Thesis (DR. P.H.)--University of Michigan.

Thesis (M.V.Sc.)--University of Melbourne, Dept. of Veterinary Science, 2009. / Typescript. Includes bibliographical references.

Mycoplasma hyopneumoniae e Mycoplasma flocculare são duas espécies geneticamente muito similares. M. hyopneumoniae é o agente etiológico da pneumonia enzoótica suína, enquanto M. flocculare é amplamente distribuído em rebanhos suínos, mas nenhuma doença decorrente da sua presença é observada. O repertório de proteínas ortólogas compartilhadas entre estas duas espécies é de 70% e de proteínas de superfície chega em torno de 90%. Diferenças estruturais e funcionais entre as proteínas ortólogas poderiam explicar, pelo menos em parte, o caráter de patogenicidade ou não destas espécies. A fim de identificar domínios diferenciais, foi realizada uma análise comparativa in silico das proteínas de superfície ortólogas de M. hyopneumoniae e M. flocculare. Foram analisados 184 pares de proteínas ortólogas e foram identificados domínios diferenciais em 85% deles. As sequências codificadoras das regiões diferenciais do par de proteínas hipotéticas ortólogas MHP7448_0612, de M. hyopneumoniae, e MF_00357, de M. flocculare, foram clonadas em vetor de expressão pGEX-4T-3 e expressas em Escherichia coli para a produção dos polipeptídeos recombinantes correspondentes (rMHP61267-169 e rMF35767-197, respectivamente). A resposta imune humoral e celular de camundongos foi analisada para avaliação das possíveis propriedades imunológicas diferenciais de domínios correspondentes de M. hyopneumoniae e de M. flocculare. Ambos os polipeptídeos recombinantes induziram altos níveis de IgG a partir do dia 30 pós-imunização em relação ao grupo controle, mas não houve diferença significativa entre os níveis de IgG entre os animais imunizados com os polipeptídeos recombinantes. Na avaliação da resposta celular, rMHP61267-169 induziu níveis significativamente maiores de IFN-γ e IL-10 em esplenócitos de camundongos não imunizados em relação aos níveis induzidos por rMF35767-197 ou aos observados no controle sem estímulo. Os domínios diferenciais induziram respostas imunes celulares diferenciais em camundongos. Esses resultados apontam um possível envolvimento de domínios diferenciais na resposta imune do hospedeiro contra M. hyopneumoniae e no desenvolvimento da doença. / M. hyopneumoniae and M. flocculare are two genetically similar bacterial species. M. hyopneumoniae is the etiological agent of porcine enzootic pneumonia, while M. flocculare is also widespread in swine herds, although no disease has been associated with its presence. The repertoire of orthologous proteins between M. hyopneumoniae and M. flocculare are 70% of total CDS and 90% of surface proteins. Functional and structural differences between orthologous surface proteins could explain the pathogenicity or non-pathogenicity of these species. To identify differential domains between pairs of orthologous, a comparative in silico analysis of orthologous surface proteins between these two species was performed. A total of 184 ortholog pairs were analyzed and differential domains were found in 85% of them. The coding sequences of differential domains from the pair of ortholog hypothetical proteins MHP7448_0612, from M. hyopneumoniae, and MF_00357, from M. flocculare, were cloned into pGEX-4T-3 and expressed in E. coli for the production of the correspondent recombinant polypeptides (rMHP61267-169 and rMF35767-197, respectively). The humoral and cellular immune response from mice were assessed to evaluate the possible differential immunological properties of corresponding domains from M. hyopneumoniae and M. flocculare. Both recombinant polypeptides induced high levels of IgG starting at 30 post-imunization in comparison to the control group, but no significant difference was observed between IgG levels from mice immunized with the recombinant polypeptides. Regarding cellular immune responses, rMHP61267-169 induced high levels of IFN-γ e IL-10 in splenocytes from non-immunized mice, in comparison to the levels observed in animals immunized with rMF35767-197 or in the non-stimulated control group. Differential domains induced differential cellular immune response in mice. This results suggest a possible involvement of differential domains in host immune response against M. hyopneumoniae and in disease development.

A bactéria Mycoplasma hyopneumoniae é o agente etiológico da pneumonia enzoótica suína e se adere às células do epitélio ciliar pulmonar do hospedeiro para a colonização. Essa doença é responsável por perdas econômicas em muitos países devido à morbidade dos rebanhos. A bactéria Mycoplasma flocculare é encontrada principalmente na mucosa traqueal de suínos, como M. hyopneumoniae, mas é uma bactéria comensal. Ambas apresentam similaridades genéticas, como o compartilhamento de 90% das proteínas de superfície preditas e o perfil transcritômico dos genes que codificam adesinas, proteínas que proporcionam a aderência do micro-organismo, altamente semelhante. Contudo, análises genômicas e transcritômicas não foram capazes de explicar a diferença fenotípica entre M. hyopneumoniae e M. flocculare no hospedeiro. Considerando estudos realizados previamente, se hipotetiza que parte dessa diferença ocorra devido a discrepâncias na sequência de aminoácidos de proteínas de superfície ortólogas, uma vez que 85% dos pares de proteínas ortólogas destas espécies apresentam, pelo menos, um domínio diferencial. Tais domínios diferenciais podem determinar variação funcional e/ou variação na resposta imune induzida no suíno. Para caracterizar imunologicamente um par de proteínas ortólogas de superfície de M. hyopneumoniae e M. flocculare, MHP556 e MF306, respectivamente, as versões recombinantes dessas foram expressas em Escherichia coli BL21 pLysE. Os produtos recombinantes, MHP556-GST e MF306-GST, foram purificados e utilizados em ensaios de avaliação de imunogenicidade e antigenicidade. Foram demonstradas a antigenicidade das proteínas nativas MHP556 e MF306, além da imunogenicidade da proteína recombinante MF306-GST. A comparação desses resultados contribuirá para a elucidação da função dessas proteínas de superfície na interação patógeno-hospedeiro e da importância da presença de domínios diferenciais entre proteínas ortólogas na resposta imune desencadeada pelo hospedeiro. / The bacteria Mycoplasma hyopneumoniae is the etiological agent of swine enzootic pneumonia and attaches to the cilliary tracheal cells to colonize the host. This disease is responsible for economic losses in many countries due to the morbidity of pig herds. The bacteria Mycoplasma flocculare is also found mainly in the tracheal mucosal, as M. hyopneumoniae, but it is a commensal species. Both species have genetic similarities as they share 90% of their predicted surface proteins and the transcriptomic profiles of the genes encoding adhesins, proteins that enable the attachment in host tissue, very similar. Yet, genomic and transcriptional analysis does not explain the phenotypic difference between M. hyopneumoniae and M. flocculare within its host. Considering these previous studies, it was hypothesized that the difference in pathogenicity may be due, in part, tothe amino acid sequence of the orthologous surface proteins, once that 85% of all orthologous surface proteins of both species show, at least, one differential domain. These differential domains may trigger functional modifications and/or immunological modifications by the host. To immunologically characterize a pair of orthologous surface proteins MHP556 and MF306, from M. hyopneumoniae and M. flocculare, respectively, recombinant versions were expressed in Escherichia coli BL21 pLysE. The recombinant products, MHP556-GST and MF306-GST, were purified and used in immunological and antigenicity assay. The antigenicity of the native proteins MHP556 and MF306 were established, and the immunogenicity of the recombinant protein MF306-GST as well. The comparison of the results of this study may help to elucidate the different functions of both surface proteins in the host-pathogen interaction and shed light about the importance of the presence of differential domains in orthologous proteins in the host immune response.

A bactéria Mycoplasma hyopneumoniae é o agente etiológico da pneumonia enzoótica suína e se adere às células do epitélio ciliar pulmonar do hospedeiro para a colonização. Essa doença é responsável por perdas econômicas em muitos países devido à morbidade dos rebanhos. A bactéria Mycoplasma flocculare é encontrada principalmente na mucosa traqueal de suínos, como M. hyopneumoniae, mas é uma bactéria comensal. Ambas apresentam similaridades genéticas, como o compartilhamento de 90% das proteínas de superfície preditas e o perfil transcritômico dos genes que codificam adesinas, proteínas que proporcionam a aderência do micro-organismo, altamente semelhante. Contudo, análises genômicas e transcritômicas não foram capazes de explicar a diferença fenotípica entre M. hyopneumoniae e M. flocculare no hospedeiro. Considerando estudos realizados previamente, se hipotetiza que parte dessa diferença ocorra devido a discrepâncias na sequência de aminoácidos de proteínas de superfície ortólogas, uma vez que 85% dos pares de proteínas ortólogas destas espécies apresentam, pelo menos, um domínio diferencial. Tais domínios diferenciais podem determinar variação funcional e/ou variação na resposta imune induzida no suíno. Para caracterizar imunologicamente um par de proteínas ortólogas de superfície de M. hyopneumoniae e M. flocculare, MHP556 e MF306, respectivamente, as versões recombinantes dessas foram expressas em Escherichia coli BL21 pLysE. Os produtos recombinantes, MHP556-GST e MF306-GST, foram purificados e utilizados em ensaios de avaliação de imunogenicidade e antigenicidade. Foram demonstradas a antigenicidade das proteínas nativas MHP556 e MF306, além da imunogenicidade da proteína recombinante MF306-GST. A comparação desses resultados contribuirá para a elucidação da função dessas proteínas de superfície na interação patógeno-hospedeiro e da importância da presença de domínios diferenciais entre proteínas ortólogas na resposta imune desencadeada pelo hospedeiro. / The bacteria Mycoplasma hyopneumoniae is the etiological agent of swine enzootic pneumonia and attaches to the cilliary tracheal cells to colonize the host. This disease is responsible for economic losses in many countries due to the morbidity of pig herds. The bacteria Mycoplasma flocculare is also found mainly in the tracheal mucosal, as M. hyopneumoniae, but it is a commensal species. Both species have genetic similarities as they share 90% of their predicted surface proteins and the transcriptomic profiles of the genes encoding adhesins, proteins that enable the attachment in host tissue, very similar. Yet, genomic and transcriptional analysis does not explain the phenotypic difference between M. hyopneumoniae and M. flocculare within its host. Considering these previous studies, it was hypothesized that the difference in pathogenicity may be due, in part, tothe amino acid sequence of the orthologous surface proteins, once that 85% of all orthologous surface proteins of both species show, at least, one differential domain. These differential domains may trigger functional modifications and/or immunological modifications by the host. To immunologically characterize a pair of orthologous surface proteins MHP556 and MF306, from M. hyopneumoniae and M. flocculare, respectively, recombinant versions were expressed in Escherichia coli BL21 pLysE. The recombinant products, MHP556-GST and MF306-GST, were purified and used in immunological and antigenicity assay. The antigenicity of the native proteins MHP556 and MF306 were established, and the immunogenicity of the recombinant protein MF306-GST as well. The comparison of the results of this study may help to elucidate the different functions of both surface proteins in the host-pathogen interaction and shed light about the importance of the presence of differential domains in orthologous proteins in the host immune response.

Mycoplasma hyopneumoniae e Mycoplasma flocculare são duas espécies geneticamente muito similares. M. hyopneumoniae é o agente etiológico da pneumonia enzoótica suína, enquanto M. flocculare é amplamente distribuído em rebanhos suínos, mas nenhuma doença decorrente da sua presença é observada. O repertório de proteínas ortólogas compartilhadas entre estas duas espécies é de 70% e de proteínas de superfície chega em torno de 90%. Diferenças estruturais e funcionais entre as proteínas ortólogas poderiam explicar, pelo menos em parte, o caráter de patogenicidade ou não destas espécies. A fim de identificar domínios diferenciais, foi realizada uma análise comparativa in silico das proteínas de superfície ortólogas de M. hyopneumoniae e M. flocculare. Foram analisados 184 pares de proteínas ortólogas e foram identificados domínios diferenciais em 85% deles. As sequências codificadoras das regiões diferenciais do par de proteínas hipotéticas ortólogas MHP7448_0612, de M. hyopneumoniae, e MF_00357, de M. flocculare, foram clonadas em vetor de expressão pGEX-4T-3 e expressas em Escherichia coli para a produção dos polipeptídeos recombinantes correspondentes (rMHP61267-169 e rMF35767-197, respectivamente). A resposta imune humoral e celular de camundongos foi analisada para avaliação das possíveis propriedades imunológicas diferenciais de domínios correspondentes de M. hyopneumoniae e de M. flocculare. Ambos os polipeptídeos recombinantes induziram altos níveis de IgG a partir do dia 30 pós-imunização em relação ao grupo controle, mas não houve diferença significativa entre os níveis de IgG entre os animais imunizados com os polipeptídeos recombinantes. Na avaliação da resposta celular, rMHP61267-169 induziu níveis significativamente maiores de IFN-γ e IL-10 em esplenócitos de camundongos não imunizados em relação aos níveis induzidos por rMF35767-197 ou aos observados no controle sem estímulo. Os domínios diferenciais induziram respostas imunes celulares diferenciais em camundongos. Esses resultados apontam um possível envolvimento de domínios diferenciais na resposta imune do hospedeiro contra M. hyopneumoniae e no desenvolvimento da doença. / M. hyopneumoniae and M. flocculare are two genetically similar bacterial species. M. hyopneumoniae is the etiological agent of porcine enzootic pneumonia, while M. flocculare is also widespread in swine herds, although no disease has been associated with its presence. The repertoire of orthologous proteins between M. hyopneumoniae and M. flocculare are 70% of total CDS and 90% of surface proteins. Functional and structural differences between orthologous surface proteins could explain the pathogenicity or non-pathogenicity of these species. To identify differential domains between pairs of orthologous, a comparative in silico analysis of orthologous surface proteins between these two species was performed. A total of 184 ortholog pairs were analyzed and differential domains were found in 85% of them. The coding sequences of differential domains from the pair of ortholog hypothetical proteins MHP7448_0612, from M. hyopneumoniae, and MF_00357, from M. flocculare, were cloned into pGEX-4T-3 and expressed in E. coli for the production of the correspondent recombinant polypeptides (rMHP61267-169 and rMF35767-197, respectively). The humoral and cellular immune response from mice were assessed to evaluate the possible differential immunological properties of corresponding domains from M. hyopneumoniae and M. flocculare. Both recombinant polypeptides induced high levels of IgG starting at 30 post-imunization in comparison to the control group, but no significant difference was observed between IgG levels from mice immunized with the recombinant polypeptides. Regarding cellular immune responses, rMHP61267-169 induced high levels of IFN-γ e IL-10 in splenocytes from non-immunized mice, in comparison to the levels observed in animals immunized with rMF35767-197 or in the non-stimulated control group. Differential domains induced differential cellular immune response in mice. This results suggest a possible involvement of differential domains in host immune response against M. hyopneumoniae and in disease development.

Mycoplasma hyopneumoniae e Mycoplasma flocculare são duas espécies geneticamente muito similares. M. hyopneumoniae é o agente etiológico da pneumonia enzoótica suína, enquanto M. flocculare é amplamente distribuído em rebanhos suínos, mas nenhuma doença decorrente da sua presença é observada. O repertório de proteínas ortólogas compartilhadas entre estas duas espécies é de 70% e de proteínas de superfície chega em torno de 90%. Diferenças estruturais e funcionais entre as proteínas ortólogas poderiam explicar, pelo menos em parte, o caráter de patogenicidade ou não destas espécies. A fim de identificar domínios diferenciais, foi realizada uma análise comparativa in silico das proteínas de superfície ortólogas de M. hyopneumoniae e M. flocculare. Foram analisados 184 pares de proteínas ortólogas e foram identificados domínios diferenciais em 85% deles. As sequências codificadoras das regiões diferenciais do par de proteínas hipotéticas ortólogas MHP7448_0612, de M. hyopneumoniae, e MF_00357, de M. flocculare, foram clonadas em vetor de expressão pGEX-4T-3 e expressas em Escherichia coli para a produção dos polipeptídeos recombinantes correspondentes (rMHP61267-169 e rMF35767-197, respectivamente). A resposta imune humoral e celular de camundongos foi analisada para avaliação das possíveis propriedades imunológicas diferenciais de domínios correspondentes de M. hyopneumoniae e de M. flocculare. Ambos os polipeptídeos recombinantes induziram altos níveis de IgG a partir do dia 30 pós-imunização em relação ao grupo controle, mas não houve diferença significativa entre os níveis de IgG entre os animais imunizados com os polipeptídeos recombinantes. Na avaliação da resposta celular, rMHP61267-169 induziu níveis significativamente maiores de IFN-γ e IL-10 em esplenócitos de camundongos não imunizados em relação aos níveis induzidos por rMF35767-197 ou aos observados no controle sem estímulo. Os domínios diferenciais induziram respostas imunes celulares diferenciais em camundongos. Esses resultados apontam um possível envolvimento de domínios diferenciais na resposta imune do hospedeiro contra M. hyopneumoniae e no desenvolvimento da doença. / M. hyopneumoniae and M. flocculare are two genetically similar bacterial species. M. hyopneumoniae is the etiological agent of porcine enzootic pneumonia, while M. flocculare is also widespread in swine herds, although no disease has been associated with its presence. The repertoire of orthologous proteins between M. hyopneumoniae and M. flocculare are 70% of total CDS and 90% of surface proteins. Functional and structural differences between orthologous surface proteins could explain the pathogenicity or non-pathogenicity of these species. To identify differential domains between pairs of orthologous, a comparative in silico analysis of orthologous surface proteins between these two species was performed. A total of 184 ortholog pairs were analyzed and differential domains were found in 85% of them. The coding sequences of differential domains from the pair of ortholog hypothetical proteins MHP7448_0612, from M. hyopneumoniae, and MF_00357, from M. flocculare, were cloned into pGEX-4T-3 and expressed in E. coli for the production of the correspondent recombinant polypeptides (rMHP61267-169 and rMF35767-197, respectively). The humoral and cellular immune response from mice were assessed to evaluate the possible differential immunological properties of corresponding domains from M. hyopneumoniae and M. flocculare. Both recombinant polypeptides induced high levels of IgG starting at 30 post-imunization in comparison to the control group, but no significant difference was observed between IgG levels from mice immunized with the recombinant polypeptides. Regarding cellular immune responses, rMHP61267-169 induced high levels of IFN-γ e IL-10 in splenocytes from non-immunized mice, in comparison to the levels observed in animals immunized with rMF35767-197 or in the non-stimulated control group. Differential domains induced differential cellular immune response in mice. This results suggest a possible involvement of differential domains in host immune response against M. hyopneumoniae and in disease development.

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