Chez P. aeruginosa, la surproduction constitutive du système MexXY/OprM s'accompagne d'une augmentation de larésistance aux aminosides, fluoroquinolones et à certaines (3-lactamines. La caractérisation des mécanismes génétiquesconduisant à la surproduction de cette pompe parmi une collection de 57 isolats cliniques non redondants a permisd'identifier 3 types de mutations affectant, soit le gène mexZ dont le produit réprime l'opéron mexXY (mutants agrZ,77,2%), soit les gènes parRS codant pour un système à deux composants (mutants agrWl, 8,8%) ou d'autres cibles dontl'inactivation perturbe la synthèse protéique et entraîne la surexpression du gène PA5471 dont le produit, ArmZ, est unanti-répresseur de MexZ (mutants agrWl,\4%). Si certaines populations de P. aeruginosa tendent à devenir plusrésistantes aux aminosides en surproduisant le système MexXY/OprM, d'autres évoluent paradoxalement vers unehypersensibilité aux p-lactamines sous l'effet de mutations inactivant MexAB-OprM (MexAB-). L'analyse d'unecollection de 275 souches isolées de 36 patients CF nous a permis d'identifier des souches MexAB- hypersensibles à laticarcilline (37%) et des souches MexAB- non hypersensibles en raison d'une surproduction de la B-lactamase AmpC(16%). Au total, 53% des isolats sont apparus déficients dans le système MexAB-OprM. L'étude de l'activité ou de laproduction de divers facteurs de virulence a indiqué que la perte de fonction de MexAB-OprM n'était pas associée àcelle de caractères de virulence. Au final, notre travail apporte un éclairage nouveau sur la capacité de P. aeruginosa àmoduler l'activité de ses pompes d'efflux pour s'adapter à diverses situations cliniques. / Pseudomonas aeruginosa is a nosocomial pathogen naturally resistant to many antibiotics thanks to numerous resistantmechanisms. Among them, overproduction of the MexXY/OprM efflux System leads to decrease significantly thesusceptibility of P. aeruginosa to aminoglycosides, fluoroquinolones and some p-lactams. Characterization of geneticmechanisms leading to overproduction of this pump from a collection of 57 non-redundant clinical isolates enable toidentified three types of mutations affecting either the gene mexZ whose product represses mexXY operon (agrZmutants, «=77. 2%), or genes parRS encoding a two component System (agrW2 mutants, w=8.8%) or other targetswhose inactivation disturbs protein synthesis and results in overexpression of the gene PA547I, whose product ArmZ isan anti-repressor of MexZ protein (agrWl mutants, n= 14%). If some populations of A aeruginosa are becoming moreresistant to aminoglycosides by overproducing MexXY/OprM system, others develop an hypersensitivity to P-lactamsas a resuit of mutations inactivating MexAB-OprM efflux system (MexAB-). The analysis of 275 strains isolated from36 CF patients allowed us to identify MexAB- strains hypersensitive to ticarcillin (37%) and non-MexABhypersensitive strains due to an overproduction of the p-lactamase AmpC (16%). In fine, 53% of the isolates appeareddeficient in MexAB-OprM. The study of various virulence factors indicated that the loss of function of MexAB-OprMin P. aeruginosa was not associated with virulence of the strains. To conclude, our work highlight on the ability ofP. aeruginosa to modulate the activity of its efflux pumps in order to adapt to various clinical environments

Chemotherapeutic treatment of Pseudomonas aeruginosa, a Gram-negative opportunistic pathogen, is substantially challenged by several membrane-spanning, multidrug-efflux pumps of the three-component RND family. Of these pumps, MexXY-OprM contributes to the intrinsic resistance of this organism by exporting clinically relevant antibiotics, most notably the ribosome-targeting aminoglycosides. Overproduction of MexXY-OprM is the most common mechanism providing pan-aminoglycoside resistance to P. aeruginosa cystic fibrosis clinical isolates. The mexXY genes are located in an operon, the expression of which is induced by ribosome-targeting antimicrobials. The mexXY operon is negatively regulated by MexZ, a repressor protein encoded by the divergently-transcribed gene mexZ. A second gene, PA5471, is also induced by ribosome-targeting antibiotics and is required for antibiotic induction of mexXY expression. One possibility is that PA5471 interacts with MexZ to alleviate repression of mexXY, thereby providing a mechanism for PA5471-dependent drug inducibility of mexXY. PA5471 interaction with MexZ was confirmed using a bacterial two-hybrid assay. To identify residues/regions of PA5471 important for interaction with MexZ, random chemical mutagenesis of the mexZ and PA5471 genes was carried out and the effects of these mutations on interaction of their protein products was assessed using the bacterial two-hybrid assay. Mutations of PA5471 that compromised interaction with MexZ included P68S, G76C, R216C, R221W, R221Q, G231D, and G252S, which occur within or in close proximity to a predicted surface-exposed α-helix of a PA5471 structural model that may contribute to the MexZ-interaction domain. Representative mutations P68S, G76C, R216C and R221W were placed into the chromosome of P. aeruginosa to assess their impact on drug-inducible mexXY expression. All of these mutations significantly reduced mexX upregulation in the presence of spectinomycin, where mutations R216C and R221W resulted in the near complete ablation of this antibiotic induction. These data suggest that PA5471 acts as a direct antirepressor of MexZ and that this interaction is key to mexXY upregulation in response to ribosome-targeting induction signals. / Thesis (Master, Microbiology & Immunology) -- Queen's University, 2013-02-26 13:32:39.307

L'utilisation d'antibiotiques pour lutter contre les infections bactériennes a favorisé l'émergence de souches résistantes. Comprendre les mécanismes de résistance est crucial pour lutter contre ces pathogènes. Cette thèse propose une étude structurale d'une pompe à efflux multidrogues de Pseudomonas aeruginosa qui se compose d'un transporteur MexB, d'une protéine canal OprM et d'une protéine adaptateur MexA. Les partenaires du complexe tripartite stabilisés en nanodisques ont permis la formation du complexe in vitro. L'optimisation des conditions de production du complexe a permis de cribler les différents paramètres régissant son assemblage. L'étude structurale par cryo-ME révèle un complexe de 30 nm de long en conformation de repos. L'étude de la stabilisation des protéines membranaires par nanodisques a conduit au développement d'un système minimal, débarrassé des lipides. Ce système minimal a révélé la nécessité d'une phase lipidique autour de MexB pour l'assemblage du complexe. / Antibiotics use against bacterial infections has led to the emergence of resistance. Understanding the mechanisms underlying resistance to antibiotics is critical to fight against these pathogens. This thesis presents a structural study of a multidrug efflux pump in Pseudomonas aeruginosa, composed of a transporter MexB, an exit duct OprM and an adaptor protein MexA. The proteins reconstituted in nanodiscs allowed tripartite complex formation in vitro. Optimization of yield led to the identification of key parameters governing complex assembly. Structural cryo-EM study revealed a 30 nm long complex in a resting state. The study of membrane protein stabilization by nanodisks led to the development of a minimal system devoid of lipids. This system showed a lipid phase around MexB is required for complex formation.

Pseudomonas aeruginosa est une bactérie à Gram négatif à caractère ubiquitaire que l’on retrouve dans une grande diversité d’environnements. C’est un pathogène opportuniste qui est responsable chez l’homme d’infections chroniques ou aigües qui peuvent être mortelles pour des patients immuno-déficients. L’établissement d’une infection chronique est généralement associé à la capacité de la bactérie à former un biofilm, qui se définit comme une population bactérienne attachée sur une surface et englobée par une matrice extracellulaire formée entre autre depolysaccharides. La formation du biofilm est un processus bien défini dans le temps et dans l’espace et qui implique la mise en jeu de nombreuses structures de surfaces dont l’assemblage est strictement contrôlé. Une des voies de régulation contrôlant cet assemblage est le système à 2composants Roc1 (« regulation of cup genes »). Les gènes cup codent des composants de la voie « chaperone-usher » qui permet le transport de sous-unités pilines et leur assemblage à la surface bactérienne sous forme de pili. Ces pili Cup sont important dans l’établissement du biofilm. Le système Roc1 est aussi impliqué dans la mise en place du système de sécrétion de type III, qui est communément associé aux infections aigues. De fait le système Roc1 peut être considéré comme un «interrupteur» décidant du mode d’infection associé à P. aeruginosa. Le système Roc1 est constitué d’un senseur non-orthodoxe (RocS1) et de deux régulateurs de réponse, RocA1 et RocR, dont le domaine effecteur est un domaine de liaison à l’ADN ou un domaine EAL à activité phosphodiesterase, respectivement. Il existe également d’autres gènes paralogues de Roc1 qui sont le système Roc2 avec RocS2 et RocA2 très similaire à RocS1 et RocA1, ainsi que RocS3 similaire à RocS1. Le travail réalisé au cours de ma thèse a montré qu’il existe une régulation croisée entre Roc1 etRoc2. Cependant, chacune des branches du réseau de régulation contrôle l’expression d’une série de gènes bien spécifiques. Nous avons montré que la signalisation via RocS2 et RocS1 lorsqu’elle converge sur RocA1 contrôle l’expression des gènes cupC et ce contrôle est totalement indépendantde RocA2. Par contre lorsque la signalisation RocS1 et RocS2 converge vers RocA2 alors ce sont les gènes mexAB-oprM, qui codent une pompe d’efflux impliquée dans la résistance aux antibiotiques, dont l’expression est alors réprimée.En conclusion, nous avons mis en évidence un modèle unique de régulation croisée qui résulte dans un effet antagoniste entre formation du biofilm et résistance aux antibiotiques. Si cela peut paraître inattendu, quelques données cliniques sont en faveur d’une telle balance. En effet, l’analyse de souches de P. aeruginosa, isolées à partir de patients atteints de mucoviscidose, révèle que dans ces isolats la pompe MexAB-OprM est inactive. La raison de cette adaptation n’est pas élucidée, mais l’absence de pompe fonctionnelle pourrait procurer un avantage, une meilleure aptitude à la souche à persister dans cet environnement. Il est également reconnu que dans les poumons de ces patients le mode préféré de développement pour P. aeruginosa est le biofilm. Mises bout à bout ces observations suggèrent donc que le système Roc pourrait être un système de régulation important pour percevoir l’environnement du poumon chez le patient mucoviscidosique et déclencher une réponse adaptée. / The opportunistic pathogen Pseudomonas aeruginosa is responsible for diverse chronic and acute infections in human. Chronic infections are associated with the capacity of P. aeruginosa to form biofilms. One of the pathways controlling biofilm formation is the Roc1 two-component system, involved in the regulation of cup genes allow the assembly of thin fimbriae at the surface of the bacterium. Cup fimbiae are important in biofilm formation. There exist paralogues of the Roc1 system - the Roc2 and Roc3 system. The work in this thesis has shown that cross-regulation occurs between Roc1 and Roc2. However, each branch in this network appears to control the expression of a specific subset of genes whose role and functions are striking in the context of an infection process. We characterized here a unique model of cross-regulation which results in the antagonistic regulation of biofilm formation and antibiotic resistance

Les pompes d'efflux sont des complexes macromoléculaires qui permettent l'efflux des antibiotiques à travers les deux membranes (interne et externe). Ces pompes, spécifiques des bactéries Gram négatif, constituent l'un des acteurs majeurs du phénomène de résistance aux antibiotiques, en contribuant ainsi à la résistance intrinsèque et acquise de ces bactéries à de nombreuses molécules utilisées en antibiothérapie. Chez P. aeruginosa, ces pompes appartiennent pour la plupart à la famille des transporteurs RND. Ce sont des complexes tripartites constitués d'un transporteur de la membrane interne (RND), d'un adaptateur périplasmique (MFP) et d'un canal de la membrane externe (OMF). Ces composants ont été caractérisés individuellement chez de nombreuses bactéries. Cependant, les mécanismes qui régissent l'assemblage et la dissociation de la pompe, essentiels pour son fonctionnement, demeurent mal compris. Nous nous sommes donc intéressés au cours de ce travail aux pompes à efflux de Pseudomonas aeruginosa. Nous avons notamment procédé à la caractérisation structurale du canal OprN de la pompe MexEF-OprN impliquée dans la résistance aux fluoroquinolones et à la caractérisation biophysique du transporteur RND MexY de la pompe MexXY-OprM, spécifique des aminoglycosides. Nous avons étudié en parallèle le mécanisme d'ouverture du canal OprM seul in vitro (aspects structuraux) et in vivo (aspects fonctionnels) au sein de la pompe assemblée. Nos résultats montrent que les OMFs de P. aeruginosa présentent des similitudes avec les OMFs d'autres bactéries Gram négatif, mais également des différences, notamment pour OprN et OprM au niveau de l'interaction avec leurs partenaires ou encore pour OprM concernant l'ouverture du canal. Nous avons par ailleurs participé à l'étude in vitro de l'assemblage et du transport à travers la pompe MexAB-OprM, reconstituée au sein de protéoliposomes, confirmant l'importance de l'acylation de la MFP dans la formation du complexe et montrant l'importance de la force proto-motrice dans l'assemblage de la pompe mais pas dans sa dissociation. En parallèle de l'étude des pompes à efflux, nous nous sommes intéressés à un autre système de résistance, impliqué dans la dégradation des antibiotiques. Nous avons donc réalisé, en collaboration avec le Pr Patrick Plésiat (laboratoire de Bactériologie de Besançon), la modélisation de mutants de la beta-lactamase AmpC de P. aeruginosa, permettant de lier les effets fonctionnels observés à des hypothèses de modifications conformationnelles. / Multidrug efflux systems are membrane transport proteins that are used to translocate a wide variety of drugs across the inner and the outer membranes of Gram-negative bacteria, leading to natural and acquired antimicrobial resistances.Most of the multidrug transporters of P. aeruginosa belong to the resistance-nodulation-cell division (RND) superfamily.They function as three-component assemblies made of an inner membrane transporter (RND), a periplasmic membrane fusion protein (MFP) and an outer membrane factor channel (OMF). Along with functional studies, many crystal structures of the individual components of the pump have been solved but the interactions underlying the complex assembly and the opening mechanism of the outer channel remain unclear. In this study, we investigated structural and functional insights of P. aeruginosa efflux pumps. We solved the crystal structure of the MexEF-OprN efflux pump outer membrane channel OprN mainly involved in fluoroquinolones resistance. Our new structure highlights the differences between P. aeruginosa and other Gram-negative bacteria OMFs that could explain their specific interaction with the cognate MFP partners. We also purified and characterized the inner membrane transporter MexY from the MexXY-OprM efflux pump, which is the major determinant of aminoglycosides resistance in P. aeruginosa. Besides, we solved the crystal structure of a mutatedform of the outer membrane channel OprM in order to understand its opening mechanism. We also investigated in vivo effect of the OprM mutants in antibiotics resistance by MIC measurements and tried to correlate with the observed structural modifications leading to the open state. Moreover, we set up a new in vitro test allowing the investigation of the assembly of the MexAB-OprM efflux pump. Our results showed the importance of MexA and its lipid anchor in promoting and stabilizing the complex assembly. In addition, as a side project with the group of Pr Plésiat (laboratoire de Bactériologie de Besançon), we built different structural models of AmpC mutants from overproducing clinical isolates,showing the possible conformational changes that lead to the resistance increase.

L'apparition croissante de bactéries pathogènes multi-résistantes à la plupart des antibiotiques disponibles apparaît comme un problème mondial de santé publique. Malheureusement, un usage excessif à la fois en médecine humaine et animale a conduit à l’apparition de souches multi-résistantes à la plupart des antibiotiques disponibles sur le marché. Il est donc urgent de mieux comprendre les mécanismes mis en place par les bactéries pour résister aux antibiotiques afin de trouver des solutions pour combattre les souches multi-résistances.Dans ce contexte, le projet de la thèse vise à mieux comprendre les bases moléculaires de l’efflux actif de drogues chez Pseudomonas aeruginosa, qui est un des plus importants mécanismes utilisés par la bactérie pour lutter contre l’action de plusieurs antibiotiques. Les systèmes d’efflux forment des complexes protéiques situés dans la paroi de la bactérie et expulsent de manière active les antibiotiques avant même qu’ils aient pu atteindre leur cible intracellulaire, les rendant ainsi inactif.L’étude structurale se focalise sur le système RND (Resistance-Nodulation and cell Division) MexA-MexB-OprM qui est constitutivement exprimé chez la bactérie sauvage et est surexprimé chez les souches résistantes. Ce complexe tripartite est composé d'un transporteur inséré dans la membrane interne, d'une protéine canal insérée dans la membrane externe et d’une protéine adaptatrice périplasmique qui relie les deux autres protéines pour former un conduit étanche traversant le périplasme. En l’absence de la connaissance de la structure du complexe tripartite, l’objectif de la thèse a été de développer une stratégie originale pour reconstituer in vitro le complexe entier dans un environnement lipidique à partir des trois composants natifs produits séparément.L’assemblage du complexe tripartite est réalisé en mélangeant MexB et OprM en Nanodisque avec MexA mimant les deux bicouches lipidiques. La structure de ce complexe tripartite a été obtenu en combinant la cryo microscopie électronique et à l’approche dite ‘des particules isolées’. La structure tridimensionnelle du complexe calculée à une résolution inférieure à 4 Å a permis de construire un modèle atomique du complexe tripartite assemblé entre deux Nanodisques.Le complexe tripartite est composé d’un trimère d’OprM, d’un trimère de MexB et d’un hexamère de MexA entourant MexB et en interaction avec OprM. Ces données ont permis de résoudre la structure complète de MexA dans le complexe dont la partie N-terminale jusqu’alors inconnue car trop flexible et décrivent pour la première fois l’ancrage de MexA dans une membrane lipidique. Les changements conformationnels sont observés sur OprM et MexB lorsqu’ils sont engagés dans le complexe avec l’ouverture de l’extrémité périplasmique d’OprM et le basculement d’une boucle de MexB permettant d’établir un contact supplémentaire avec MexA.Pour replacer cette structure tripartite dans le cycle d’efflux de l’antibiotique, celle-ci décrit un état qui s’apparente probablement à un état au repos, sachant qu’aucun ligand spécifique n’a été ajouté au cours de l’assemblage. De plus, le complexe forme un canal ouvert à son extrémité extracellulaire, fournissant le conduit pour évacuer les drogues transportées par MexB qui utilise la force protomotrice comme source d’énergie.Ce travail ouvre la perspective à des études structurales d’autres états conformationnels du système d’efflux en condition « énergisé » pour compléter la compréhension du mécanisme du cycle d’efflux. Par ailleurs, la connaissance de cette première structure du complexe natif tripartite constitue le premier pas vers le développement de molécules capables de bloquer l’assemblage du complexe à des fins thérapeutiques. En effet, de telles molécules inhiberaient l’efflux actif et restauraient l’efficacité perdue des antibiotiques actuels. / The increasing appearance of multi-drug-resistant pathogenic bacteria to most available antibiotics is emerging as a global public health problem. Unfortunately, excessive use in both human and animal medicine has led to the emergence of multi-drug-resistant strains for most antibiotics available on the market. It is therefore urgent to better understand the underlying mechanisms by which bacteria resist to antibiotics to combat multi-resistance strains. In this context, this work aims at better understanding the molecular basis of active drug efflux in Pseudomonas aeruginosa, which is one of the most important mechanisms used by the bacterium to resist to several antibiotics. Efflux systems form protein complexes in the bacterial wall and actively expel antibiotics even before they reach their intracellular target, rendering them inactive. The structural study focuses on the MexA-MexB-OprM RND (Resistance-Nodulation and cell Division) system that is constitutively expressed in wild-type bacteria and is over-expressed in resistant strains. This tripartite complex is composed of a transporter inserted into the inner membrane, a channel protein inserted in the outer membrane and a periplasmic adapter protein that connects the other two proteins to form a sealed conduit through the periplasm. In the absence of knowledge of the structure of the tripartite complex, the aim of the thesis was to develop an original strategy to reconstitute the whole complex in vitro in a lipid environment from the three native components produced separately.The assembly of the tripartite complex is made by mixing MexA with MexB and OprM in Nanodisc mimicking the two lipid bilayers. The structure of this tripartite complex was obtained by combining cryo electron microscopy and the so-called 'isolated particles' approach. The three-dimensional structure of the complex, calculated at a resolution of less than 4 Å, was used to build an atomic model of the tripartite complex assembled between two Nanodiscs. The tripartite complex is composed of an OprM trimer, a MexB trimer and a MexA hexamer surrounding MexB and interacting with OprM. We solve the complete structure of MexA whose N-terminal part hitherto unknown because of a high flexibility and describe for the first time the anchoring of MexA in a lipid membrane. The conformational changes are observed on OprM and MexB when they are assembled in the complex with the opening of the periplasmic end of OprM and the spatial re-orientation of a MexB loop to establish additional contact with MexA.To integrate this tripartite structure into the antibiotic efflux cycle, it describes a state that is probably a resting state, knowing that no specific ligand was added during assembly. In addition, the complex forms an open channel at its extracellular end, providing the conduit to evacuate the drugs carried by MexB that uses the proton motive force as a source of energy. This work opens new perspective for structural studies of other conformational states of the efflux system in "energized" conditions to fulfill our understanding of the efflux cycle mechanism. Moreover, the knowledge of this first tripartite native complex structure constitutes the first step towards the development of molecules capable of blocking the assembly of the complex for therapeutic uses. Indeed, such molecules would inhibit active efflux and restore the lost efficiency of current antibiotics.

Les antibiotiques sont des molécules incontournables dans le traitement des infections bactériennes. L’émergence et la dissémination de la résistance aux antibiotiques chez la pathogène opportuniste Pseudomonas aeruginosa, ont amené l’Organisation Mondiale de la Santé à déclarer indispensable le développement de nouvelles approches thérapeutiques pour lutter contre cette bactérie. Bien que certaines alternatives aient été envisagées, la préservation de l’activité d’antibiotiques majeurs tels que les aminosides et la colistine est primordiale. La caractérisation des mécanismes de résistance à ces médicaments est nécessaire pour la mise au point de nouvelles molécules et mieux prendre en charge les patients. Dans ce contexte, nous montrons que des mutations dans le gène fusA1 (codant le facteur d’élongation EF-G1A) et dans l’opéron pmrAB (système à deux composants PmrAB) entrainent une augmentation de la résistance aux aminosides chez des mutants isolés au laboratoire et des souches issues de patients, atteints ou non, de mucoviscidose. Certaines substitutions d’acide aminé dans EF-G1A accroissent les niveaux de résistance de 2 à 16 fois aux quatre sous-classes d’aminosides. Par ailleurs, des changements d’acide aminé dans le système à deux composants PmrAB activent l’expression des gènes PA4773-PA4774-PA4775, et la production de norspermidine et de spermidine. La synthèse de ces polyamines va de pair avec une baisse de 4 à 16 fois de la sensibilité aux aminosides à noyan 2-désoxystreptamine bisubstitué en 4,6 (gentamicine, amikacine et tobramycine). De plus, il apparaît que la résistance des mutants pmrB à la colistine est en partie dépendante de la pompe d’efflux MexXY(OprM), un système impliqué dans la résistance naturelle, adaptative ou acquise aux aminosides. Enfin, nous montrons que les mutants pmrB surproduisent des alcaloïdes contenant un motif azétidine, par une voie de synthèse non-ribosomale et dépendante du quorum sensing. Ces alcaloïdes diminuent la virulence de P. aeruginosa dans le modèle Galleria mellonella. / Antibiotics are invaluable drugs to combat bacterial infections. Emergence and spread of antibiotic resistance in the opportunistic pathogen Pseudomonas aeruginosa have led the World Health Organization to consider as a crucial priority the development of new therapeutic approaches to fight this bacterium. In addition to other alternatives, preservation of activity of major antibiotics such as aminoglycosides and colistin is primordial. Consequently, characterization of the resistance mechanisms to these drugs is a prerequisite to design novel molecules, and improve patient care. In this context, we show that mutations in gene fusA1 (encoding elongation factor EF-G1A) and in operon pmrAB (two-component system PmrAB) lead to an increased resistance to aminoglycosides in in vitro-selected mutants and strains isolated from cystic fibrosis (CF) and non-CF patients. Certain amino acid substitutions in EF-G1A confer a 2- to 16-fold increased resistance to the four aminoglycoside subclasses. On the other hand, amino acid variations in two-component system PmrAB activate the expression of genes PA4773-PA4774-PA4775, and production of norspermidine and spermidine. This upregulated polyamine biosynthesis is associated with a 4- to 16-fold decreased susceptibility to 4,6-di-substituted deoxystreptamine aminoglycosides (gentamicin, amikacin and tobramycin). Moreover, our work reveals that the acquired resistance of pmrB mutants to colistin partially depends upon pump MexXY(OprM), a system that otherwise mediates intrinsic, adaptive and acquired resistance to aminoglycosides. Finally, we show that pmrB mutants overproduce azetidine-containing alkaloids by a quorum-sensing-regulated, nonribosomal peptide synthetase pathway. These alkaloids impair the virulence of P. aeruginosa in a Galleria mellonella infection model.