Submitted by Luiz Felipe Barbosa (luiz.fbabreu2@ufpe.br) on 2015-03-13T13:00:52Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) Maria Paloma Silva de Barros_PPGG UFPE.pdf: 8103324 bytes, checksum: 8a69c263eb54cdd37eb3275985c8eb30 (MD5) / Made available in DSpace on 2015-03-13T13:00:52Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) Maria Paloma Silva de Barros_PPGG UFPE.pdf: 8103324 bytes, checksum: 8a69c263eb54cdd37eb3275985c8eb30 (MD5) Previous issue date: 2012-09-14 / A peste é uma doença que permanece enraizada em inúmeros focos naturais por todo o mundo. Embora o Brasil passe por um período de silenciamento epidemiológico, anticorpos antipestosos são detectados nas atividades de vigilância, sugerindo que estes focos permanecem ativos. A Yersinia pestis, agente causador da peste, apresenta uma história evolutiva recente e é considerada uma espécie, geneticamente, muito homogênea. Diante da necessidade de estudos mais aprofundados sobre as características moleculares e evolutivas dos isolados de Y. pestis dos focos do Brasil, realizamos neste trabalho uma caracterização de cepas da coleção biológica (Fiocruz-CYP) de Yersinia, provenientes de cinco focos de peste do Brasil, com a finalidade de compreender a adaptação da bactéria no ambiente. Realizamos a padronização e a análise de macrorestrição (PFGE) em 22 cepas de Y. pestis, 17 de um surto ocorrido em 1986 e cinco isoladas da atividade de vigilância. O PFGE não separou os isolados da rotina e do surto, entretanto foi capaz de revelar diversidade genética entre as cepas. As técnicas MLVA e CRISPR também foram utilizadas na genotipagem das cepas de Y. pestis. Doze locos VNTR (MLVA) analisados em 37 cepas, pertencentes a dois eventos epidemiológicos distintos, permitiram observar a separação dos grupos por evento e estabelecer uma relação epidemiológica. Três locos CRISPR (YPa, YPb e YPc) foram analisados em 146 cepas, apenas dois (YPa e YPb) se mostraram polimórficos. A análise desta região permitiu realizar uma caracterização intraespecífica e microevolutiva dos isolados de peste dos focos brasileiros. O MLVA e o CRISPR demonstraram uma melhor relação entre os dados epidemiológicos e moleculares, enquanto o PFGE apenas diferenciou os isolados de Y. pestis. Os dados gerados pelas três técnicas estudadas permitiram confirmar que houve apenas a entrada de um clone de Y. pestis no Brasil e observar que alguns processos adaptativos foram necessários para sua interiorização e fixação nos focos do país.

Submitted by Luiz Felipe Barbosa (luiz.fbabreu2@ufpe.br) on 2015-03-13T14:43:13Z No. of bitstreams: 2 Vladimir da Mota Silveira Filho - Tese PPGG.pdf: 7570223 bytes, checksum: 939c1f76d28cf506a0b7eff7badba469 (MD5) license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) / Made available in DSpace on 2015-03-13T14:43:13Z (GMT). No. of bitstreams: 2 Vladimir da Mota Silveira Filho - Tese PPGG.pdf: 7570223 bytes, checksum: 939c1f76d28cf506a0b7eff7badba469 (MD5) license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) Previous issue date: 2012-03-15 / CPqAM CAPES CNPq Serviço de Referência em Peste / A peste, zoonose causada pela bactéria Yersinia pestis, continua sendo uma ameaça mundial. Como outras enfermidades relacionadas à pobreza, a peste é considerada uma doença negligenciada nos países tropicais, incluindo Brasil, onde ainda há detecção sorológica de atividade pestosa em animais-sentinela nos focos naturais. A ausência de uma vacina segura/efetiva, o surgimento de cepas multirresistentes e a possibilidade de seu uso como arma biológica aumentaram o interesse nos estudos genéticos/epidemiológicos do patógeno. Este trabalho teve como objetivos (1) comparar dois métodos moleculares de tipagem para identificar qual deles é capaz de estabelecer melhor correlação temporal e geográfica entre isolados brasileiros de Y. pestis; e (2) aprofundar os conhecimentos sobre os mecanismos de patogenicidade da bactéria. 25 cepas brasileiras de Y. pestis foram tipadas pela análise de múltiplos locos com número variável de repetições em tandem (MLVA) e pela eletroforese em gel de campo pulsado (PFGE). A associação entre essas técnicas demonstrou, pela primeira vez, diversidade genética entre cepas brasileiras de Y. pestis. Contudo, apenas MLVA permitiu estabelecer correlação entre os isolados de diferentes eventos epidemiológicos, mostrando-se mais eficiente para tipagem de Y. pestis, em relação ao PFGE. Quatro cepas avirulentas P.CE 882/1R e 32R, P.Exu 369 e 390, e uma cepa controle indiana altamente virulenta (195P) foram comparadas a nível fenotípico, genotípico, transcricional e proteômico, a fim de identificar possíveis causas da perda de virulência. Não foi encontrada diferença fenotípica e genotípica entre os cinco isolados, onde foi detectada a presença dos genes irp2, psn, ybtE (localizados na Ilha de Alta Patogenicidade - HPI), fur, hmsH, YPO2271, YPO2281, sodA, phoP, psaA (cromossomais) e pla, lcrV, ymt, caf1 (plasmidiais). Entretanto, a análise transcricional mostrou diferentes níveis de transcrição dos genes da HPI, apesar de nenhuma alteração estrutural de sequência ter sido detectada. Provavelmente a presença de ferro livre no meio de cultura utilizado ativou a proteína Fur, um regulador transcricional negativo da HPI. A análise quantitativa revelou níveis de transcrição dos genes da HPI acima do esperado nas cepas P.Exu 369 e 390, sugerindo possível disfunção no mecanismo regulatório da captura de ferro. A análise proteômica da subcultura P.CE 882/1R sugere que distúrbios metabólicos decorrentes do subcultivo e/ou estocagem podem estar associados ao fenótipo de avirulência. Estes achados sobre os mecanismos de virulência de Y. pestis poderão contribuir para identificação de alvos importantes para o desenvolvimento de novas vacinas e abordagens terapêuticas contra a peste.

Submitted by Caroline Falcao (caroline.rfalcao@ufpe.br) on 2017-04-10T17:45:25Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) 2012-Tese-MariaPalomaBarros.pdf: 8071319 bytes, checksum: 0b3f7f14ac7d15cf16b3a5e185a6f89d (MD5) / Made available in DSpace on 2017-04-10T17:45:25Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) 2012-Tese-MariaPalomaBarros.pdf: 8071319 bytes, checksum: 0b3f7f14ac7d15cf16b3a5e185a6f89d (MD5) Previous issue date: 2012-09-14 / A peste é uma doença que permanece enraizada em inúmeros focos naturais por todo o mundo. Embora o Brasil passe por um período de silenciamento epidemiológico, anticorpos antipestosos são detectados nas atividades de vigilância, sugerindo que estes focos permanecem ativos. A Yersinia pestis, agente causador da peste, apresenta uma história evolutiva recente e é considerada uma espécie, geneticamente, muito homogênea. Diante da necessidade de estudos mais aprofundados sobre as características moleculares e evolutivas dos isolados de Y. pestis dos focos do Brasil, realizamos neste trabalho uma caracterização de cepas da coleção biológica (Fiocruz-CYP) de Yersinia, provenientes de cinco focos de peste do Brasil, com a finalidade de compreender a adaptação da bactéria no ambiente. Realizamos a padronização e a análise de macrorestrição (PFGE) em 22 cepas de Y. pestis, 17 de um surto ocorrido em 1986 e cinco isoladas da atividade de vigilância. O PFGE não separou os isolados da rotina e do surto, entretanto foi capaz de revelar diversidade genética entre as cepas. As técnicas MLVA e CRISPR também foram utilizadas na genotipagem das cepas de Y. pestis. Doze locos VNTR (MLVA) analisados em 37 cepas, pertencentes a dois eventos epidemiológicos distintos, permitiram observar a separação dos grupos por evento e estabelecer uma relação epidemiológica. Três locos CRISPR (YPa, YPb e YPc) foram analisados em 146 cepas, apenas dois (YPa e YPb) se mostraram polimórficos. A análise desta região permitiu realizar uma caracterização intraespecífica e microevolutiva dos isolados de peste dos focos brasileiros. O MLVA e o CRISPR demonstraram uma melhor relação entre os dados epidemiológicos e moleculares, enquanto o PFGE apenas diferenciou os isolados de Y. pestis. Os dados gerados pelas três técnicas estudadas permitiram confirmar que houve apenas a entrada de um clone de Y. pestis no Brasil e observar que alguns processos adaptativos foram necessários para sua interiorização e fixação nos focos do país. / Plague disease remains present in numerous natural foci worldwide. Although Brazil goes through a period of epidemiological silence antiplague antibodies are detected in the surveillance activities, suggesting that Brazilians foci remain active. Yersinia pestis, causative agent of plague, has a recent evolutionary history and is considered a very genetically homogeneous species. Given the need for further studies on the molecular and evolutionary characteristics of the isolates of Y. pestis of the Brazilian plague areas, we perform in this work a characterization of strains biological collection (Fiocruz-CYP) of Yersinia, from five outbreaks of plague in Brazil, with the aim of understanding the adaptation of bacteria to the environment. We carried out the standardization and macrorestriction analysis (PFGE) in 22 Y. pestis strains, 17 from an outbreak occurred in 1986 and five from surveillance activity. PFGE did not separate the isolates from surveillance and from outbreak, but it was able to reveal genetic diversity among strains. MLVA and CRISPR techniques were also used in genotyping Y. pestis strains. Analysis of 12 VNTR loci (MLVA) in 37 Y. pestisstrains, of two different epidemiological events, allowed observing the separation of groups establish an epidemiological link among the isolates. Three CRISPR loci (YPa, YPb and YPc) were analyzed in 146 Y. pestis strains, only two loci (YPa and YPb) were polymorphic. The analysis of this region allowed an intraspecific characterization and microevolutionary of the plague isolates in the Brazilian foci. The CRISPR and MLVA showed a better relationship between the epidemiological and molecular data, while PFGE differ only the Y. pestis strains. The data generated by the three techniques studied confirmed that there was only one entry clone Y. pestis in Brazil and observed that some adaptive processes were necessary for its internalization and fixation of these foci in our country.

Submitted by Caroline Falcao (caroline.rfalcao@ufpe.br) on 2017-04-10T18:11:34Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) 2012-Tese-VladimirSilveiraFilho.pdf: 7570666 bytes, checksum: acc48aa25629f4c3d970307fc0187b44 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-04-10T18:11:35Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) 2012-Tese-VladimirSilveiraFilho.pdf: 7570666 bytes, checksum: acc48aa25629f4c3d970307fc0187b44 (MD5) Previous issue date: 2012-03-15 / A peste, zoonose causada pela bactéria Yersinia pestis, continua sendo uma ameaça mundial. Como outras enfermidades relacionadas à pobreza, a peste é considerada uma doença negligenciada nos países tropicais, incluindo Brasil, onde ainda há detecção sorológica de atividade pestosa em animais-sentinela nos focos naturais. A ausência de uma vacina segura/efetiva, o surgimento de cepas multirresistentes e a possibilidade de seu uso como arma biológica aumentaram o interesse nos estudos genéticos/epidemiológicos do patógeno. Este trabalho teve como objetivos (1) comparar dois métodos moleculares de tipagem para identificar qual deles é capaz de estabelecer melhor correlação temporal e geográfica entre isolados brasileiros de Y. pestis; e (2) aprofundar os conhecimentos sobre os mecanismos de patogenicidade da bactéria. 25 cepas brasileiras de Y. pestis foram tipadas pela análise de múltiplos locos com número variável de repetições em tandem (MLVA) e pela eletroforese em gel de campo pulsado (PFGE). A associação entre essas técnicas demonstrou, pela primeira vez, diversidade genética entre cepas brasileiras de Y. pestis. Contudo, apenas MLVA permitiu estabelecer correlação entre os isolados de diferentes eventos epidemiológicos, mostrando-se mais eficiente para tipagem de Y. pestis, em relação ao PFGE. Quatro cepas avirulentas P.CE 882/1R e 32R, P.Exu 369 e 390, e uma cepa controle indiana altamente virulenta (195P) foram comparadas a nível fenotípico, genotípico, transcricional e proteômico, a fim de identificar possíveis causas da perda de virulência. Não foi encontrada diferença fenotípica e genotípica entre os cinco isolados, onde foi detectada a presença dos genes irp2, psn, ybtE (localizados na Ilha de Alta Patogenicidade - HPI), fur, hmsH, YPO2271, YPO2281, sodA, phoP, psaA (cromossomais) e pla, lcrV, ymt, caf1 (plasmidiais). Entretanto, a análise transcricional mostrou diferentes níveis de transcrição dos genes da HPI, apesar de nenhuma alteração estrutural de sequência ter sido detectada. Provavelmente a presença de ferro livre no meio de cultura utilizado ativou a proteína Fur, um regulador transcricional negativo da HPI. A análise quantitativa revelou níveis de transcrição dos genes da HPI acima do esperado nas cepas P.Exu 369 e 390, sugerindo possível disfunção no mecanismo regulatório da captura de ferro. A análise proteômica da subcultura P.CE 882/1R sugere que distúrbios metabólicos decorrentes do subcultivo e/ou estocagem podem estar associados ao fenótipo de avirulência. Estes achados sobre os mecanismos de virulência de Y. pestis poderão contribuir para identificação de alvos importantes para o desenvolvimento de novas vacinas e abordagens terapêuticas contra a peste. / Plague, a zoonosis caused by the bacterium Yersinia pestis, remains as a global threat. As other poverty related diseases, plague is considered a neglected disease in tropical countries, including Brazil, where serological activity is still detected in sentinel animals in the natural foci. The lack of safe/effective vaccine and the rise of multiresistant strains and the possibility of its use as a biological weapon increased the interest in genetic/epidemiological studies of this pathogen. This work aimed (1) to compare two molecular typing methods to identify which offers better temporal and geographical correlation among Brazilian Y. pestis isolates; and (2) to further understand the pathogenicity mechanisms of the bacteria. 25 Brazilian strains of Y. pestis were typed by analysis of multiple loci with variable number of tandem repeats (MLVA) and by pulsed-field gel electrophoresis (PFGE). Association between these techniques demonstrated for the first time genetic diversity among Brazilian Y. pestis strains. However, only MLVA allowed establishing a correlation between isolates from different epidemiological events, proving to be more efficient for Y. pestis typing than PFGE. Four avirulent strains P.CE 882/1R and 32R, P.Exu 369 and 390, and a highly virulent Indian control strain (195P) were compared at phenotypic, genotypic, transcriptional and proteomic level in order to identify possible causes of virulence loss. No phenotypic and genotypic difference was found among the five isolates, which detected the genes irp2, psn, ybtE (from the High Pathogenicity Island - HPI), fur, hmsH, YPO2271, YPO2281, sodA, phoP, psaA (chromosomal) and pla, lcrV, ymt, caf1 (plasmidial). However, the transcriptional analysis indicated different transcription levels of the HPI genes, although no structural change on sequence being detected. Probably the presence of free iron in the culture medium activated the protein Fur, a negative HPI transcriptional regulator. Quantitative analysis revealed higher than expected transcription levels of P.Exu 369 and 390 HPI genes, suggesting possible alteration in the iron uptake regulation mechanism. The proteomic analysis of the subcultive P.CE 882/1R suggests that metabolic disturbances resulting from the subculture and/or storage may be associated with avirulence phenotype. Those findings about mechanisms of virulence of Y. pestis may contribute to identify important targets for development of new vaccines and therapies against plague.

Anaplasma phagocytophilum est une alpha-protéobactérie, parasite intracellulaire stricte, à localisation intra-granulocytaire et principalement vectorisée par des tiques du genre Ixodes. Elle est notamment l'agent de l'anaplasmose granulocytaire bovine, ou Tick-borne fever, une maladie provoquant d'importantes pertes économiques chez les bovins en Europe. Cette bactérie, peut également infecter un large spectre d'hôtes, tels que des ruminants sauvages ou des rongeurs. Cependant, l'épidémiologie de l'infection par A. phagocytophilum est encore mal connue. Le(s) réservoir(s) des souches de ruminants domestiques en Europe n'est/ne sont notamment pas identifié(s) à l'heure actuelle. Il est donc nécessaire d'approfondir nos connaissances dans ce domaine, notamment afin de lutter plus efficacement contre l'atteinte des bovins. L'objectif de cette thèse était de caractériser la diversité génétique des variants d'A. phagocytophilum circulant chez les ruminants en France. Pour cela, nous avons, dans un premier temps, étudié la circulation des souches d'A. phagocytophilum au sein des ruminants sauvages et domestiques en développant et en utilisant une technique MLVA (Multiple-Locus Variable-number tandem repeat Analysis). Cela nous a permis de suspecter fortement l'existence d'au moins deux cycles épidémiologiques impliquant des variants d'A. phagocytophilum présents chez les ruminants en France. Le premier pourrait impliquer le cerf comme espèce réservoir et les ruminants domestiques (entre autres) comme espèces sensibles, alors que le second impliquerait le chevreuil comme réservoir, sans impact significatif chez les bovins. Dans un deuxième temps, après avoir développé une technique de séquence capture pour A. phagocytophilum, nous avons séquencé et caractérisé le premier génome de cette bactérie issu d'un bovin. La comparaison de ce génome aux neuf autres génomes actuellement disponibles a permis d'identifier quatre protéines uniquement présentes chez la souche bovine, et neuf uniquement chez les deux souches de ruminants domestiques étudiés, ce qui amène à envisager leur implication potentielle dans le tropisme d'hôte de ces souches / Anaplasma phagocytophilum is an obligate intracellular alpha-proteobacterium mainly transmitted by Ixodes ticks. In domestic ruminants, it is the causative agent of tick-borne fever, which causes significant economic losses in Europe. It also infects a large range of hosts, including wild ruminants and rodents. The epidemiology of A. phagocytophilum is not yet fully understood. For example, the reservoir host(s) for European domestic ruminant strains has/have not been identified to date, which doesn't facilitate control of cattle infection. Our objective was to explore the genetic diversity of A. phagocytophilum obtained from ruminants in France. For this purpose, we first studied the circulation of this pathogen in domestic and wild ruminants, using a new MLVA technique. Our results potentially reveal the existence of at least two different epidemiological transmission cycles of A. phagocytophilum. The first cycle may involve red deer as reservoir hosts, and possibly domestic ruminants, as either accidental or longer-term hosts, whereas the second might involve roe deer. In a second study, we have sequenced and characterized the genome of A. phagocytophilum obtained from a cow. Following comparison with nine available genomes, we identified four genes specific to the A. phagocytophilum bovine genome, and nine common to both genomes from domestic ruminants (i.e. a cow and a sheep). These genes could be involved in host tropism of ruminant strains

La fièvre Q est une zoonose de répartition mondiale due à une bactérie intracellulaire stricte, Coxiella burnetii. Les ruminants domestiques contaminent l’environnement en excrétant la bactérie principalement dans les produits de parturition, le mucus vaginal et les fèces. L’Homme et l’animal s’infectent ensuite par inhalation de pseudo-spores circulantes dans l’environnement. Des enjeux de santé publique et vétérinaires ont ainsi motivés la mise en place de ce projet de thèse afin de mieux maîtriser les infections par C. burnetii dans les élevages. Les objectifs de ce travail étaient de produire des connaissances épidémiologiques descriptives sur : (a) la dynamique de circulation de C. burnetii en élevage ovin naturellement infecté ; (b) la diversité génotypique des souches de C. burnetii circulantes dans les élevages de ruminants domestiques en France ; (c) la diversité phénotypique de ces souches via l’utilisation de deux modèles de virulence, un in vivo et un in vitro ; et (d) l’implication du cheval dans l’épidémiologie de la fièvre Q, en étudiant son exposition à C. burnetii ainsi qu’une potentielle symptomatologie.Le suivi longitudinal réalisé en élevage ovin a permis de fournir des indicateurs pertinents à utiliser pour évaluer rapidement le risque de transmission de C. burnetii en contexte infectieux, en termes de lots d’animaux, d’outils diagnostics ou encore de périodes d’échantillonnage à privilégier. Par ailleurs, nous avons également identifié trois grands clusters génotypiques de souches circulantes dans les élevages de ruminants domestiques en contexte d’avortement fièvre Q en France. Deux clusters génotypiques regroupent majoritairement les petits ruminants, dont un principalement les ovins et l’autre les caprins. Le troisième cluster génotypique est composé quasi-exclusivement de bovins. Nous avons montré que le gène IS1111 impacte significativement la diversité génotypique MLVA observée. Nous avons également montré qu’en plus d’une spécificité d’espèce, les génotypes circulants en France sont stables d’un point de vue spatio-temporel. Pour l’étude phénotypique, nous avons mis au point deux modèles d’infection, l’un in vivo par inoculation dans le coussinet plantaire de souris mâle CD1 et l’autre in vitro par infection de deux lignées cellulaires macrophagiques : l’une bovine (SV40) et l’autre ovine (MoCl4). Ces modèles nous ont permis d’identifier 4 clusters phénotypiques, qui n’étaient pas systématiquement corrélés aux trois clusters génotypiques, identifiés in vivo à partir de l’analyse de la charge bactérienne dans la rate de souris, ni aux cinétiques de multiplication de C. burnetii observés in vitro. Enfin, les séroprévalences obtenues chez le cheval dans une zone considérée hyperendémique pour l’Homme (Camargue et Plaine de La Crau) suggèrent que les chevaux sont exposés à la fièvre Q dans cette région et pourrait éventuellement être utilisés comme des indicateurs pertinents du risque zoonotique. Néanmoins, nos résultats ne nous permettent pas de conclure sur les formes cliniques potentiellement associées à la fièvre Q chez le cheval. À l’avenir, les résultats obtenus dans ce travail de thèse permettront une meilleure compréhension de la dynamique de circulation et des conséquences de l’infection par C. burnetii en élevages de ruminants domestiques et de chevaux. Ces données permettront in fine d’améliorer la surveillance, le diagnostic ainsi que la mise en œuvre de mesures de gestion sanitaire de la fièvre Q en santé publique et vétérinaire. / Q fever is a worldwide zoonosis, due to a strict intracellular bacterium: Coxiella burnetii. Domestic ruminants mainly shed the bacteria in parturition products, vaginal mucus and feces. Humans and animals infect by inhalation of circulating pseudo-spores into the environment.Public and veterinary health issues therefore motivated the implementation of this PhD project in order to better control C. burnetii infections on farms. The objectives of this thesis were to provide descriptive epidemiological findings about: (a) circulation dynamics of C. burnetii in a naturally infected flock of sheep; (b) the genotypic diversity of circulating C. burnetii strains on domestic ruminant farms in France; (c) the phenotypic diversity of these strains as demonstrated by the use of two virulence models, one in vivo and one in vitro; and (d) the involvement of horses in the epidemiology of C. burnetii, by studying their exposure and a potential symptomatology.Longitudinal follow-up in a flock of sheep provided relevant tools to rapidly assess the risk of C. burnetii transmission when a flock was identified as infected, in terms of animal pens, diagnostic tools, or sampling periods to be preferred. We also identified three main genotypic groups of circulating strains in domestic ruminant farms in France where Q fever abortion were recorded. Two genotypic groups mainly included small ruminants, with one group mainly composed of sheep and the other mainly composed of goats. The third genotypic group was comprised almost exclusively of cattle. We have shown that the IS1111 gene significantly impacts the genotypic MLVA diversity observed. In addition to this species specificity, we have shown that the circulating genotypes in France were also spatiotemporally stable. We then developed two models of infection, one in vivo by inoculating CD1 male mice in the footpad of and one in vitro by infecting two macrophage cell lines: one bovine (SV40) and one ovine (MoCl4). These two models allowed us to show that the genotypic clusters were not systematically correlated with both the four phenotypic clusters identified in vivo from the analysis of the bacterial load in the mouse spleens and the analysis in vitro of the C. burnetii multiplication kinetics.Finally, the seroprevalence observed in horses within hyperendemic areas for Q fever in humans (Camargue and Plain of La Crau) suggests that horses are exposed to the bacteria in the area and that they may be a relevant indicator of the zoonotic risk. Nevertheless, our results were inconclusive on the clinical forms associated with Q fever in horses.In the future, the findings found in our work will allow a global understanding of the circulation dynamics of C. burnetii on domestic ruminant farms as well as in others animal species. Thus, all these data will ultimately improve surveillance, diagnosis and management of Q fever in public and veterinary health.

Le goéland leucophée endémique dans la région méditerranéenne française. Son mycobiote intestinal n'a jamais été étudié. Ce travail visait à décrire le rôle de ces oiseaux comme réservoir et disséminateur de champignons pathogènes pour l’homme. Nous avons collecté 177 guano de goélands dans cinq sites sur le littoral méditerranéen français; La Grande-Motte, Palavas-les-Flots, Pierre-Blanche, Frioul and Riou archipels. Nous avons identifié dix-sept espèces de levure; les plus fréquentes étant Candida krusei, Galactomyces geotrichum, C. glabrata et C. albicans. On notait d’une part une augmentation de la fréquence des espèces anthropiques de levures C. glabrata et C. albicans avec l’anthropisation des biotopes des colonies de goélands dont d’isolats résistants aux antifongiques. Nous avons analysé les communautés de champignons filamenteux aérocontaminants isolés à partir des mêmes échantillons. Nous avons identifié 16 genres de champignons filamenteux. la faible diversité et abondance de champignons filamenteux dans les zones urbaines par rapport aux suburbains ou à un environnement peu affecté par l'anthropisation et l’association claire entre certaines espèces fongiques et des environnements particuliers. nous avons analysé la génétique des populations de la levure C. glabrata. Nous avons typé par MLVA, 111 isolats de goélands et 79 isolats collectés chez des patients des hôpitaux de Nîmes, Montpellier et Marseille. Nous avons observé une diversité génétique similaire entre les populations de C. glabrata isolées chez le goéland ou chez l’homme. Les isolats de C. glabrata résistants au fluconazole se distribuaient uniformément dans les deux populations. / The yellow-legged gull is endemic in the French Mediterranean area. Their gut mycobiota has never been studied. This work aimed to describe their role in the spreading of potentially human pathogenic fungi with antifungal resistance. Therefore, we sampled 177 yellow-legged gull’s faecal samples in five sites along the Mediterranean littoral South of France; La Grande-Motte, Palavas-les-Flots, Pierre-Blanche, Frioul and Riou archipelagos. We identified seventeen yeast species; the most frequent were Candida krusei, Galactomyces geotrichum, C. glabrata, C. albicans and Saccharomyces cerevisiae. The frequency of the anthropic yeast species C. glabrata and C. albicans increased with the synanthropy of the gull’s colonies and antifungal resistance was found in each of the five most frequent yeast species. We further analyzed the airborne filamentous fungi species isolated from the same sample cultures. We identified 35 filamentous fungi species in 16 genera including 35 species. Both fungal diversity and abundance were low in urban area when compared to suburban ecocline or environments that were little affected by anthropogenic impact and particular fungal species were clearly associated with distinct environments. Finally, we analyzed the population genetic of the human pathogenic yeast C. glabrata, which were isolated from gulls (111 isolates) and from patients (79 isolates) in Nimes, Montpellier and Marseille hospitals, via MLVA analysis. We found that the C. glabrata populations isolated from gulls or humans shared a similar genetic diversity. Antifungal-resistant C. glabrata isolates were evenly distributed in both gull and human populations.

Chlamydia trachomatis est une bactérie à développement intracellulaire obligatoire, divisée en 19 sérovars parmi lesquels les sérovars D-K sont responsables d’infections oculo-génitales et les sérovars L de la lymphogranulomatose vénérienne (LGV). En France, C. trachomatis est le principal agent bactérien responsable d’infections sexuellement transmissibles (IST). Les méthodes moléculaires occupent une place de choix dans le dépistage et l’épidémiologie des infections à C. trachomatis. Grâce à leur utilisation à partir de prélèvements non invasifs, nous disposons de chiffres de prévalence qui s’élèvent à 1,5% dans la population générale, 3,6% chez les femmes âgées de 18 à 24 ans sexuellement actives et 10 à 15% dans les centres à vocation de dépistage des IST. N’ayant aucune donnée chez la femme enceinte, le programme hospitalier de recherche clinique (MATIST) que nous avons mis en place chez les femmes enceintes suivies au CHU de Bordeaux a montré une prévalence de l’infection à C. trachomatis de 2,5%, à M. genitalium de 0,8% et à N. gonorrhoeae de 0%. Chez les femmes de moins de 24 ans, la prévalence était respectivement de 7,9% et 2,4%. La compréhension de l’épidémiologie et de la dissémination des infections à C. trachomatis nécessite la mise au point de techniques de typage performantes d’autant qu’un seul sérovar, le sérovar E, est rencontré dans près de la moitié des cas. Nous avons développé une méthode de typage moléculaire, la MLVA (MultiLocus Variable Number of Tandem Repeat Analysis), qui analyse le polymorphisme associé aux répétitions en tandem et permet un typage intra-sérovar. Cinq VNTRs ont été identifiés. La méthode a été automatisée puis appliquée à 220 souches et échantillons cliniques de C. trachomatis de génovar E, permettant d’identifier 25 types MLVA. Les souches d’origine ano-rectale isolées de patients homosexuels et les souches suédoises appartenant au nouveau variant ont été individualisées au sein de deux types MLVA uniques et distincts, suggérant une origine clonale. L’ensemble des résultats obtenus ont montré que la MLVA est un outil de typage moléculaire performant, plus discriminant que les autres méthodes auxquelles nous l’avons comparée. De plus, dans le cadre de la surveillance épidémiologique de la LGV ano-rectale due au variant L2b qui sévit en Europe depuis 2003 presque exclusivement chez les homosexuels, nous avons identifié le premier cas de LGV ano-rectale chez une femme. Enfin, nous avons développé une technique de PCR en temps réel permettant une détermination objective de la concentration minimale inhibitrice d’un antibiotique donné vis-vis de C. trachomatis. Cette technique a également montré que les antibiotiques étudiés n’avaient qu’une activité bactériostatique sur C. trachomatis. / Chlamydia trachomatis is an obligate intracellular bacterium, divided into 19 serovars, among which serovars D-K are responsible for oculo-genital infections and serovars L of lymphogranuloma venereum (LGV). In France, C. trachomatis is the main bacterial cause of sexually transmitted diseases (STI). Molecular methods are the methods of choice for the C. trachomatis detection and epidemiology. Through their use, it has been shown that the prevalence of C. trachomatis infection rise up to 1.5% in the general population, to 3.6% for sexually experienced women aged 18-24 and to 10-15% in STI medical settings. As no data were available for pregnant women, we conducted a clinical research study (MATIST) in pregnant women at the Bordeaux University hospital. The prevalence of C. trachomatis, M. genitalium and N. gonorrhoeae infections was 2.5%, 0.8% and 0%, respectively. In women under 24 years, the prevalence of C. trachomatis, and M. genitalium infections was 7.9% and 2.4%, respectively. Understanding the epidemiology and the spread of C. trachomatis infection requires the development of efficient typing techniques knowing that a single serovar, serovar E, is found in nearly half the cases. We developed a MLVA (MultiLocus Variable-Number of Tandem Repeat Analysis) method which analyzes the genome polymorphism associated to tandem repeats and allowed intra-serovar subtyping. Five VNTRs were identified. The automated method was applied on 220 C. trachomatis genovar E clinical specimens and isolates, yielding 25 MLVA types. All anorectal isolates from men who have sex with men exhibited the same MLVA type, suggesting clonal spread. In the same way, we confirmed the clonal origin of the Swedish new variant of C. trachomatis. MLVA appears to be a good tool for molecular typing, with a higher discriminatory power than those of other methods used for comparison. Since 2003, a LGV proctitis outbreak caused by the new variant L2b has been reported in Europe in men who have had sex with HIV-positive men. We reported the first case of C. trachomatis L2b proctitis diagnosed in a woman. Finally, we developed a real-time PCR method allowing an objective determination of minimum inhibitory concentration of antibiotics for C. trachomatis. Our results also showed that all antibiotics studied only had bacteriostatic activity on C. trachomatis.

La sécurité alimentaire est basée sur des systèmes de cultures durables. Les agents phytopathogènes présentent un risque sérieux pour la stabilité de l'agriculture mondiale. Dans ce contexte, la biosurveillance des agents phytopathogènes s'avère indispensable afin de connaitre et de comprendre la répartition, les routes et les facteurs de dispersion des populations phytopathogènes, et de prendre les mesures adaptées pour limiter leur propagation. Le genre bactérien Xanthomonas comprend un ensemble d'espèces phytopathogènes-spécifiques s'attaquant a une large gamme d'espèces végétales dont certaines sont importantes pour la production agricole. Les deux espèces d'étude, i.e les pathovars de Xanthomonas oryzae (Xo) et Xanthomonas axonopodis pathovar manihotis (Xam), pathogènes respectivement du riz et du manioc, font partie du « top 10 » des bactéries phytopathogènes d'importance majeure dans le monde. Des travaux portant sur l''épidémiosurveillance de ces bactéries phytopathogenes doivent pouvoir être mis en place en routine. L'objectif est de typer et de relier ces souches bactériennes à différentes échelles géographiques, ainsi que de détecter et caractériser les épidémies de manière précoce. Pour ce faire, plusieurs approches de typage moléculaire à haut niveau de résolution ont été explorées. Des marqueurs moléculaires basés sur les loci VNTR (Variable Number of Tandem repeats) ont été étudiés. Chez X. oryzae, un outil MLVA-25 (Multilocus VNTR Analysis) pour le pathovar Xanthomonas oryzae pv. oryzicola (Xoc) et un outil MLVA-16 pour les trois lignées génétiques de X. oryzae ont été développés. L'étude par le MLVA-16 de populations de X. oryzae a permis de caractériser des complexes clonaux généralement associés à de nouvelles épidémies. La description de nouvelles souches de Xoc en Afrique Centrale et Afrique de l'Est indique une provenance vraisemblablement d'origine asiatique. Chez Xam, la recherche de loci VNTR polymorphiques sur 65 génomes de Xam complets a abouti à la description de seize loci VNTR robustes donc cinq ont été ensuite utilisés pour l'étude de populations de Xam dans les plaines de l'est Colombien. Cette dernière étude met en avant une structuration des populations de Xam selon les régions. Enfin, une méthode de spoligotypage associée aux locus CRISPR-Cas (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats) et des marqueurs minisatellites ont été développés chez les souches du pathovar Xanthomonas oryzae pv. oryzae (Xoo). Les analyses préliminaires ont permis de définir la composition de la cassette CRISPR et de proposer des outils de spoligotypage utiles pour les souches asiatiques de Xoo. D'autre part, 18 marqueurs minisatellites ont indiqué une corrélation significative avec les races des souches et peuvent servir à l'étude plus large de populations Xoo philippines ou asiatiques. En conclusion, des nouvelles approches de typage moléculaire ont été évaluées, mises au point et employées avec succès pour étudier les bactéries pathogènes du riz et du manioc appartenant au genre Xanthomonas. / Food and agriculture safety rely on durable cropping systems. Consequently, phytopathogens pose a serious risk for durable agriculture in the world. In this context, surveillance of phytopathogens is a mandatory prerequisite in order to understand and to predict pathogen repartition, dispersion routes and factors, and to trigger appropriate measures to reduce the pathogen's propagation. The genus Xanthomonas displays a large diversity of host-specific plant-pathogenic species that infect a wide range of plant species, including commercially grown crops. The two studied species, i.e. the rice-pathogenic Xanthomonas oryzae and the cassava-pathogenic Xanthomonas axonopodis pathovar manihotis (Xam), belong to the top-10 of phytopathogenic bacteria and are thus of major interest. Routine epidemiological surveillance of these bacteria has to be achieved in order to type and link strains at different geographic scales as well as to characterize outbreaks and epidemics. For this purpose, several high-resolution molecular typing approaches were explored. Firstly, VNTR (Variable Number of Tandem repeats)-based molecular markers were studied. For X. oryzae, multilocus VNTR analyses (MLVA) were developed: MLVA-25 for the pathovar oryzicola (Xoc) and MLVA- 16 for the three known lineages of X. oryzae. A large population study of X. oryzae by MLVA-16 allowed us to characterize genetic clonal complexes, which were likely associated with new epidemics. Also, the novel description of Xoc strains from central and east Africa indicated their probable Asian provenance. For Xam, the exploration of polymorphic VNTR loci in 65 available genome sequences allowed the description of sixteen robust VNTR loci. Among them, five highly polymorphic loci were further used in a population study of Xam in the eastern plain of Colombia. The results provided evidence of a geographical Xam population structuration. Secondly, CRISPR (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats)-associated spoligotyping and minisatellites markers were explored for a largely divergent set of Philippine strains of Xanthomonas oryzae pv. oryzae (Xoo). Both approaches were compared to genome-wide SNPs and races. Preliminary studies identified the composition of CRISPR arrays, which could be useful for a spoligotyping approach. On the other hand, 18 minisatellites markers revealed a significant correlation with races and could be used for a larger study of Philippine or Asian Xoo populations. In conclusion, novel molecular typing approaches were successfully evaluated, implemented and used to study rice- and cassava-pathogenic bacteria of the genus Xanthomonas.

Salmonella (S.) enterica est reconnue comme le principal agent causal de la salmonellose chez l’homme et les animaux. La distribution épidémiologique de cette infection implique souvent des régions géographiques éloignées; il est ainsi nécessaire de posséder des méthodes fiables afin de pouvoir discriminer des souches responsables d’une épidémie. En raison des limites de la méthode de typage sérologique, de nombreuses méthodes de génotypage moléculaire ont été développées. En particulier, la méthode par PCR couplée à l’électrophorèse en champ pulsé, qui est utilisée pour la séparation et la caractérisation des molécules d’ADN, et le génotypage par analyse de répétition en tandem polymorphe ou MLVA (Multiple-Locus VNTR Analysis), sont des méthodes modernes qui permettent d’étudier le polymorphisme et la diversité génétique des souches de S. enterica liées à une épidémie. Dans notre étude, onze marqueurs contenant des régions de répétitions en tandem polymorphique (VNTR : Variable Number Tandem Repeats) sélectionnés à partir du génome de S. enterica Typhimurium LT2 ont été utilisés pour évaluer la diversité génétique de 206 souches de S. enterica sélectionnées entre 2001 et 2007. Ces salmonelles sont représentées par 31 sérotypes, ont été isolées à partir de trois sources: hommes, aliments cuits et crus. Chaque souche a été isolée à partir d’échantillon unique et n’était liée à aucun épisode d’intoxication alimentaire ou à une épidémie de salmonellose connue. La technique MLVA a permis de sous typer 107 génotypes regroupés dans un dendrogramme en deux branches distintes dont la première et constituée par Salmonella Typhi et la deuxième par les 30 autres sérotypes liés entre eux par un ancêtre commun. Parmi les sérotypes, quatre ont été répartis dans deux à cinq branches phylogénétiques. La représentation de la variation allélique des sérotypes de S. enterica a utilisé l’arbre minimum couvrant sans racine. Des variations alléliques pour des sérotypes de S. enterica précédemment ou nouvellement décrits ont été identifiées et des variants génétiques ont été répartis en types ou en variants MLVA à loci uniques, en variants différents par un locus (SLVs), en variants différant par deux loci (DLVs) et des variants différant par plus de deux loci. Quatre marqueurs (STTR3, STTR5, STTR8 et Sal20) ont présenté un indice de diversité élevé (DI> 0,80). En résumé, la technique MLVA peut être appliquée pour étudier le profil génétique de S. enterica avec une grande diversité de sérotypes. / Epidemiological distribution of this infection often involves large areas of geographically distant, and reliable methods to discriminate strains responsible for an epidemic are necessary. Due to limitations of serological typing method, many molecular genotyping methods have been developed. Some molecular methods and their applications are: PCR coupled to PFGE, which is used for the separation and characterization of molecular profiles, and MLVA (Multiple-Locus VNTR Analysis) genotyping, or so called analysis of polymorphic tandem repeats are modern methods that allow study of the polymorphic genetic diversity and discrimination of Salmonella strains related or unrelated to epidemics. In our study, 11 markers containing polymorphic tandem repeats (VNTR: Variable Number Tandem Repeats) selected from the genome of S. enterica Typhimurium LT2 were used to assess the genetic diversity of 206 strains of S. enterica selected in 2001-2007 period. These are represented by 31 Salmonella serotypes selected from three sources: human, food and animals. Each strain was isolated from a single sample and was not related to an episode of epidemic of salmonellosis. The technique MLVA has allowed subtyping of 107 genotypes grouped in a dendrogram into two distinct dispersion trees, the first for serotype Typhi and the second for the other 30 serotypes devided within two subgroups derived from a common ancestor. Four serotypes were dispersed in two to five phylogenetic branches. The representation of the allelic variation of serotypes of S. enterica used a minimum spanning tree. Allelic variations in the serotypes of S. enterica, previously or newly described, were identified and genetic variants were distributed in MLVA types in unique locus variants, in single locus variants or in variants different by a locus (SLVs), in variants different by two loci (DLVs) and in different variants by more than two loci. Four markers (STTR3, STTR5, STTR8, and Sal20) have shown a high Diversity Index (DI> 0.80). In summary, MLVA can be applied to study the genetic profile of S. enterica with a wide variety of serotypes.