Mycoplasma hyopneumoniae é uma das menores bactérias presentes na natureza, apresentando um genoma reduzido com alto conteúdo de A+T e ausência de parede celular. Este organismo é o agente etiológico da pneumonia enzoótica suína, uma doença crônica que afeta rebanhos em todo mundo sendo responsável por grandes perdas econômicas. Para investigar a patogênese de M. hyopneumoniae é importante entender seus mecanismos genéticos, porém, apesar do sequenciamento do genoma de várias linhagens (7448, J, 232 e 168), pouco se sabe sobre os mecanismos que regulam e controlam a expressão gênica neste microrganismo, principalmente no que se relaciona às proteínas regulatórias. Os fatores de transcrição são proteínas que se ligam ao DNA e propiciam a capacidade de controlar a expressão gênica sob diferentes estímulos metabólicos ou condições de crescimento. O conhecimento que se tem sobre essas proteínas em M. hyopneumoniae é escasso, então, desta forma, este trabalho tem como objetivo a análise de potencias fatores de transcrição de M. hyopneumoniae. Para isso foram selecionadas proteínas tradicionalmente descritas em bancos de dados como fatores de transcrição (HrcA – MHP7448_0010; transcriptional regulator – MHP7448_0279; e a proteína hipotética MHP7448_0551), além de uma proteína hipotética que apresenta similaridades estruturais com fatores sigma (MHP7448_0639). Estas proteínas foram clonadas por recombinação homóloga in vivo no vetor de expressão pGEX 4T1 e transformadas em Escherichia coli para expressão das proteínas recombinantes. Porém, para empregar essa técnica foi necessário realizar a mutagênese sítio-dirigida para a substituição do códon UGA (triptofano em micoplasmas) para UGG (triptofano no código genético universal) nas proteínas que apresentavam este códon. As mutações foram inseridas através da técnica de overlap extension PCR, utilizando primers mutagênicos. Foram obtidos clones para três proteínas (MHP7448_0551, MHP7448_0639 e MHP7448_0010), que foram eficientemente expressas em E. coli. Depois de solubilizadas com 0,5% de sarcosil, essas proteínas foram submetidas a um processo de purificação por cromatografia de afinidade. A purificação foi bem sucedida para duas das três proteínas testadas, e novos testes serão realizados com a proteína ainda não purificada (MHP7448_0010). Uma vez purificados, os potenciais fatores de transcrição serão utilizados na identificação das regiões do DNA que essas proteínas regulam e que estão envolvidas no controle da expressão gênica em M. hyopneumoniae. / Mycoplasma hyopneumoniae is one of the smallest bacteria found in nature, presenting a reduced genome with a high A+T content and no cell wall. This bacterium is the etiological agent of swine enzootic pneumonia, a chronic disease that affects herds throughout the world and is responsible for great economic losses. To investigate the pathogenesis of M. hyopneumoniae it is important to understand their genetic mechanisms, however, despite the genome sequencing of several strains (7448, J, 232 and 168), little is known about the mechanisms that regulate and control the gene expression in this bacterium, especially about regulatory proteins. Transcription factors are proteins that bind to DNA providing the ability to control gene expression under different metabolic stimuli or growth conditions. The knowledge about these proteins in M. hyopneumoniae is scarce; therefore, the aim of this study is the analysis of potential transcription factors of M. hyopneumoniae. We selected proteins traditionally reported in databases as transcriptional factors (HrcA – MHP7448_0010; transcriptional regulator – MHP7448_0279; and the hypothetical protein MHP7448_0551), and a hypothetical protein which has structural similarities with sigma factors (MHP7448_0639). These proteins were cloned by in vivo homologous recombination in the expression vector pGEX 4T1 and were transformed into Escherichia coli to express the recombinant proteins. Nevertheless, for the application of this system it was necessary to perform site-directed mutagenesis to replace the codon UGA (tryptophan in mycoplasma) to UGG (tryptophan in the universal genetic code) in the proteins that presented this codon. The mutations were introduced by overlap extension PCR technique, using mutagenic primers. Clones were obtained for three proteins (MHP7448_0551, MHP7448_0639 and MHP7448_0010), which were efficiently expressed in E. coli. After solubilization with 0.5% sarkosyl, these proteins were subjected to purification by affinity chromatography. Purification was successful for two of the three tested proteins, and further tests will be carried out with the protein not purifyed (MHP7448_0010). After purification, the potential transcription factors will be used to identify the regions of DNA that these proteins regulate and which are involved in the control of gene expression in M. hyopneumoniae.

Mycoplasma hyopneumoniae é uma das menores bactérias encontradas na natureza, apresentando genoma altamente reduzido e ausência de parede celular. Este organismo é o agente causador da pneumonia enzoótica suína, a qual apresenta distribuição mundial, causando importantes perdas econômicas. Na última década, várias espécies de Mycoplasma tiveram seus genomas completamente seqüenciados, incluindo quatro cepas de M. hyopneumoniae. Apesar da grande quantidade de dados gerados, pouco se sabe sobre as seqüências nucleotídicas que controlam a expressão gênica nestes microrganismos. A grande variabilidade encontrada nas regiões promotoras, o baixo conteúdo de GC presente no genoma e a carência de promotores experimentalmente caracterizados, são fatores que dificultam o reconhecimento in silico das seqüências reguladoras no gênero Mycoplasma. Assim sendo, este trabalho tem como objetivo identificar seqüências nucleotídicas envolvidas com o início da transcrição em M. hyopneumoniae, gerando dados que possibilitem a construção de uma matriz capaz de fazer a predição de promotores nesta espécie. Inicialmente, os sítios de início de transcrição (TSSs) de 23 genes de M. hyopneumoniae foram definidos. Os resultados mostraram que os TSSs identificados localizavam-se entre 2 e 144 pb de distância do início dos genes, sendo compostos em sua grande maioria por um resíduo de adenosina. Um padrão semelhante ao elemento −10 de promotores σ70 foi encontrado a montante dos TSSs. No entanto, não foi possível identificar conservação de uma provável região −35, porém, um sinal periódico AT-rico foi observado. Aproximadamente metade dos genes analisados continha o motivo 5'-TRTG-3', que é idêntico ao elemento −16, comumente encontrado em bactérias gram-positivas. A partir da determinação dos promotores, foi construída uma matriz de pontuação posição-específica que foi utilizada para localizar promotores putativos a montante de todas as seqüências codificantes (CDSs) de M. hyopneumoniae. Duzentos e um sinais foram encontrados associados a 169 CDSs. A maioria destas seqüências estava localizada até 100 nucleotídeos de distância dos códons de iniciação. Este estudo mostra que o número de seqüências promotoras preditas no genoma de M. hyopneumoniae é mais freqüente que o esperado ao acaso, indicando que a maioria das seqüências detectadas são provavelmente sítios de ligação funcionais. / Mycoplasma hyopneumoniae is one of the smallest bacteria found in nature, presenting a small genome and absence of cell wall. It is present in the majority of swine herds throughout the world, and is considered an important pathogen in the swine industry. In the last decade, many species of this genus had their genome completely sequenced, including four strains of M. hyopneumoniae. Nevertheless, very little is understood of the nucleotide sequences that control transcription initiation in these microorganisms. Like its relatives, M. hyopneumoniae lacks several major regulators of gene expression, including two component regulatory systems and multiple σ factors, thus it appears that the signals for promotion and regulation of transcription may differ significantly from other bacteria. In addition, the low GC content and the dearth of experimentally characterized promoters in this genus severely limit the recognition of the controlling sequences. Therefore, this study aims to identify nucleotide sequences involved in transcription initiation in M. hyopneumoniae, and thus generate data to enable the construction of a matrix capable of predicting promoters in this species. Initially, the transcription start sites (TSSs) of 23 genes of M. hyopneumoniae were experimentally defined. The results showed that the identified TSSs were located between 2 and 144 bp away from the gene starts, being composed mostly of an adenosine residue. A pattern that resembles the σ70 promoter −10 element was found upstream of the TSSs. However, no −35 element was distinguished. Instead, an AT-rich periodic signal was identified. About half of the experimentally defined promoters contained the motif 5'-TRTG-3', which was identical to the −16 element usually found in gram-positive bacteria. The defined promoters were utilized to build position-specific scoring matrices in order to scan putative promoters upstream of all coding sequences (CDSs) in the M. hyopneumoniae genome. Two hundred and one signals were found associated with 169 CDSs. Most of these sequences were located within 100 nucleotides of the start codons. This study has shown that the number of promoter-like sequences in the M. hyopneumoniae genome is more frequent than expected by chance, indicating that most of the sequences detected are probably biologically functional.

Mycoplasma hyopneumoniae é uma das menores bactérias presentes na natureza, apresentando um genoma reduzido com alto conteúdo de A+T e ausência de parede celular. Este organismo é o agente etiológico da pneumonia enzoótica suína, uma doença crônica que afeta rebanhos em todo mundo sendo responsável por grandes perdas econômicas. Para investigar a patogênese de M. hyopneumoniae é importante entender seus mecanismos genéticos, porém, apesar do sequenciamento do genoma de várias linhagens (7448, J, 232 e 168), pouco se sabe sobre os mecanismos que regulam e controlam a expressão gênica neste microrganismo, principalmente no que se relaciona às proteínas regulatórias. Os fatores de transcrição são proteínas que se ligam ao DNA e propiciam a capacidade de controlar a expressão gênica sob diferentes estímulos metabólicos ou condições de crescimento. O conhecimento que se tem sobre essas proteínas em M. hyopneumoniae é escasso, então, desta forma, este trabalho tem como objetivo a análise de potencias fatores de transcrição de M. hyopneumoniae. Para isso foram selecionadas proteínas tradicionalmente descritas em bancos de dados como fatores de transcrição (HrcA – MHP7448_0010; transcriptional regulator – MHP7448_0279; e a proteína hipotética MHP7448_0551), além de uma proteína hipotética que apresenta similaridades estruturais com fatores sigma (MHP7448_0639). Estas proteínas foram clonadas por recombinação homóloga in vivo no vetor de expressão pGEX 4T1 e transformadas em Escherichia coli para expressão das proteínas recombinantes. Porém, para empregar essa técnica foi necessário realizar a mutagênese sítio-dirigida para a substituição do códon UGA (triptofano em micoplasmas) para UGG (triptofano no código genético universal) nas proteínas que apresentavam este códon. As mutações foram inseridas através da técnica de overlap extension PCR, utilizando primers mutagênicos. Foram obtidos clones para três proteínas (MHP7448_0551, MHP7448_0639 e MHP7448_0010), que foram eficientemente expressas em E. coli. Depois de solubilizadas com 0,5% de sarcosil, essas proteínas foram submetidas a um processo de purificação por cromatografia de afinidade. A purificação foi bem sucedida para duas das três proteínas testadas, e novos testes serão realizados com a proteína ainda não purificada (MHP7448_0010). Uma vez purificados, os potenciais fatores de transcrição serão utilizados na identificação das regiões do DNA que essas proteínas regulam e que estão envolvidas no controle da expressão gênica em M. hyopneumoniae. / Mycoplasma hyopneumoniae is one of the smallest bacteria found in nature, presenting a reduced genome with a high A+T content and no cell wall. This bacterium is the etiological agent of swine enzootic pneumonia, a chronic disease that affects herds throughout the world and is responsible for great economic losses. To investigate the pathogenesis of M. hyopneumoniae it is important to understand their genetic mechanisms, however, despite the genome sequencing of several strains (7448, J, 232 and 168), little is known about the mechanisms that regulate and control the gene expression in this bacterium, especially about regulatory proteins. Transcription factors are proteins that bind to DNA providing the ability to control gene expression under different metabolic stimuli or growth conditions. The knowledge about these proteins in M. hyopneumoniae is scarce; therefore, the aim of this study is the analysis of potential transcription factors of M. hyopneumoniae. We selected proteins traditionally reported in databases as transcriptional factors (HrcA – MHP7448_0010; transcriptional regulator – MHP7448_0279; and the hypothetical protein MHP7448_0551), and a hypothetical protein which has structural similarities with sigma factors (MHP7448_0639). These proteins were cloned by in vivo homologous recombination in the expression vector pGEX 4T1 and were transformed into Escherichia coli to express the recombinant proteins. Nevertheless, for the application of this system it was necessary to perform site-directed mutagenesis to replace the codon UGA (tryptophan in mycoplasma) to UGG (tryptophan in the universal genetic code) in the proteins that presented this codon. The mutations were introduced by overlap extension PCR technique, using mutagenic primers. Clones were obtained for three proteins (MHP7448_0551, MHP7448_0639 and MHP7448_0010), which were efficiently expressed in E. coli. After solubilization with 0.5% sarkosyl, these proteins were subjected to purification by affinity chromatography. Purification was successful for two of the three tested proteins, and further tests will be carried out with the protein not purifyed (MHP7448_0010). After purification, the potential transcription factors will be used to identify the regions of DNA that these proteins regulate and which are involved in the control of gene expression in M. hyopneumoniae.

Thesis (MSc (Med)(Microbiology))--University of Limpopo (Medunsa Campus), 2010. / Mycoplasma genitalium, a human mycoplasma species has been established as a cause of nongonococcal urethritis (NGU) in men, particularly in Chlamydia trachomatis-negative patients. It was also shown to play a role in cervicitis and pelvic inflammatory disease (PID) in women. Due to difficulty in culturing, and the lack of routine molecular diagnostic tests, many M. genitalium infections are undetected. The purpose of this study was to evaluate three nucleic acid amplification tests (NAATs) i.e. a recently developed Gen-Probe research only transcription mediated amplification (TMA) assay, a conventional polymerase chain reaction (PCR) assay and a real-time PCR (q-PCR) assay for the detection of M. genitalium in urine specimens of men with symptoms of urethritis. To evaluate the three assays, 300 urine specimens were collected between June 2007 and July 2008 from sexually active male patients presenting with discharge (N=94) and/or burning on micturition (N=206) to a private medical practitioner in Silverton, Pretoria. A specimen was considered positive by extension of the gold standard i.e. if any two of the three assays were positive. This was used to calculate the sensitivity and specificity of each method. TMA detected M. genitalium in 62 (21%), PCR in 43 (14%) and q-PCR in 48 (16%) of the 300 patients. The sensitivities of the assays were 100% (TMA), 92% (q-PCR) and 78% (PCR), with specificities of 90% (TMA), 95% (q-PCR) and 97% (PCR). The sensitivity of the TMA assay was higher than that of the q-PCR and PCR assays. The lower sensitivity obtained by the q-PCR assay might have been due to inhibition and limitations in the amount of the DNA template. However, the q-PCR assay was easy to perform as it combines amplification and detection thus eliminating further handling of PCR products. The PCR, although with a higher specificity, was the least desirable in terms of testing time and problems with subjectivity when reading agarose gels. v We concluded that the Gen-Probe TMA assay is a highly sensitive method for detection of M. genitalium in urine specimens of men. The use of Gen-Probe TMA and the q-PCR assay, will increase the detection of M. genitalium in clinical specimens at this catchment area.

Thesis (Ph. D.)--University of Missouri--Columbia, 1996. / Typescript. Vita. Includes bibliographical references (leaves : 128-138). Also available on the Internet.

A bactéria Mycoplasma hyopneumoniae é o agente etiológico da pneumonia enzoótica suína e se adere às células do epitélio ciliar pulmonar do hospedeiro para a colonização. Essa doença é responsável por perdas econômicas em muitos países devido à morbidade dos rebanhos. A bactéria Mycoplasma flocculare é encontrada principalmente na mucosa traqueal de suínos, como M. hyopneumoniae, mas é uma bactéria comensal. Ambas apresentam similaridades genéticas, como o compartilhamento de 90% das proteínas de superfície preditas e o perfil transcritômico dos genes que codificam adesinas, proteínas que proporcionam a aderência do micro-organismo, altamente semelhante. Contudo, análises genômicas e transcritômicas não foram capazes de explicar a diferença fenotípica entre M. hyopneumoniae e M. flocculare no hospedeiro. Considerando estudos realizados previamente, se hipotetiza que parte dessa diferença ocorra devido a discrepâncias na sequência de aminoácidos de proteínas de superfície ortólogas, uma vez que 85% dos pares de proteínas ortólogas destas espécies apresentam, pelo menos, um domínio diferencial. Tais domínios diferenciais podem determinar variação funcional e/ou variação na resposta imune induzida no suíno. Para caracterizar imunologicamente um par de proteínas ortólogas de superfície de M. hyopneumoniae e M. flocculare, MHP556 e MF306, respectivamente, as versões recombinantes dessas foram expressas em Escherichia coli BL21 pLysE. Os produtos recombinantes, MHP556-GST e MF306-GST, foram purificados e utilizados em ensaios de avaliação de imunogenicidade e antigenicidade. Foram demonstradas a antigenicidade das proteínas nativas MHP556 e MF306, além da imunogenicidade da proteína recombinante MF306-GST. A comparação desses resultados contribuirá para a elucidação da função dessas proteínas de superfície na interação patógeno-hospedeiro e da importância da presença de domínios diferenciais entre proteínas ortólogas na resposta imune desencadeada pelo hospedeiro. / The bacteria Mycoplasma hyopneumoniae is the etiological agent of swine enzootic pneumonia and attaches to the cilliary tracheal cells to colonize the host. This disease is responsible for economic losses in many countries due to the morbidity of pig herds. The bacteria Mycoplasma flocculare is also found mainly in the tracheal mucosal, as M. hyopneumoniae, but it is a commensal species. Both species have genetic similarities as they share 90% of their predicted surface proteins and the transcriptomic profiles of the genes encoding adhesins, proteins that enable the attachment in host tissue, very similar. Yet, genomic and transcriptional analysis does not explain the phenotypic difference between M. hyopneumoniae and M. flocculare within its host. Considering these previous studies, it was hypothesized that the difference in pathogenicity may be due, in part, tothe amino acid sequence of the orthologous surface proteins, once that 85% of all orthologous surface proteins of both species show, at least, one differential domain. These differential domains may trigger functional modifications and/or immunological modifications by the host. To immunologically characterize a pair of orthologous surface proteins MHP556 and MF306, from M. hyopneumoniae and M. flocculare, respectively, recombinant versions were expressed in Escherichia coli BL21 pLysE. The recombinant products, MHP556-GST and MF306-GST, were purified and used in immunological and antigenicity assay. The antigenicity of the native proteins MHP556 and MF306 were established, and the immunogenicity of the recombinant protein MF306-GST as well. The comparison of the results of this study may help to elucidate the different functions of both surface proteins in the host-pathogen interaction and shed light about the importance of the presence of differential domains in orthologous proteins in the host immune response.

Thesis (Ph. D.)--University of Missouri--Columbia, 2003. / Typescript. Vita. Includes bibliographical references (leaves 156-175).

Thesis (Ph. D.)--University of Missouri--Columbia, 2000. / "December 2000." Typescript. Vita. Includes bibliographical references (leaves 120-131). Also available on the Internet.

No description available.

Thesis (DR. P.H.)--University of Michigan.