes. We have looked for mutations in efflux pumps and for transient modulations of the efflux pumps expression, that could explain resistance phenotypes. Whole genome sequencing and a the targeted method of RT-qPCR allowed us to identified two mecanisms in clinical strains. A transient mecanism, responsible of a cross-resistance to Cotrimoxazole, quinolones and chloramphenicol, and we suspect an implication of modulation of efflux. The second one is implicated in meropenem resistance by an overexpression of the AmrAB-OprA efflux pumps, due to a mutation of its regulator. In a second time, we also have screened several compounds, all derivated from phenothiazines, in order to identify efflux pump inhibitors for a restoration of the antibiotic susceptibility. We have analyzed the impact of these molecules in multi-resistant strain models, and on several clinical and environnemental strains. These molecules are able to modulate efflux pumps expression, however, we think that the main inhibition mecanism of these derivatives is about a competition between the molecule and the antibiotics. We have identified one molecule, AST17, that is able to restore Cotrimoxazole and quinolones susceptibilities.

La diffusion des entérobactéries multirésistantes aux antibiotiques (MDR) à l’échelle mondiale constitue une menace de santé publique majeure. Résistantes à au moins trois classes d’antibiotiques, les entérobactéries MDR entrainent des infections échappant aux traitements de première intention. La première partie de ce travail s’intéresse à l’épidémiologie moléculaire des souches d’entérobactéries MDR isolées dans les infections et les colonisations des patients hospitalisés en Languedoc-Roussillon, en France, et dans un pays où cette épidémiologie est encore peu connue, l’Algérie. Nous avons montré, dans notre région et au niveau national, que la résistance aux carbapénèmes était essentiellement liée à des modifications de la perméabilité membranaire (87,4% des entérobactéries résistantes, au niveau national). Dans la deuxième partie de ce travail, nous avons étudié les modulations de la perméabilité membranaire et de l’efflux chez Escherichia coli ST131, l’exemple-type d’un clone MDR. Nous avons montré que ce clone mondial présentait une remarquable adaptabilité à la pression antibiotique. Cette adaptabilité avait un impact significatif sur la virulence et le fitness de E. coli. Les capacités de formation de biofilm et la virulence chez Caenorhabditis elegans étaient augmentées chez les souches de phénotypes « efflux ». Inversement, les souches de phénotypes « imperméabilité » présentaient un faible potentiel de virulence, associé à une diminution significative de la formation de biofilm et de la mobilité par swimming. / The spread of multidrug-resistant (MDR) Enterobacteriaceae is a major public health threat worldwide. Resistant to at least three classes of antibiotics, MDR Enterobacteriaceae cause infections for which first-line treatments are inefficient. The first part of this work focused on the molecular epidemiology of MDR Enterobacteriaceae strains isolated in infections and colonizations of patients hospitalized in Languedoc-Roussillon, in France and in Algeria, a country where few data are currently available. We showed in our region and nationally, that resistance to carbapenems was mainly due to changes in membrane permeability (87.4% of resistant Enterobacteriaceae, nationally).In the second part of this work, we studied the modulation of membrane efflux and permeability in the quintessential example of an international MDR high-risk clone, Escherichia coli ST131. We showed that this global clone had a remarkable adaptability to antibiotic pressure. This adaptability had a significant impact on the virulence and the fitness of E. coli. The biofilm formation and virulence capacities in Caenorhabditis elegans model were increased in strains overexpressing an efflux system. Conversely, the strains with altered porins expression had a low potential virulence, associated with a significant reduction in biofilm formation and swimming mobility.

Les pompes d'efflux sont des complexes macromoléculaires qui permettent l'efflux des antibiotiques à travers les deux membranes (interne et externe). Ces pompes, spécifiques des bactéries Gram négatif, constituent l'un des acteurs majeurs du phénomène de résistance aux antibiotiques, en contribuant ainsi à la résistance intrinsèque et acquise de ces bactéries à de nombreuses molécules utilisées en antibiothérapie. Chez P. aeruginosa, ces pompes appartiennent pour la plupart à la famille des transporteurs RND. Ce sont des complexes tripartites constitués d'un transporteur de la membrane interne (RND), d'un adaptateur périplasmique (MFP) et d'un canal de la membrane externe (OMF). Ces composants ont été caractérisés individuellement chez de nombreuses bactéries. Cependant, les mécanismes qui régissent l'assemblage et la dissociation de la pompe, essentiels pour son fonctionnement, demeurent mal compris. Nous nous sommes donc intéressés au cours de ce travail aux pompes à efflux de Pseudomonas aeruginosa. Nous avons notamment procédé à la caractérisation structurale du canal OprN de la pompe MexEF-OprN impliquée dans la résistance aux fluoroquinolones et à la caractérisation biophysique du transporteur RND MexY de la pompe MexXY-OprM, spécifique des aminoglycosides. Nous avons étudié en parallèle le mécanisme d'ouverture du canal OprM seul in vitro (aspects structuraux) et in vivo (aspects fonctionnels) au sein de la pompe assemblée. Nos résultats montrent que les OMFs de P. aeruginosa présentent des similitudes avec les OMFs d'autres bactéries Gram négatif, mais également des différences, notamment pour OprN et OprM au niveau de l'interaction avec leurs partenaires ou encore pour OprM concernant l'ouverture du canal. Nous avons par ailleurs participé à l'étude in vitro de l'assemblage et du transport à travers la pompe MexAB-OprM, reconstituée au sein de protéoliposomes, confirmant l'importance de l'acylation de la MFP dans la formation du complexe et montrant l'importance de la force proto-motrice dans l'assemblage de la pompe mais pas dans sa dissociation. En parallèle de l'étude des pompes à efflux, nous nous sommes intéressés à un autre système de résistance, impliqué dans la dégradation des antibiotiques. Nous avons donc réalisé, en collaboration avec le Pr Patrick Plésiat (laboratoire de Bactériologie de Besançon), la modélisation de mutants de la beta-lactamase AmpC de P. aeruginosa, permettant de lier les effets fonctionnels observés à des hypothèses de modifications conformationnelles. / Multidrug efflux systems are membrane transport proteins that are used to translocate a wide variety of drugs across the inner and the outer membranes of Gram-negative bacteria, leading to natural and acquired antimicrobial resistances.Most of the multidrug transporters of P. aeruginosa belong to the resistance-nodulation-cell division (RND) superfamily.They function as three-component assemblies made of an inner membrane transporter (RND), a periplasmic membrane fusion protein (MFP) and an outer membrane factor channel (OMF). Along with functional studies, many crystal structures of the individual components of the pump have been solved but the interactions underlying the complex assembly and the opening mechanism of the outer channel remain unclear. In this study, we investigated structural and functional insights of P. aeruginosa efflux pumps. We solved the crystal structure of the MexEF-OprN efflux pump outer membrane channel OprN mainly involved in fluoroquinolones resistance. Our new structure highlights the differences between P. aeruginosa and other Gram-negative bacteria OMFs that could explain their specific interaction with the cognate MFP partners. We also purified and characterized the inner membrane transporter MexY from the MexXY-OprM efflux pump, which is the major determinant of aminoglycosides resistance in P. aeruginosa. Besides, we solved the crystal structure of a mutatedform of the outer membrane channel OprM in order to understand its opening mechanism. We also investigated in vivo effect of the OprM mutants in antibiotics resistance by MIC measurements and tried to correlate with the observed structural modifications leading to the open state. Moreover, we set up a new in vitro test allowing the investigation of the assembly of the MexAB-OprM efflux pump. Our results showed the importance of MexA and its lipid anchor in promoting and stabilizing the complex assembly. In addition, as a side project with the group of Pr Plésiat (laboratoire de Bactériologie de Besançon), we built different structural models of AmpC mutants from overproducing clinical isolates,showing the possible conformational changes that lead to the resistance increase.