To enhance outbreak investigations of Shiga toxin-producing Escherichia coli O157:H7, PulseNet Canada has recently applied Multiple Locus Variable Number Tandem Repeat Analysis (MLVA) as a supplemental subtyping tool in combination with the gold standard subtyping method Pulsed-field Gel Electrophoresis (PFGE) for enhanced resolution of isolates exhibiting indistinguishable/highly similar PFGE patterns. The objective was to assess the discriminatory power and level of specificity MLVA offers for outbreak detection and response. Results demonstrate that MLVA provides a statistically significant increase in discriminatory power for outbreak investigations (0.998) compared to PFGE alone (0.993). MLVA was able to provide additional resolution over PFGE analysis and generally agreed with PFGE when isolates were identical and epidemiologically linked. MLVA shows great promise as a molecular epidemiological tool to complement PFGE, as it improves case categorization during outbreak investigations, and the greatest benefits of MLVA may be realized during routine surveillance, when epidemiological information is not available.

Made available in DSpace on 2014-06-12T15:53:17Z (GMT). No. of bitstreams: 2 arquivo5207_1.pdf: 1038836 bytes, checksum: fefc6684baa0c15fe33f48b0a036c0b6 (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2006 / A Yersinia pestis, bactéria Gram-negativa da família Enterobacteriaceae, é uma espécie muito homogênea quando observada pelos métodos fenotípicos: apresenta apenas um sorotipo, um fagotipo e um biotipo subdividido em três biovars ou variedades geográficas. A peste é uma doença primária dos roedores, geralmente transmitida por pulgas e que ocasionalmente pode infectar outros mamíferos, inclusive o homem, que é atingido acidentalmente ao penetrar no ecossistema da doença. Ela ainda persiste nos dias atuais entre diversos hospedeiros/reservatórios em numerosos focos silvestres em vários países do mundo e atualmente é considerada uma doença reemergente. Devido à alta taxa de letalidade e ao seu potencial de epidemização, a peste é classificada como doença de notificação Classe I de acordo com o Regulamento Sanitário Internacional (RSI) vigente, o que exige vigilância permanente dos focos, sobretudo porque a Y. pestis pode ser usada como agente de bioterrorismo. A vigilância da peste no Brasil baseia-se na pesquisa da bactéria em roedores e pulgas e de anticorpos antipestosos em animais sentinela (algumas espécies de roedores resistentes à infecção e carnívoros domésticos, como os cães e gatos). O conhecimento das características dos isolados de cada foco permitirá detectar a introdução de uma nova cepa e, consequentemente, a sua origem, se de outro foco ou por ato deliberado. Os estudos de tipagem molecular de cepas brasileiras de Y. pestis por diferentes técnicas, como a RAPD-PCR, PCR-ribotipagem e RFLP-IS100, revelaram, na maioria das vezes, padrões genômicos idênticos entre as cepas, independentemente das fontes, procedência e ano. Recentemente, um estudo utilizando MLVA (análise de múltiplos locos do número variável de repetições em tandem), mostrou que as cepas de Y. pestis do Brasil apresentavam polimorfismo. Este trabalho teve como objetivo caracterizar isolados de Y. pestis em um mesmo evento epidemiológico através de locos VNTR (número variável de repetições em tandem). Um conjunto de vinte cepas de Y. pestis isoladas durante a investigação de uma epizootia em um foco da Chapada do Araripe, município de Exu, Pernambuco, Brasil, em agosto de 1967, foi analisado. As cepas conservadas na bacterioteca do SRP (Serviço de Referência em Peste) foram reativadas e a identificação bacteriológica confirmada pela suscetibilidade ao bacteriófago antipestoso. Alterações no genoma foram pesquisadas pela presença ou ausência de genes de virulência nos plasmídeos prototípicos da Y. pestis e na Ilha de Patogenicidade (HPI) das yersínias, através da multiplex-PCR. Foram analisados seis locos VNTR pela reação de PCR. A ausência de alguns genes de virulência foi evidenciada em dez cepas, sugerindo que modificações genômicas ocorreram nesses isolados. Apesar disso, dos seis VNTR analisados cinco se revelaram monomórficos e apenas um apresentou polimorfismo, gerando três alelos. Colônias morfologicamente diferentes, grandes e pequenas, em algumas cepas, apresentaram padrão VNTR atípico, com duas bandas amplificadas. Por MLVA as cepas revelaram-se geneticamente relacionadas, o que reflete a relação epidemiológica desses isolados. Ao mesmo tempo, é necessário a análise de um maior número de VNTRs para confirmar a relação genética dessas cepas, em comparação com cepas de outros focos

Submitted by Eduardo Barros de Almeida Silva (eduardo.philippe@ufpe.br) on 2015-04-14T14:25:24Z No. of bitstreams: 2 DISSERTAÇÃO Milena Santos.pdf: 1356295 bytes, checksum: 9634e298128f38bc8e7f0441e057b005 (MD5) license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) / Made available in DSpace on 2015-04-14T14:25:24Z (GMT). No. of bitstreams: 2 DISSERTAÇÃO Milena Santos.pdf: 1356295 bytes, checksum: 9634e298128f38bc8e7f0441e057b005 (MD5) license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) Previous issue date: 2013-12-20 / Acinetobacter baumannii e Pseudomonas aeruginosa são importantes patógenos oportunistas responsáveis por inúmeras infecções e surtos nosocomias, além de possuírem elevada capacidade para persistir e resistir aos antimicrobianos no ambiente hospitalar. Análise de Múltiplos Locos VNTR (MLVA) foi realizada em 24 isolados de A. baumannii e 39 de P. aeruginosa. As análises foram realizadas utilizando a Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) e eletroforese em gel de agarose a 3,0%, bem como sequenciamento dos fragmentos amplificados. Oitenta e três por cento dos isolados foram classificados como extensivamente resistentes aos antimicrobianos (XDR) e 17 perfis genotípicos (GPA1-GPA17) foram encontrados nas amostras analisadas. GPA2 foi o mais comumente encontrado (0,96 %), seguido de GPA15, GPA3, GPA8, com 0, 72%, 0,48% e 0,48 %, respectivamente. Os demais genótipos foram únicos entre as amostras. Sessenta e sete por cento dos isolados de P. aeruginosa mostrou alta sensibilidade (66,6%) aos antimicrobianos e foram distribuídos em 37 perfis genotípicos (GPP1 - GPP37), revelando uma enorme heterogeneidade genética. Dois isolados foram agrupados em dois genótipos (GPP2 e GPP12), e os demais genótipos abrange uma única amostra, sugerindo o evento de multicolonização em P. aeruginosa. Muitas amostras de ambas espécies, embora isolados de diferentes sítios de infecção e setores hospilar e com um intervalo de semanas e/ou meses, revelaram uma dispersão clonal, persistência no ambiente hospitalar e aumento da resistência aos agentes antimicrobianos, especialmente em pacientes que estão internados na Unidade de Terapia Intensiva (UTI). MLVA mostrou ser uma técnica útil e altamente discriminatória para a caracterização e diferenciação de A. baumannii e P. aeruginosa deste estudo, facilitando a compreensão da dinâmica de dispersão em um hospital público no Brasil.

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Streptococcus pneumoniae é um importante agente etiológico de infecções invasivas e não invasivas, incluindo meningite, pneumonia e otite média. A cápsula polissacarídica é o principal fator de virulência desse microrganismo, sendo também considerada um importante marcador em estudos epidemiológicos. Dentre os mais de 90 tipos capsulares conhecidos, o sorotipo 14 se destaca pela prevalência elevada em várias regiões, inclusive no Brasil. A avaliação da diversidade genética desse microrganismo também inclui a aplicação de métodos moleculares, como PFGE e MLST. Entretanto, essas metodologias são relativamente onerosas, consomem muito tempo e os resultados obtidos com a técnica de PFGE são de difícil comparação entre diferentes laboratórios. A técnica de análise do polimorfismo numérico de segmentos repetitivos em múltiplos loci [MLVA, do inglês Multiple Loci VTNR (Variable-Number Tandem Repeat) Analysis] se apresenta como uma alternativa, embora ainda necessite de padronização e avaliação mais ampla para a espécie em questão. No presente estudo, 60 amostras de Streptococcus pneumoniae pertencentes ao sorotipo 14, isoladas de diversas fontes clínicas, em diferentes locais e períodos de tempo, foram caracterizadas pelas técnicas de MLVA (baseada na análise de 18 loci distintos), MLST, PFGE e tipagem do gene pspA. O gene pspA2 predominou entre as amostras analisadas, seguido pelo gene pspA1. Os tipos de MLVA, perfis de PFGE, e STs encontrados apresentaram resultados, em geral, concordantes, indicando o elevado poder discriminatório da versão da técnica de MLVA empregada. Cinco complexos clonais (CC) de MLVA e cinco singletons puderam ser definidos. O CC de MLVA denominado de L7 foi o predominante, compreendendo 36,7% da amostragem estudada. O CC L7 mostrou-se relacionado com genes pspA da família 2, com o CC1 de MLST, com o CC Pen14-H de PFGE, e com a não susceptibilidade à penicilina, Entre os complexos clonais de MLST, o CC1 foi o prevalente e incluiu predominantemente o ST156, pertencente ao clone internacional Spain9V-3. O CC L3 e o singleton L17 de MLVA apresentaram-se associados ao CC de PFGE Eri14-A, a família 1 de PspA e ao CC2 de MLST, que por sua vez também estava relacionado com o clone internacional England14-9. O CC L15 de MLVA esteve associado ao CC de PFGE Pen14-A, ao gene pspA2, aos CC3 e CC4 de MLST e ao clone internacional do PMEN Tennessee14-18. A técnica de MLVA revelou-se significativamente mais discriminatória que as técnicas de PFGE e MLST, conforme exemplificado pela detecção de 21 perfis de MLVA, 13 perfis de PFGE e cinco STs, entre as 22 amostras pertencentes ao CC de MLVA L7. Uma versão de MLVA, compreendendo um painel com os oito loci de maior poder discriminatório, pôde ser proposta a partir da análise dos resultados obtidos. Estes aspectos, aliados ao menor tempo e custo de execução, indicam que a técnica de MLVA constitui uma alternativa importante e satisfatória para uso em estudos sobre a diversidade genética de S. pneumoniae. / Streptococcus pneumoniae is a major pathogen causing invasive and non-invasive diseases in humans, including meningitis, pneumonia and otitis media. The polysaccharide capsule of this microorganism is considered a major virulence factor and an important marker for epidemiological studies. More than 90 pneumococcal capsular serotypes are recognized, and serotype 14 is highly prevalent in many regions, including Brazil. Genotyping methods, such as PFGE and MLST, are essential to evaluate genetic diversity of this bacterium. However, these methods are expensive, time-consuming and results from different laboratories are difficult to compare. Multiple Loci VTNR (Variable-Number Tandem Repeat) Analysis (MLVA) appears as an alternative, despite the fact that standardization and wide evaluation for application to this species is still required. In the present study, a total of 60 S. pneumoniae isolates belonging to serotype 14, isolated from different sources, regions and periods of time, were analyzed by MLVA (based on the analysis of 18 distinct loci), MLST, PFGE and pspA typing methods. Gene pspA2 was the predominant, followed by pspA1. Overall, the results of PFGE, MLST and MLVA typing were congruent, and indicated the discriminatory power of the MLVA method used. Five clonal complexes (CC) and five singletons were identified by MLVA. CC L7 was the predominant MLVA CC, comprising 36.7% of all the isolates. L7 was associated with pspA2 gene and non-susceptibility to penicillin, and it was related to MLST CC1, and to PFGE Pen14-H. CC1 was the prevalent MLST CC and included mostly ST156 that belongs to international clone (IC) Spain9V-3. Another MLVA CC, named L3, and the singleton L17 were related to PFGE CC Eri14-A, MLST CC2, and IC England14-9. MLVA CC L15 was related to PFGE Pen14-A, MLST CC3 and CC4, and IC Tennessee14-18. MLVA was found to be more discriminatory than PFGE and MLST, as exemplified by detection of 21 MLVA types, 13 PFGE profiles and 5 STs among the 22 strains belonging to L7, the predominant MLVA CC. A modified version of the MLVA method, based on the analysis of 8 loci only, is proposed. This aspect, in conjunction with reducing time and costs, indicate that MLVA represents an important and satisfactory alternative method to evaluate the genetic diversity of S. pneumoniae.

La bactérie responsable de chancre sur bois, Pseudomonas syringae pv. actinidiae (Psa), a causé trois épidémies depuis les années 1980 et se décline en trois biovars. La plus récente et dévastatrice (causée par Psa biovar 3), a été détectée pour la première fois en 2008 en Italie et s’est rapidement répandue dans la majorité des pays producteurs de kiwi, dont en France en 2010. Nous avons analysé la diversité de 280 souches de P. syringae isolées de kiwi en France. La caractérisation biologique et l’analyse phylogénétique des souches par MLSA ont révélé que les biovars 1, 2 et 3 appartenaient à une même lignée génétique, groupant également P. s. pv. theae. Les souches de biovar 4 constituent un ensemble de 4 lignées génétiques distinctes qui ont été rassemblées au sein d’un nouveau pathovar (Pseudomonas syringae pv. actinidifoliorum (Psaf)). Ces souches sont caractérisées par une pathogénie réduite (taches foliaires mais pas de chancre). Cette nouvelle classification permet une meilleure gestion des épidémies de chancre bactérien du kiwi. Le développement d’un schéma MLVA composé de 11 VNTRs a permis d’étudier la structuration génétique de populations de Psa biovar 3, de révéler de la diversité au sein de ce pathovar et d’identifier l’origine italienne de l’épidémie en France. Le séquençage du génome de cinq souches de Psaf et la comparaison de ces séquences avec celles d’autres génomes de Psa et Psaf, disponibles sur NCBI, a permis le développement d’un nouvel outil de détection par PCR temps réel, plus spécifique de chaque biovar de Psa et de Psaf. La MLVA et la PCR temps réel développées ici contribueront à l’amélioration de la surveillance de Psa dans le monde. / The causal agent of bacterial canker, Pseudomonas syringae pv. actinidiae (Psa),has been responsible ofthree epidemics since 1980’s.Psa is divided in three biovars. The most recent and severe outbreak (causedby Psa biovar 3) was detected for the first time in Italy in 2008. It has spread very quickly in the main kiwifruit producing countries, as in France in 2010. We analyzed the diversity of 280 strains of P. syringae isolated fromkiwifruit in France. The biological characterization and the phylogenetic analysis of the strains by MLSArevealed that the biovars 1, 2 and 3 belong to the same genetic lineage, which include P. s. pv. theae, as well.The biovar 4 strains, which are structured in 4 distinct genetic lineages, have been grouped in a new pathovar(Pseudomonas syringae pv. actinidifoliorum (Psaf)). These strains are characterized by a low virulence (onlyspots on leaves and no canker on wood). This new classification help with the management of the bacterialkiwifruit canker outbreaks. The development of an MLVA scheme composed of 11 VNTRs allowed to studythe genetic structuration of Psa biovar 3 populations, to reveal the diversity within this pathovar and to identifythe Italian origin of the epidemic in France. The genome sequencing of five Psaf strains and the comparisonbetween these sequences and those of Psa and Psaf genomes already available on NCBI, allowed thedevelopment of a new detection tool by real-time PCR, specific of each Psa biovar and of Psaf. The MLVA andthe real-time PCR based detection technique developed here will contribute to the improvement of the monitoringof kiwifruit bacterial canker around the world.

L'utilisation de virus de bactéries ou bactériophages pourrait être un complément efficace à l’antibiothérapie. Mon travail a porté sur la caractérisation de bactériophages dirigés contre l’espèce Pseudomonas aeruginosa, pathogène opportuniste responsable d'infections des voies respiratoires des patients atteints de mucoviscidose.J'ai tout d'abord déterminé la sensibilité des souches mucoviscidosiques au Pyophage (un cocktail de phages thérapeutiques Géorgien) et identifié six phages lytiques de quatre genres différents. Environ 15% des souches sont résistantes au Pyophage. Ensuite, en utilisant les souches cliniques multi-résistantes aux phages comme bactérie d’enrichissement, 32 phages ont été obtenus à partir des eaux usées de France et Côte d’Ivoire. Tous les phages analysés sont caudés et distribués au sein de dix genres parmi lesquels six exclusivement lytiques. J'ai identifié des souches bactériennes qui demeurent insensibles à tous les phages. J'ai montré que le système CRISPRs-Cas n'est pas associé à la résistance des souches aux phages lytiques. / The use of viruses of bacteria commonly called bacteriophages could constitute an efficient complement to antibiotics. During my PhD, I have characterized phages infecting the opportunistic pathogen Pseudomonas. aeruginosa, responsible for lung infections in cystic fribrosis patients. Firstly, I investigated the efficiency of Pyophage (a cocktail of phages therapeutic Georgian) on clinical P. aeruginosa strains and recovered six lytic phages from four different genus. The Pyophage appears to be unactive on approximately 15% of clinical strains. Secondly, and using multi-phages resistant strains as enrichment bacteria, 32 phages were isolated from waste water of France and Côte d’Ivoire. All phages are tailed and distributed within ten different genus including six exclusively lytic. I identified bacterial strains which remain insensitive to all phages. I also demonstrated that the CRISPRs-cas system plays no role in the resistance of strains to lytic phages.

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Streptococcus pneumoniae é um importante agente etiológico de infecções invasivas e não invasivas, incluindo meningite, pneumonia e otite média. A cápsula polissacarídica é o principal fator de virulência desse microrganismo, sendo também considerada um importante marcador em estudos epidemiológicos. Dentre os mais de 90 tipos capsulares conhecidos, o sorotipo 14 se destaca pela prevalência elevada em várias regiões, inclusive no Brasil. A avaliação da diversidade genética desse microrganismo também inclui a aplicação de métodos moleculares, como PFGE e MLST. Entretanto, essas metodologias são relativamente onerosas, consomem muito tempo e os resultados obtidos com a técnica de PFGE são de difícil comparação entre diferentes laboratórios. A técnica de análise do polimorfismo numérico de segmentos repetitivos em múltiplos loci [MLVA, do inglês Multiple Loci VTNR (Variable-Number Tandem Repeat) Analysis] se apresenta como uma alternativa, embora ainda necessite de padronização e avaliação mais ampla para a espécie em questão. No presente estudo, 60 amostras de Streptococcus pneumoniae pertencentes ao sorotipo 14, isoladas de diversas fontes clínicas, em diferentes locais e períodos de tempo, foram caracterizadas pelas técnicas de MLVA (baseada na análise de 18 loci distintos), MLST, PFGE e tipagem do gene pspA. O gene pspA2 predominou entre as amostras analisadas, seguido pelo gene pspA1. Os tipos de MLVA, perfis de PFGE, e STs encontrados apresentaram resultados, em geral, concordantes, indicando o elevado poder discriminatório da versão da técnica de MLVA empregada. Cinco complexos clonais (CC) de MLVA e cinco singletons puderam ser definidos. O CC de MLVA denominado de L7 foi o predominante, compreendendo 36,7% da amostragem estudada. O CC L7 mostrou-se relacionado com genes pspA da família 2, com o CC1 de MLST, com o CC Pen14-H de PFGE, e com a não susceptibilidade à penicilina, Entre os complexos clonais de MLST, o CC1 foi o prevalente e incluiu predominantemente o ST156, pertencente ao clone internacional Spain9V-3. O CC L3 e o singleton L17 de MLVA apresentaram-se associados ao CC de PFGE Eri14-A, a família 1 de PspA e ao CC2 de MLST, que por sua vez também estava relacionado com o clone internacional England14-9. O CC L15 de MLVA esteve associado ao CC de PFGE Pen14-A, ao gene pspA2, aos CC3 e CC4 de MLST e ao clone internacional do PMEN Tennessee14-18. A técnica de MLVA revelou-se significativamente mais discriminatória que as técnicas de PFGE e MLST, conforme exemplificado pela detecção de 21 perfis de MLVA, 13 perfis de PFGE e cinco STs, entre as 22 amostras pertencentes ao CC de MLVA L7. Uma versão de MLVA, compreendendo um painel com os oito loci de maior poder discriminatório, pôde ser proposta a partir da análise dos resultados obtidos. Estes aspectos, aliados ao menor tempo e custo de execução, indicam que a técnica de MLVA constitui uma alternativa importante e satisfatória para uso em estudos sobre a diversidade genética de S. pneumoniae. / Streptococcus pneumoniae is a major pathogen causing invasive and non-invasive diseases in humans, including meningitis, pneumonia and otitis media. The polysaccharide capsule of this microorganism is considered a major virulence factor and an important marker for epidemiological studies. More than 90 pneumococcal capsular serotypes are recognized, and serotype 14 is highly prevalent in many regions, including Brazil. Genotyping methods, such as PFGE and MLST, are essential to evaluate genetic diversity of this bacterium. However, these methods are expensive, time-consuming and results from different laboratories are difficult to compare. Multiple Loci VTNR (Variable-Number Tandem Repeat) Analysis (MLVA) appears as an alternative, despite the fact that standardization and wide evaluation for application to this species is still required. In the present study, a total of 60 S. pneumoniae isolates belonging to serotype 14, isolated from different sources, regions and periods of time, were analyzed by MLVA (based on the analysis of 18 distinct loci), MLST, PFGE and pspA typing methods. Gene pspA2 was the predominant, followed by pspA1. Overall, the results of PFGE, MLST and MLVA typing were congruent, and indicated the discriminatory power of the MLVA method used. Five clonal complexes (CC) and five singletons were identified by MLVA. CC L7 was the predominant MLVA CC, comprising 36.7% of all the isolates. L7 was associated with pspA2 gene and non-susceptibility to penicillin, and it was related to MLST CC1, and to PFGE Pen14-H. CC1 was the prevalent MLST CC and included mostly ST156 that belongs to international clone (IC) Spain9V-3. Another MLVA CC, named L3, and the singleton L17 were related to PFGE CC Eri14-A, MLST CC2, and IC England14-9. MLVA CC L15 was related to PFGE Pen14-A, MLST CC3 and CC4, and IC Tennessee14-18. MLVA was found to be more discriminatory than PFGE and MLST, as exemplified by detection of 21 MLVA types, 13 PFGE profiles and 5 STs among the 22 strains belonging to L7, the predominant MLVA CC. A modified version of the MLVA method, based on the analysis of 8 loci only, is proposed. This aspect, in conjunction with reducing time and costs, indicate that MLVA represents an important and satisfactory alternative method to evaluate the genetic diversity of S. pneumoniae.

Au sein des mycoplasmes pathogènes pour l’homme, il existe des mycoplasmes à tropisme respiratoire, parmi lesquels M. pneumoniae, et d’autres dont le tropisme est la sphère urogénitale, comme M. genitalium. M. genitalium est un agent émergent dont l’épidémiologie est encore mal connue. Il est responsable d’infections sexuellement transmissibles, urétrites chez l’homme et cervicites chez la femme. M. pneumoniae est responsable d’infections respiratoires aiguës chez l’enfant et l’adulte jeune. M. genitalium est une espèce extrêmement fastidieuse dont la culture est exceptionnelle à partir de prélèvements de patients. Dans le but d'enrichir notre collection de prélèvements positifs pour M. genitalium un protocole de recherche clinique (FeminIST) proposant un dépistage systématique par PCR du portage de M. genitalium chez les femmes infectées par le VIH de la cohorte Aquitaine a été mis en place. Les méthodes génotypiques ont été largement appliquées pour le typage moléculaire des Mollicutes, mais peu de méthodes simples, automatisées et discriminantes l’ont été à M. genitalium et M. pneumoniae. La MLVA (« Multi-Locus Variable-Number of Tandem-Repeats Analysis ») est une méthode qui analyse le polymorphisme associé aux répétitions en tandem, présentant de nombreux avantages, comme un pouvoir discriminant élevé et la possibilité d’être réalisée directement à partir des prélèvements. Cette technique a été appliquée à M. genitalium et M. pneumoniae et comparée aux méthodes de typage déjà disponibles. Six et cinq VNTR ont été respectivement identifiés comme discriminants pour M. genitalium et M. pneumoniae. Les PCR ont été multiplexées et les amorces marquées pour faciliter et automatiser l’analyse réalisée par électrophorèse capillaire. La méthode a été réalisée sur notre collection de 265 souches cliniques de M. pneumoniae et directement à partir de 123 prélèvements positifs de M. genitalium. La MLVA a permis de typer 89,4 % des prélèvements positifs pour M. genitalium et toutes les souches de M. pneumoniae. Elle s’est révélée plus discriminante que les autres méthodes pour les deux espèces. Les représentations hiérarchiques des résultats confirment l’hétérogénéité de l’espèce M. genitalium et, en revanche, l’homogénéité de l’espèce M. pneumoniae. En résumé, la MLVA s’avère être un outil de typage moléculaire performant pour M. genitalium et M. pneumoniae donnant des résultats facilement échangeables entre laboratoires. / Human pathogenic mycoplasmas include respiratory tract species, such as M. pneumoniae and urogenital species, such as M. genitalium. M. genitalium is an emerging agent for which epidemiology is unclear. It is involved in sexually transmitted infections, mainly urethritis in men and cervicitis in women. M. pneumoniae is responsible for acute respiratory infections especially in children. M. genitalium is a fastidious species for which culture remains extremely difficult. In order to extend our collection of samples positive for M. genitalium, a clinical research study (FeminIST) was conducted. It consisted in a PCR screening for M. genitalium in the urogenital tract of HIV-infected women of the Aquitaine cohort. Genotyping methods have been widely applied to Mollicutes, but few simple and automatized methods have been developed for M. genitalium and M. pneumoniae. The MLVA (Multi-Locus Variable-Number Tandem-Repeats Analysis) method analyzes the genome polymorphism associated with tandem repeats. Its advantages are a high discriminatory power and the possibility of being used directly from clinical samples. This technique was applied to M. genitalium and M. pneumoniae and compared with other available genotyping methods. Six and five VNTR were selected for M. genitalium and M. pneumoniae, respectively. The use of multiplex PCR and capillary electrophoresis enabled a high-throughput analysis and allowed an easy interpretation of the results. The method was applied to our collection of 265 M. pneumoniae clinical strains and used directly from 123 clinical samples positive for M. genitalium. 89.4% of M. genitalium PCR-positive samples and all the M. pneumoniae isolates were amplified and typed. We showed a higher discriminatory power for our MLVA than for other genotyping methods, without the need of a fastidious sequencing step. The hierarchical representation of results confirms the M. genitalium species heterogeneity and the M. pneumoniae species homogeneity. MLVA appears to be a good tool for molecular typing of these two mycoplasma species, allowing an easy exchange of data between laboratories.

Le champignon filamenteux Aspergillus fumigatus et la bactérie Chlamydophila psittaci sont deux agents pathogènes majeurs chez les oiseaux d'élevage. Bien que phylogénétiquement très distants, ces deux micro-organismes partagent un même mode de transmission par voie aérienne. La mortalité et la morbidité associées aux aspergilloses ou aux chlamydioses ont un impact économique qui n'est pas négligeable, en particulier dans les élevages de dindes. En France, les investigations autour de cas humains de chlamydiose identifient fréquemment un lien avec des élevages de canards, chez lesquels l'infection par C. psittaci s'apparente à un portage intestinal asymptomatique. Pour analyser la circulation des agents pathogènes dans les élevages avicoles, nous avons tout d'abord étudié la diversité génétique d' Aspergillus fumigatus et de Chlamydophila psittaci. Pour cela, deux nouvelles méthodes de typage moléculaire MLVA (Multiple Locus VNTR Analysis) ont été mises au point. Ces méthodes se sont révélées très discriminantes, rapides et faciles à mettre en œuvre. Dans le cas d' A. fumigatus, la méthode MLVA a permis de regrouper les génotypes en fonction de leur origine géographique. Elle a également permis d'analyser les modes de contamination d'un couvoir de dindes. Dans un second temps, nous avons analysé le pouvoir pathogène de ces deux microorganismes chez les oiseaux. Pour cela, deux modèles d'infections expérimentales ont été développés. Le premier modèle a permis de reproduire une aspergillose chez des poussins de 1 jour après inhalation d'un aérosol contenant des conidies d'A. fumigatus. Lors de la mise au point du modèle, l'impact de l'immunodépression et de la lignée de poulet a été évalué. Pour C. psittaci, un modèle reproduisant un portage intestinal de la bactérie chez des canetons mulards de 1 jour a été obtenu.

Clostridium perfringens is an important pathogen in veterinary and medical fields. Understanding epidemiology of C. perfringens diseases and evolution of virulence within C. perfringens necessitates an efficient, time and cost effective strain typing method. Multiple-locus variable-number tandem repeat analysis (MLVA) has been applied to typing of other pathogens and we describe here the development of a MLVA scheme for C. perfringens. We characterized five VNTR loci, and screened 112 C. perfringens isolates to evaluate typability, reproducibility, and discriminatory power of the scheme. All isolates were assigned a MLVA genotype and the technique has excellent reproducibility, with a numerical index of discrimination of 0.995. Thus, MLVA is an efficient tool for C. perfringens strain typing, and being PCR based makes it rapid, easy, and cost effective. In addition, it can be employed in epidemiological, ecological, and evolutionary investigations of the organism.Virulence of this species is not fully understood and it does seem that distribution of the toxin/enzyme genes is erratic within the population. We used the MLVA scheme to investigate evolution of virulence and population structure of this species. Analysis of the phylogenetic signal indicates that acquisition of the major toxin genes and other plasmid-borne toxin genes is a recent evolutionary event, and their maintenance is essentially a function of the selective advantage they confer to strains carrying them in certain micro-niches under different conditions. In addition, it indicates the ability of virulent strains to cause disease in different hosts. More interestingly, there is evidence that certain normal flora strains are virulent when they gain access to a different host species. Analysis of the population structure indicates that recombination events are the major tool that shapes the population and this panmixia is interrupted with frequent clonal expansion that mostly corresponds to disease processes. Signature of positive selection was detected in the alpha toxin gene, suggesting the possibility of adaptive alleles on the other chromosomally-encoded determinants. Finally, C. perfringens proved to have a dynamic population, and availability of more genome sequences, use of comparative proteomics and of animal models would provide more insight into the pathogenicity of this organism.