Thesis (M. Med. Sc.)--University of Hong Kong, 2005.

Thesis (Ph. D.)--Virginia Commonwealth University, 2006. / Prepared for: Dept. of Chemistry . Bibliography: leaves 102 - 109. Also available online.

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Uma vez que poucas drogas são ativas frente ao Mycobacterium tuberculosis, torna-se muito importante se conhecer os mecanismos que levam a resistência e, embora, tenha-se aprendido muito sobre a resistência, ainda existem alguns antimicrobianos onde esse mecanismo não está completamente elucidado. A aquisição da resistência aos antimicrobianos em bactérias, por sua vez, é frequentemente associada com a perda de fitness e é muito importante a determinação do fitness na população, já que, ele pode influenciar a o futuro da epidemia de isolados resistentes a múltiplas drogas. As mutações associadas com a resistência a estreptomicina nos genes rpsL e rrs são bem conhecidas e podem explicar em torno de 70% da resistência fenotípica. Mutações no gene gidB foram descritas recentemente em isolados clínicos de M. tuberculosis como associadas com a resistência a baixas concentrações de estreptomicina. Nesse estudo, mutações em gidB ocorreram em 27% das cepas resistentes a estreptomicina sem mutações nos genes rpsL e rrs. Duas mutações foram consideradas polimorfismos, gidB16 (alelo 16G) foi identificado exclusivamente no genótipo Latin American Mediterranean, enquanto que gidB92 (alelo 92C) foi associado com a linhagem Beijing. O fitness de 21 cepas multidroga resistentes de M. tuberculosis foi estudado através do método de quantificação da redução da resazurina, enquanto o fitness de 78 cepas foi estudado através de curvas de crescimento utilizando o mycobacterial growth indicator tube e estudos de competição com alguns isolados selecionados. Em geral, analisando-se as curvas de crescimento, em ambos os estudos as cepas com mutações K43R em rpsL e S531L em rpoB ou cresceram melhor ou sem diferença do isolado sensível, já os isolados com mutações em rpoB- não em S531L e com mutações em mais de um gene cresceram em média mais lentamente que os isolados sensíveis. Quanto às diferentes linhagens, no primeiro estudo, os isolados classificados como Latin American Mediterranean cresceram mais rápido no parâmetro tamanho da fase lag, mas sem nenhuma diferença na fase logarítmica, já no segundo estudo, o resultado foi diferente, as cepas não-Latin American Mediterranean cresceram em média mais rapidamente, mas sem diferença estatística das cepas Latin American Mediterranean, e também cresceram melhor nos ensaios de competição. O fitness dos isolados clínicos estudados é muito heterogêneo, possivelmente devido ao fato desses isolados apresentarem diferentes graus de resistência às drogas, diferentes mutações nos genes e ainda diferentes genótipos. Em ambos os estudos foi possível afirmar que as mutações mais encontradas em isolados clínicos são as mutações não relacionadas com a perda do fitness ou que geram pouco custo biológico ao isolado. / Since few drugs are active against the Mycobacterium tuberculosis, it is very important to know the mechanisms that lead to resistance and, although much has been learned about the resistance, there are still some antimicrobials where it is not fully understood. The acquisition of antimicrobial resistance in bacteria is often associated with a loss in fitness and it is very important to have the fitness determined in the population, since it can influence the future of the multidrug isolates epidemic. Mutations related to streptomycin-resistance in the rpsL and rrs genes are well known and can explain about 70% of the phenotypic resistance. Mutations in the gidB gene were described recently as being associated with resistance to low concentrations of streptomycin in strains of M. tuberculosis. In this study, mutations in gidB occurred in 27% of streptomycin-resistant strains without mutations in the rrs and rpsL genes. Two mutations were considered polymorphisms, gidB16 (16G allele) was found exclusively in Latin American Mediterranean genotype, while gidB92 (92C allele) was associated with Beijing lineage in another population. The fitness of 21 multidrug resistant strains of M. tuberculosis was studied by the method of quantitative resazurin reduction assay and fitness of 78 strains was studied by growth curves in mycobacterial growth indicator tube and competition assays using some selected strains. In general, analyzing the growth curves in both studies the strains with the mutations rpsL K43R and rpoB S531L grew better or with no difference from the susceptible strain, on the other hand, strains with mutations in rpoB-but not S531L and with mutations in more than one gene grew, on average, more slowly than susceptible ones. Regarding the different lineages from the first study, strains classified as Latin American Mediterranean grew faster in the parameter of the lag phase, but with no difference in the logarithmic phase. In the second study, the outcome was different, non- Latin American Mediterranean strains grew faster on average, but with no statistical difference from Latin American Mediterranean strains, and also grew well in the competition assays. The fitness of the clinical isolates studied is very heterogeneous, possibly because these isolates present varying degrees of drug resistance, different mutations in the genes analyzed and even different genotypes. In both studies we can say that the frequently mutations found in clinical isolates are the mutations related with no fitness cost or that generate little fitness cost.

Resumo não disponível.

Uma vez que poucas drogas são ativas frente ao Mycobacterium tuberculosis, torna-se muito importante se conhecer os mecanismos que levam a resistência e, embora, tenha-se aprendido muito sobre a resistência, ainda existem alguns antimicrobianos onde esse mecanismo não está completamente elucidado. A aquisição da resistência aos antimicrobianos em bactérias, por sua vez, é frequentemente associada com a perda de fitness e é muito importante a determinação do fitness na população, já que, ele pode influenciar a o futuro da epidemia de isolados resistentes a múltiplas drogas. As mutações associadas com a resistência a estreptomicina nos genes rpsL e rrs são bem conhecidas e podem explicar em torno de 70% da resistência fenotípica. Mutações no gene gidB foram descritas recentemente em isolados clínicos de M. tuberculosis como associadas com a resistência a baixas concentrações de estreptomicina. Nesse estudo, mutações em gidB ocorreram em 27% das cepas resistentes a estreptomicina sem mutações nos genes rpsL e rrs. Duas mutações foram consideradas polimorfismos, gidB16 (alelo 16G) foi identificado exclusivamente no genótipo Latin American Mediterranean, enquanto que gidB92 (alelo 92C) foi associado com a linhagem Beijing. O fitness de 21 cepas multidroga resistentes de M. tuberculosis foi estudado através do método de quantificação da redução da resazurina, enquanto o fitness de 78 cepas foi estudado através de curvas de crescimento utilizando o mycobacterial growth indicator tube e estudos de competição com alguns isolados selecionados. Em geral, analisando-se as curvas de crescimento, em ambos os estudos as cepas com mutações K43R em rpsL e S531L em rpoB ou cresceram melhor ou sem diferença do isolado sensível, já os isolados com mutações em rpoB- não em S531L e com mutações em mais de um gene cresceram em média mais lentamente que os isolados sensíveis. Quanto às diferentes linhagens, no primeiro estudo, os isolados classificados como Latin American Mediterranean cresceram mais rápido no parâmetro tamanho da fase lag, mas sem nenhuma diferença na fase logarítmica, já no segundo estudo, o resultado foi diferente, as cepas não-Latin American Mediterranean cresceram em média mais rapidamente, mas sem diferença estatística das cepas Latin American Mediterranean, e também cresceram melhor nos ensaios de competição. O fitness dos isolados clínicos estudados é muito heterogêneo, possivelmente devido ao fato desses isolados apresentarem diferentes graus de resistência às drogas, diferentes mutações nos genes e ainda diferentes genótipos. Em ambos os estudos foi possível afirmar que as mutações mais encontradas em isolados clínicos são as mutações não relacionadas com a perda do fitness ou que geram pouco custo biológico ao isolado. / Since few drugs are active against the Mycobacterium tuberculosis, it is very important to know the mechanisms that lead to resistance and, although much has been learned about the resistance, there are still some antimicrobials where it is not fully understood. The acquisition of antimicrobial resistance in bacteria is often associated with a loss in fitness and it is very important to have the fitness determined in the population, since it can influence the future of the multidrug isolates epidemic. Mutations related to streptomycin-resistance in the rpsL and rrs genes are well known and can explain about 70% of the phenotypic resistance. Mutations in the gidB gene were described recently as being associated with resistance to low concentrations of streptomycin in strains of M. tuberculosis. In this study, mutations in gidB occurred in 27% of streptomycin-resistant strains without mutations in the rrs and rpsL genes. Two mutations were considered polymorphisms, gidB16 (16G allele) was found exclusively in Latin American Mediterranean genotype, while gidB92 (92C allele) was associated with Beijing lineage in another population. The fitness of 21 multidrug resistant strains of M. tuberculosis was studied by the method of quantitative resazurin reduction assay and fitness of 78 strains was studied by growth curves in mycobacterial growth indicator tube and competition assays using some selected strains. In general, analyzing the growth curves in both studies the strains with the mutations rpsL K43R and rpoB S531L grew better or with no difference from the susceptible strain, on the other hand, strains with mutations in rpoB-but not S531L and with mutations in more than one gene grew, on average, more slowly than susceptible ones. Regarding the different lineages from the first study, strains classified as Latin American Mediterranean grew faster in the parameter of the lag phase, but with no difference in the logarithmic phase. In the second study, the outcome was different, non- Latin American Mediterranean strains grew faster on average, but with no statistical difference from Latin American Mediterranean strains, and also grew well in the competition assays. The fitness of the clinical isolates studied is very heterogeneous, possibly because these isolates present varying degrees of drug resistance, different mutations in the genes analyzed and even different genotypes. In both studies we can say that the frequently mutations found in clinical isolates are the mutations related with no fitness cost or that generate little fitness cost.

Os estudos sobre a resistência de Mycobacterium tuberculosis aos fármacos utilizados no tratamento da tuberculose (TB), vêm sendo cada vez mais explorados com o objetivo de entender melhor como funcionam os mecanismos utilizados pela micobactéria. A partir do aumento da transmissão ativa de linhagens de M. tuberculosis resistentes às drogas, tanto no Rio Grande do Sul quanto em outras regiões do Brasil, fez-se necessário um estudo relativo à resistência de M. tuberculosis à pirazinamida (PZA) e etambutol (EMB). Sabe-se até o momento que existem genes específicos que, possivelmente sejam alvos de alterações e podem proporcionar resistência ao M. tuberculosis, no entanto ainda não se têm relatos do tipo e da freqüência destas mutações nos isolados do nosso Estado e de outros locais do Brasil. Sendo assim, neste trabalho buscou-se estudar isolados de M. tuberculosis, fenotipicamente caracterizados como resistentes à PZA e/ou EMB e determinar seu perfil de susceptibilidade a partir de caracterização das mutações nos genes pncA e embB, envolvidos respectivamente com a resistência à PZA e EMB. A metodologia utilizada foi baseada primeiramente na caracterização dos isolados pelos métodos tradicionais (testes fenotípicos de susceptibilidade) seguida de extração de DNA, amplificação dos genes alvo e posteriormente seqüenciamento dos mesmos. A partir da análise das seqüências obtidas foi possível caracterizar 12 novas mutações no gene pncA, distribuídas ao longo de todo o gene, que possivelmente estejam envolvidas com a resistência dos respectivos isolados à PZA. A análise dos isolados resistentes à EMB demonstrou que nossos isolados apresentam alterações somente no códon 306 do gene embB de M. tuberculosis. Após este estudo, será possível avaliar a ocorrência das mutações nos genes específicos e inferir sobre a possível interferência das mesmas nos mecanismos relacionados com a resistência a essas drogas. Conhecendo melhor os isolados de nosso país, poderemos fornecer informações para o desenvolvimento de um melhor método de detecção da resistência. Este método, depois de adequadamente testado poderá colaborar de forma decisiva nos programas de controle da tuberculose. / Extensive research about Mycobacterium tuberculosis resistance to drugs used in tuberculosis (TB) treatment has been performed in order to have a better understanding of the mechanisms used by mycobacteria. Once active transmission of drug resistant strains of M. tuberculosis has been occurring both in Rio Grande do Sul State and in other regions of Brazil, it brought up the need of performing a study related to M. tuberculosis pyrazinamide (PZA) and ethambutol (EMB) resistance. It is known that specific genes are targets of alterations, which can lead to M. tuberculosis resistance, however, up to this moment there are no records about types or frequencies of those mutations in isolates from Rio Grande do Sul State and other sites in Brazil. Thus, in this study we aimed to evaluate M. tuberculosis isolates phenotypically characterized as PZA and/or EMB resistant, in order to determine their susceptibility profile based on the characterization of mutations in pncA and embB genes, involved in PZA and EMB resistance, respectively. Methodology used in the study was primarily based on the characterization of isolates by conventional methods (phenotypic susceptibility tests) followed by DNA extraction, target genes amplification and DNA sequencing. Sequence analysis revealed 12 novel mutations in pncA gene distributed all along the gene and they are possibly involved with PZA resistance in those isolates. Analysis of EMB resistant isolates showed our isolates presented alterations at codon 306 of embB gene of M. tuberculosis only. From this study it will be possible to evaluate the presence of mutations in specific genes in order to establish a correlation between their occurrence and the effects in the mechanisms related to the emergence of resistance to those drugs. Improving our knowledge about the isolates in our country we will be able to provide information that can be useful for the development of a methodology for the early detection of resistance. This methodology, if properly tested and validated can be highly helpful for the improvement of TB control programs.

A tuberculose (TB) é uma das maiores causas de mortalidade em todo o mundo por um único agente infeccioso. Segundo a Organização Mundial da Saúde (OMS), todos os anos cerca de 8 milhões de pessoas são infectadas pelo Mycobacterium tuberculosis, o agente etiológico da TB, e aproximadamente 2 milhões morrem em todo mundo. Desde a década de 80, o aumento da prevalência da TB em países em desenvolvimento, o aumento e a proliferação de cepas resistentes a múltiplas drogas, a falta de recursos públicos adequados para o tratamento e a alta incidência de pacientes infectados pelo HIV, destacou a necessidade de desenvolver novos agentes antimicobacterianos. A via do ácido chiquímico ou chiquimato está presente em bactérias, algas, fungos, plantas e parasitas do filo apicomplexa. Esta via leva a biossíntese de corismato, um importante precursor metabólico de ácido fólico, menaquinonas, micobactinas e aminoácidos aromáticos. A primeira reação na biossíntese de fenilalanina é catalizada pela corismato mutase e involve a conversão de corismato a prefenato. A segunda reação é catalisada pela prefenato desidratase que realiza a descarboxilação e desidratação de prefenato a fenilpiruvato. As enzimas presentes na via do chiquimato e biossíntese de fenilalanina parecem ser essenciais ao M. tuberculosis, o que as torna promissoras como alvo para o desenvolvimento de novas drogas antimicobacterianas. O gene pheA que codifica a enzima prefenato desidratase (PDT) foi amplificado por PCR do DNA genômico, clonado em vetor pET23a(+) e superexpresso em células E.coli BL21(DE3). A proteína recombinante foi purificada por FPLC e a cristalização foi realizada pela técnica de difusão de vapor “hanging drop”. Os primeiros cristais apareceram sete dias após as gotas terem sido feitas. Cristais difrataram a 3.2 Å de resolução usando uma fonte de radiação síncrotron e pertencem ao grupo orthorrombico I222 ou I212121. Análise da estrutura por substituição molecular foi realizada, contudo os resultados não foram satisfatórios. Assim, outras ferramentas foram utilizadas para inferir a estrutura da PDT. A técnica de modelagem molecular foi usada para inferir a estrutura tridimensional da PDT. Dicroísmo circular e ferramentas de bioinformática mostraram resultados similares quanto à estrutura secundária, sendo formada por 33% de hélices alfas e 18% de fitas betas. Dessa maneira, técnicas de espalhamento de raios X a baixo ângulo somado com ultracentrifugação analítica mostraram que o estado oligomérico da PDT é um homotetrâmero e com forma de um disco achatado. Dinâmica molecular demonstrou que o modelo predito é estável durante uma trajetória de 6ns. Dados experimentais e ferramentas de bioinformática corroboram os resultados aqui apresentados, dando evidências da estrutura tetramérica da PDT em solução. Além disso, este é o primeiro relato da caracterização estrutural da PDT de M.tuberculosis. / Tuberculosis (TB) is one of the major causes of deaths worldwide from an infectious agent. According to the World Health Organization (WHO), every year 8 million people are infected by Mycobacterium tuberculosis, the etiological agent of TB, and approximately 2 million people died in the world. Since 1980’s the increasing of prevalence of TB in developing countries, the emergence and proliferation of multidrug-resistant and extensively drug resistant strains, the lack of adequate public resources for treatment and the high incidence of HIV-infected populations have highlighted the need for developing new antimycobacterial agents. The shikimate pathway is present in mycobacteria and absent in algae, plants, fungi and parasite of the phylum apicomplexa. This pathway leads to the biosynthesis of chorismate, an important metabolic precursor of folic acid, menaquinones, mycobactinas and aromatic amino acids. The first reaction in phenylalanine biosynthesis is catalysed by chorismate mutase and involves the conversion of chorismate to prephenate. The second reaction is catalysed by prephenate dehydratase and involves the decarboxilation and dehydratation of prephenate to phenylpiruvate. The enzymes of this pathway seem to be essential to M. tuberculosis and can thus be used as targets for the development of new antimycobacterial drugs. The pheA gene that encodes to prephenate dehydratase (PDT) was amplified by PCR from genomic DNA, cloned in pET23a(+) and overexpressed in E. coli BL21(DE3). The recombinant protein was purified by FPLC, and crystallization was performed by the hanging drop vapor diffusion method. Crystals appear seven days after drops were done. The crystal diffracted at 3.2 Å resolution using a synchrotron radiation source and belong to the orthorhombic group I222 or I212121. Molecular replacement was used to solve the structure of PDT, but did not yield meaningful results. Other tools were used to infer the structural arrangement of PDT. Molecular modeling were used to infer the three dimensional structure of PDT. Circular dicroism and bioinformatics tools were in agreement in about secondary structure, showing 33% of -helix e 18% of beta sheet. Small Angle X-Ray scattering and analytical centrifugation showed that the oligomeric state of this protein is a homotetramer and the PDT is a flat disk protein. Molecular dynamics showed that this model is stable at a trajectory of 6ns. Experimental and bioinformatics tools were in agreement and provide evidence for a tetrameric structure of PDT at solution. Therefore, this is the first report of a structural characterization of PDT from M.tuberculosis.

A tuberculose permanece sendo a principal causa de morte no mundo devido a um único agente infeccioso, Mycobacterium tuberculosis. O surgimento de cepas multi- e extensivamente-resistentes tem aumentado a perspectiva de uma futura epidemia de casos de tuberculose sem tratamento. Faz-se cada vez mais urgente a necessidade do desenvolvimento de novas drogas e vacinas, tanto para encurtar o prazo de tratamento, como para combater as cepas resistentes e o processo de latência que é estabelecido pelo bacilo. Os mecanismos moleculares pelos quais esta micobactéria estabelece infecção e latência ainda precisam ser esclarecidos. O estudo de proteínas associadas ao nucleóide tem sido um tema bastante promissor para o entendimento de mecanismos de invasão e persistência em vários microorganismos patogênicos, podendo auxiliar, também, no esclarecimento do metabolismo do bacilo para estas atividades. Neste estudo, descrevemos a caracterização inicial de uma fase de leitura identificada para uma proteína H-NS putativa de M. tuberculosis. A H-NS é uma das proteínas associadas ao nucleóide mais bem caracterizadas. O gene foi clonado, expresso, e seu produto foi, então, purificado até sua homogeneidade. Ensaios de ligação a DNA qualitativo, utilizando o EMSA, e quantitativo, por meio de ressonância plasmônica de superfície, foram realizados para a comprovação de sua atividade, tendo sido proposto um mecanismo de ligação ao DNA. Além disso, estudos de complementação realizados com a utilização de uma cepa de Escherichia coli mutante para hns sugerem que esta proteína pertence a uma nova classe de proteínas associadas ao nucleóide presentes em Mycobacterium. / Tuberculosis remains the major cause of mortality due to a bacterial pathogen, Mycobacterium tuberculosis. The emergence of multidrug- and extensively drug-resistant strains have raised the bleak prospect of a future epidemic of virtually untreatable TB. More effective antimycobacterial agents, besides new vaccines or vaccination strategies, are thus needed to improve the treatment of resistant strains, to shorten the treatment course, and to provide more effective treatment of latent infection. The molecular mechanisms by which the bacillus establishes infection and persistence have not been completely elucidated. Studies involving nucleoid-associated proteins, which have been related to the control and influence of virulence genes in pathogenic bacteria, can help unveil the virulence process of M. tuberculosis. In this study, we describe the initial characterization of an open reading frame for the M. tuberculosis putative H-NS. This protein is one of the most studied members of the nucleoid-associated proteins family. The gene was cloned, expressed and its product purified to homogeneity. A qualitative protein-DNA binding assay was carried out by gel-retardation and the protein affinity for specific DNA sequences was assessed quantitatively by surface plasmon resonance. A protein-DNA binding mechanism is proposed. In addition, functional complementation studies of an E. coli hns mutant reinforce the likelihood that Rv3852 protein represents a novel nucleoid-associated protein in M. tuberculosis.

Tuberculosis (TB) is a neglected disease, which continue to be major cause of morbidity and mortality worldwide, killing together around 5 million people each year. Mycolic acids, the hallmark of mycobacteria, are high-molecular-weight α-alkyl, β-hydroxy fatty acids. Biochemical and genetic experimental data have shown that the product of the M. tuberculosis inhA structural gene (InhA) is the primary target of isoniazid mode of action, the most prescribed anti-tubercular agent. InhA was identified as an NADH-dependent enoyl-ACP(CoA) reductase specific for long-chain enoyl thioesters and is a member of the Type II fatty acid biosynthesis system, which elongates acyl fatty acid precursors of mycolic acids. M. tuberculosis is a target for the development of anti-tubercular agents. Here we present a brief description of the mechanism of action of, and resistance to, isoniazid. In addition, data on inhibition of mycobacterial enoyl reductase by triclosan are presented. We also describe recent efforts to develop inhibitors of M. tuberculosis enoyl reductase enzyme activity.