A bactéria Mycoplasma hyopneumoniae é o agente etiológico da pneumonia enzoótica suína e se adere às células do epitélio ciliar pulmonar do hospedeiro para a colonização. Essa doença é responsável por perdas econômicas em muitos países devido à morbidade dos rebanhos. A bactéria Mycoplasma flocculare é encontrada principalmente na mucosa traqueal de suínos, como M. hyopneumoniae, mas é uma bactéria comensal. Ambas apresentam similaridades genéticas, como o compartilhamento de 90% das proteínas de superfície preditas e o perfil transcritômico dos genes que codificam adesinas, proteínas que proporcionam a aderência do micro-organismo, altamente semelhante. Contudo, análises genômicas e transcritômicas não foram capazes de explicar a diferença fenotípica entre M. hyopneumoniae e M. flocculare no hospedeiro. Considerando estudos realizados previamente, se hipotetiza que parte dessa diferença ocorra devido a discrepâncias na sequência de aminoácidos de proteínas de superfície ortólogas, uma vez que 85% dos pares de proteínas ortólogas destas espécies apresentam, pelo menos, um domínio diferencial. Tais domínios diferenciais podem determinar variação funcional e/ou variação na resposta imune induzida no suíno. Para caracterizar imunologicamente um par de proteínas ortólogas de superfície de M. hyopneumoniae e M. flocculare, MHP556 e MF306, respectivamente, as versões recombinantes dessas foram expressas em Escherichia coli BL21 pLysE. Os produtos recombinantes, MHP556-GST e MF306-GST, foram purificados e utilizados em ensaios de avaliação de imunogenicidade e antigenicidade. Foram demonstradas a antigenicidade das proteínas nativas MHP556 e MF306, além da imunogenicidade da proteína recombinante MF306-GST. A comparação desses resultados contribuirá para a elucidação da função dessas proteínas de superfície na interação patógeno-hospedeiro e da importância da presença de domínios diferenciais entre proteínas ortólogas na resposta imune desencadeada pelo hospedeiro. / The bacteria Mycoplasma hyopneumoniae is the etiological agent of swine enzootic pneumonia and attaches to the cilliary tracheal cells to colonize the host. This disease is responsible for economic losses in many countries due to the morbidity of pig herds. The bacteria Mycoplasma flocculare is also found mainly in the tracheal mucosal, as M. hyopneumoniae, but it is a commensal species. Both species have genetic similarities as they share 90% of their predicted surface proteins and the transcriptomic profiles of the genes encoding adhesins, proteins that enable the attachment in host tissue, very similar. Yet, genomic and transcriptional analysis does not explain the phenotypic difference between M. hyopneumoniae and M. flocculare within its host. Considering these previous studies, it was hypothesized that the difference in pathogenicity may be due, in part, tothe amino acid sequence of the orthologous surface proteins, once that 85% of all orthologous surface proteins of both species show, at least, one differential domain. These differential domains may trigger functional modifications and/or immunological modifications by the host. To immunologically characterize a pair of orthologous surface proteins MHP556 and MF306, from M. hyopneumoniae and M. flocculare, respectively, recombinant versions were expressed in Escherichia coli BL21 pLysE. The recombinant products, MHP556-GST and MF306-GST, were purified and used in immunological and antigenicity assay. The antigenicity of the native proteins MHP556 and MF306 were established, and the immunogenicity of the recombinant protein MF306-GST as well. The comparison of the results of this study may help to elucidate the different functions of both surface proteins in the host-pathogen interaction and shed light about the importance of the presence of differential domains in orthologous proteins in the host immune response.

A bactéria Mycoplasma hyopneumoniae é o agente etiológico da pneumonia enzoótica suína e se adere às células do epitélio ciliar pulmonar do hospedeiro para a colonização. Essa doença é responsável por perdas econômicas em muitos países devido à morbidade dos rebanhos. A bactéria Mycoplasma flocculare é encontrada principalmente na mucosa traqueal de suínos, como M. hyopneumoniae, mas é uma bactéria comensal. Ambas apresentam similaridades genéticas, como o compartilhamento de 90% das proteínas de superfície preditas e o perfil transcritômico dos genes que codificam adesinas, proteínas que proporcionam a aderência do micro-organismo, altamente semelhante. Contudo, análises genômicas e transcritômicas não foram capazes de explicar a diferença fenotípica entre M. hyopneumoniae e M. flocculare no hospedeiro. Considerando estudos realizados previamente, se hipotetiza que parte dessa diferença ocorra devido a discrepâncias na sequência de aminoácidos de proteínas de superfície ortólogas, uma vez que 85% dos pares de proteínas ortólogas destas espécies apresentam, pelo menos, um domínio diferencial. Tais domínios diferenciais podem determinar variação funcional e/ou variação na resposta imune induzida no suíno. Para caracterizar imunologicamente um par de proteínas ortólogas de superfície de M. hyopneumoniae e M. flocculare, MHP556 e MF306, respectivamente, as versões recombinantes dessas foram expressas em Escherichia coli BL21 pLysE. Os produtos recombinantes, MHP556-GST e MF306-GST, foram purificados e utilizados em ensaios de avaliação de imunogenicidade e antigenicidade. Foram demonstradas a antigenicidade das proteínas nativas MHP556 e MF306, além da imunogenicidade da proteína recombinante MF306-GST. A comparação desses resultados contribuirá para a elucidação da função dessas proteínas de superfície na interação patógeno-hospedeiro e da importância da presença de domínios diferenciais entre proteínas ortólogas na resposta imune desencadeada pelo hospedeiro. / The bacteria Mycoplasma hyopneumoniae is the etiological agent of swine enzootic pneumonia and attaches to the cilliary tracheal cells to colonize the host. This disease is responsible for economic losses in many countries due to the morbidity of pig herds. The bacteria Mycoplasma flocculare is also found mainly in the tracheal mucosal, as M. hyopneumoniae, but it is a commensal species. Both species have genetic similarities as they share 90% of their predicted surface proteins and the transcriptomic profiles of the genes encoding adhesins, proteins that enable the attachment in host tissue, very similar. Yet, genomic and transcriptional analysis does not explain the phenotypic difference between M. hyopneumoniae and M. flocculare within its host. Considering these previous studies, it was hypothesized that the difference in pathogenicity may be due, in part, tothe amino acid sequence of the orthologous surface proteins, once that 85% of all orthologous surface proteins of both species show, at least, one differential domain. These differential domains may trigger functional modifications and/or immunological modifications by the host. To immunologically characterize a pair of orthologous surface proteins MHP556 and MF306, from M. hyopneumoniae and M. flocculare, respectively, recombinant versions were expressed in Escherichia coli BL21 pLysE. The recombinant products, MHP556-GST and MF306-GST, were purified and used in immunological and antigenicity assay. The antigenicity of the native proteins MHP556 and MF306 were established, and the immunogenicity of the recombinant protein MF306-GST as well. The comparison of the results of this study may help to elucidate the different functions of both surface proteins in the host-pathogen interaction and shed light about the importance of the presence of differential domains in orthologous proteins in the host immune response.

A bactéria Mycoplasma hyopneumoniae é o agente etiológico da pneumonia enzoótica suína e se adere às células do epitélio ciliar pulmonar do hospedeiro para a colonização. Essa doença é responsável por perdas econômicas em muitos países devido à morbidade dos rebanhos. A bactéria Mycoplasma flocculare é encontrada principalmente na mucosa traqueal de suínos, como M. hyopneumoniae, mas é uma bactéria comensal. Ambas apresentam similaridades genéticas, como o compartilhamento de 90% das proteínas de superfície preditas e o perfil transcritômico dos genes que codificam adesinas, proteínas que proporcionam a aderência do micro-organismo, altamente semelhante. Contudo, análises genômicas e transcritômicas não foram capazes de explicar a diferença fenotípica entre M. hyopneumoniae e M. flocculare no hospedeiro. Considerando estudos realizados previamente, se hipotetiza que parte dessa diferença ocorra devido a discrepâncias na sequência de aminoácidos de proteínas de superfície ortólogas, uma vez que 85% dos pares de proteínas ortólogas destas espécies apresentam, pelo menos, um domínio diferencial. Tais domínios diferenciais podem determinar variação funcional e/ou variação na resposta imune induzida no suíno. Para caracterizar imunologicamente um par de proteínas ortólogas de superfície de M. hyopneumoniae e M. flocculare, MHP556 e MF306, respectivamente, as versões recombinantes dessas foram expressas em Escherichia coli BL21 pLysE. Os produtos recombinantes, MHP556-GST e MF306-GST, foram purificados e utilizados em ensaios de avaliação de imunogenicidade e antigenicidade. Foram demonstradas a antigenicidade das proteínas nativas MHP556 e MF306, além da imunogenicidade da proteína recombinante MF306-GST. A comparação desses resultados contribuirá para a elucidação da função dessas proteínas de superfície na interação patógeno-hospedeiro e da importância da presença de domínios diferenciais entre proteínas ortólogas na resposta imune desencadeada pelo hospedeiro. / The bacteria Mycoplasma hyopneumoniae is the etiological agent of swine enzootic pneumonia and attaches to the cilliary tracheal cells to colonize the host. This disease is responsible for economic losses in many countries due to the morbidity of pig herds. The bacteria Mycoplasma flocculare is also found mainly in the tracheal mucosal, as M. hyopneumoniae, but it is a commensal species. Both species have genetic similarities as they share 90% of their predicted surface proteins and the transcriptomic profiles of the genes encoding adhesins, proteins that enable the attachment in host tissue, very similar. Yet, genomic and transcriptional analysis does not explain the phenotypic difference between M. hyopneumoniae and M. flocculare within its host. Considering these previous studies, it was hypothesized that the difference in pathogenicity may be due, in part, tothe amino acid sequence of the orthologous surface proteins, once that 85% of all orthologous surface proteins of both species show, at least, one differential domain. These differential domains may trigger functional modifications and/or immunological modifications by the host. To immunologically characterize a pair of orthologous surface proteins MHP556 and MF306, from M. hyopneumoniae and M. flocculare, respectively, recombinant versions were expressed in Escherichia coli BL21 pLysE. The recombinant products, MHP556-GST and MF306-GST, were purified and used in immunological and antigenicity assay. The antigenicity of the native proteins MHP556 and MF306 were established, and the immunogenicity of the recombinant protein MF306-GST as well. The comparison of the results of this study may help to elucidate the different functions of both surface proteins in the host-pathogen interaction and shed light about the importance of the presence of differential domains in orthologous proteins in the host immune response.

Mycoplasma hyopneumoniae é o agente etiológico da pneumonia enzoótica, enfermidade distribuída mundialmente em rebanhos suínos nas fases de crescimento e terminação. A pneumonia enzoótica tem sido considerada uma das mais importantes causas de perdas econômicas na suinocultura mundial. Tendo em vista a disponibilidade dos genomas completos de três linhagens diferentes de M. pneumoniae, sendo duas patogênicas (linhagens 7448 e 232) e outra não patogênica (linhagem J) e a ausência de sistemas genéticos adequados para o estudo destes genomas, é necessidade emergente o desenvolvimento de ferramentas genéticas funcionais neste organismo. Atualmente, cinco espécies de micoplasmas possuem vetores replicativos disponíveis para transformação. No entanto nenhum deles possui a oriC de M. hyopneumoniae, e estudos sugerem que estes vetores são espécie-específicos e não seriam replicados em M. hyopneumoniae. Este trabalho teve como objetivos a construção de um vetor replicativo e o desenvolvimento de um sistema para transformação de M. hyopneumoniae. Os resultados alcançados constituem uma etapa prévia e imprescindível para o estudo de supostas regiões promotoras nesta espécie. O plasmídio replicativo pOSTM construído neste trabalho foi obtido a partir do vetor pUC18, adicionando-se a origem de replicação de M. hyopneumoniae e o cassete de expressão do gene de resistência à tetraciclina (tetM), controlado pelo promotor do gene da espiralina de Spiroplasma citri. A transformação foi realizada através de eletroporação e as células transformantes foram selecionadas pelo fenótipo de resistência à tetraciclina. Os transformantes resistentes à tetraciclina foram confirmados através da amplificação por PCR de porção do vetor inserido nas células. Tal comprovação permite concluir que o M. hyopneumoniae é um organismo susceptível à transformação e que o determinante tetM heterólogo é funcional neste patógeno. / Mycoplasma hyopneumoniae is the etiological agent of enzootic pneumonia of pigs.The disease has a worldwide distribution in growing and finishing pigs. The enzootic pneumonia has been considered one of the most important causes of economic losses in the worldwide swine breeding. The now available complete sequences of the genomes of two pathogenic (7448 and 232) and one non-pathogenic strain (J) of M. hyopneumoniae and the lack of suitable genetic systems to study these genomes points to the emergent need for the development of functional genetic tools for this organism. Currently, there are replicating vectors available for five species of mycoplasmas. However none of them posses oriC of M. hyopneumoniae, and studies suggest that these vectors are species-specific and they would not be functional in M. hyopneumoniae. The aim of the present study was to construct a replicating vector and the development of a system for transformation of M. hyopneumoniae. These constitute a previous and essential stage for the study of putative promoter regions in this species. To construct the replicating plasmid pOSTM the oriC of M. hyopneumoniae and the expression cassette containing the gene for tetracycline resistance (tetM), controlled by spiralin gene promoter of Spiroplasma citri, were introduced into the vector pUC18. The transformation was achieved by electroporation and transformants were selected for tetracycline resistance. Tetracycline resistance transformants were confirmed through PCR amplification of portion of the inserted vector. Such evidence allows the conclusion that M. hyopneumoniae is amenable to transformation and heterologous tetM determinant is functional in this pathogen.

A Pasteurella multocida é o agente causador da pasteurelose pulmonar dos suínos, sendo comum a ocorrência dessa infecção associada com o Mycoplasma hyopneumoniae no curso da pneumonia enzoótica. O agente é encontrado em pulmões de várias espécies animais e no homem. A infecção de suínos com o circovírus suíno tipo 2 (PCV2) causa uma forma de infecção sistêmica com profundos efeitos no sistema linfóide, causando prejuízos aos processos normais de defesa e facilitando a instalação de infecções secundárias, incluindo a pneumonia enzoótica complicada pela Pasteurella multocida. O objetivo deste trabalho foi isolar e caracterizar amostras de P. multocida obtidas de suínos com sinais clínicos compatíveis com os da circovirose e de animais de frigorífico quanto ao seu perfil bioquímico, capsular e sensibilidade a antimicrobianos. Foram utilizados 453 materiais (pulmões e suabes das lesões pulmonares), resultando em 115 isolados bacterianos de 79 pulmões. Paralelamente, procurou-se avaliar a eficiência do isolamento da bactéria a partir de dois sítios de amostragem no pulmão: do exsudato bronquial e da superfície de corte pulmonar. Numa amostragem dos casos, procurou-se estabelecer a relação entre a infecção com PCV2 e as lesões pulmonares induzidas pela P. multocida. Numa análise do grau de pneumonia foram classificadas 38 lesões como leves, 19 como médias e 15 graves. Na análise bacteriológica, todas as amostras foram positivas para o teste da catalase e oxidase e negativas para o citrato e H2S, e 11,3% foram negativas ao teste do indol. Utilizando-se os substratos sorbitol, manitol, trealose, maltose e arabinose foram observados seis perfis distintos. O tipo capsular A esteve presente em 93,91% das amostras e o tipo D em 6,09%. Nenhuma das amostras possuía o gene codificador da toxina dermonecrótica (toxA) e a resistência antimicrobiana foi baixa e a oxitetraciclina o princípio ativo com maior resistência 15,65%. / Pasteurella multocida is the etiologic agent of swine respiratory pasteurellosis and the infection occurs specially associated with Mycoplasma hyopneumoniae in the course of enzootic pneumonia. The agent can be isolated from the lung of several animal species and man. Infection of pigs with porcine circovirus (PCV2) causes a systemic infection with deep effects on the lymphoid system (porcine multisystemic wasting syndrome, PMWS), resulting in impairment of the normal defense processes and facilitating secondary infections, including enzootic pneumonia complicated with Pasteurella multocida. The objective of the present work was to isolate and characterize strains of P. multocida obtained from pigs with clinical signs compatible with PMWS and from slaughter pigs, considering biochemical profile, capsular typing and antibiotic sensitivity testing. A total of 453 materials (lungs and swabs from lung lesions) were used, resulting in 115 bacterial isolates from 79 lungs. At the same time, the efficiency of the isolation of the bacteria from two different sites in the lung was assessed: bronchial exudate and the cut surface of the lung. In a sample of the cases it was tried to establish the relationship between PCV2 infection and lung lesions induced by P. multocida. Analyzing degrees of pneumonia, 38 lesions were classified as mild, 19 as intermediate and 15 as severe. In the bacteriological analysis, all strains were positive for catalase and oxidase, and negative for citrate and H2S, and 11.3 were negative in the indole test. Using sugar fermentation (sorbitol, manitol, trealose, maltose and arabinose) six different profiles were established. Capsular type A was diagnosed in 93.91% of the samples and type D in 6.09%. All strains were negative for the gene codifying dermonecrotic toxin (toxA). Antimicrobial resistance was low, and tetracycline was the product showing higher resistance (15.65%).

Mycoplasma hyopneumoniae é o agente etiológico da pneumonia enzoótica, enfermidade distribuída mundialmente em rebanhos suínos nas fases de crescimento e terminação. A pneumonia enzoótica tem sido considerada uma das mais importantes causas de perdas econômicas na suinocultura mundial. Tendo em vista a disponibilidade dos genomas completos de três linhagens diferentes de M. pneumoniae, sendo duas patogênicas (linhagens 7448 e 232) e outra não patogênica (linhagem J) e a ausência de sistemas genéticos adequados para o estudo destes genomas, é necessidade emergente o desenvolvimento de ferramentas genéticas funcionais neste organismo. Atualmente, cinco espécies de micoplasmas possuem vetores replicativos disponíveis para transformação. No entanto nenhum deles possui a oriC de M. hyopneumoniae, e estudos sugerem que estes vetores são espécie-específicos e não seriam replicados em M. hyopneumoniae. Este trabalho teve como objetivos a construção de um vetor replicativo e o desenvolvimento de um sistema para transformação de M. hyopneumoniae. Os resultados alcançados constituem uma etapa prévia e imprescindível para o estudo de supostas regiões promotoras nesta espécie. O plasmídio replicativo pOSTM construído neste trabalho foi obtido a partir do vetor pUC18, adicionando-se a origem de replicação de M. hyopneumoniae e o cassete de expressão do gene de resistência à tetraciclina (tetM), controlado pelo promotor do gene da espiralina de Spiroplasma citri. A transformação foi realizada através de eletroporação e as células transformantes foram selecionadas pelo fenótipo de resistência à tetraciclina. Os transformantes resistentes à tetraciclina foram confirmados através da amplificação por PCR de porção do vetor inserido nas células. Tal comprovação permite concluir que o M. hyopneumoniae é um organismo susceptível à transformação e que o determinante tetM heterólogo é funcional neste patógeno. / Mycoplasma hyopneumoniae is the etiological agent of enzootic pneumonia of pigs.The disease has a worldwide distribution in growing and finishing pigs. The enzootic pneumonia has been considered one of the most important causes of economic losses in the worldwide swine breeding. The now available complete sequences of the genomes of two pathogenic (7448 and 232) and one non-pathogenic strain (J) of M. hyopneumoniae and the lack of suitable genetic systems to study these genomes points to the emergent need for the development of functional genetic tools for this organism. Currently, there are replicating vectors available for five species of mycoplasmas. However none of them posses oriC of M. hyopneumoniae, and studies suggest that these vectors are species-specific and they would not be functional in M. hyopneumoniae. The aim of the present study was to construct a replicating vector and the development of a system for transformation of M. hyopneumoniae. These constitute a previous and essential stage for the study of putative promoter regions in this species. To construct the replicating plasmid pOSTM the oriC of M. hyopneumoniae and the expression cassette containing the gene for tetracycline resistance (tetM), controlled by spiralin gene promoter of Spiroplasma citri, were introduced into the vector pUC18. The transformation was achieved by electroporation and transformants were selected for tetracycline resistance. Tetracycline resistance transformants were confirmed through PCR amplification of portion of the inserted vector. Such evidence allows the conclusion that M. hyopneumoniae is amenable to transformation and heterologous tetM determinant is functional in this pathogen.

A Pasteurella multocida é o agente causador da pasteurelose pulmonar dos suínos, sendo comum a ocorrência dessa infecção associada com o Mycoplasma hyopneumoniae no curso da pneumonia enzoótica. O agente é encontrado em pulmões de várias espécies animais e no homem. A infecção de suínos com o circovírus suíno tipo 2 (PCV2) causa uma forma de infecção sistêmica com profundos efeitos no sistema linfóide, causando prejuízos aos processos normais de defesa e facilitando a instalação de infecções secundárias, incluindo a pneumonia enzoótica complicada pela Pasteurella multocida. O objetivo deste trabalho foi isolar e caracterizar amostras de P. multocida obtidas de suínos com sinais clínicos compatíveis com os da circovirose e de animais de frigorífico quanto ao seu perfil bioquímico, capsular e sensibilidade a antimicrobianos. Foram utilizados 453 materiais (pulmões e suabes das lesões pulmonares), resultando em 115 isolados bacterianos de 79 pulmões. Paralelamente, procurou-se avaliar a eficiência do isolamento da bactéria a partir de dois sítios de amostragem no pulmão: do exsudato bronquial e da superfície de corte pulmonar. Numa amostragem dos casos, procurou-se estabelecer a relação entre a infecção com PCV2 e as lesões pulmonares induzidas pela P. multocida. Numa análise do grau de pneumonia foram classificadas 38 lesões como leves, 19 como médias e 15 graves. Na análise bacteriológica, todas as amostras foram positivas para o teste da catalase e oxidase e negativas para o citrato e H2S, e 11,3% foram negativas ao teste do indol. Utilizando-se os substratos sorbitol, manitol, trealose, maltose e arabinose foram observados seis perfis distintos. O tipo capsular A esteve presente em 93,91% das amostras e o tipo D em 6,09%. Nenhuma das amostras possuía o gene codificador da toxina dermonecrótica (toxA) e a resistência antimicrobiana foi baixa e a oxitetraciclina o princípio ativo com maior resistência 15,65%. / Pasteurella multocida is the etiologic agent of swine respiratory pasteurellosis and the infection occurs specially associated with Mycoplasma hyopneumoniae in the course of enzootic pneumonia. The agent can be isolated from the lung of several animal species and man. Infection of pigs with porcine circovirus (PCV2) causes a systemic infection with deep effects on the lymphoid system (porcine multisystemic wasting syndrome, PMWS), resulting in impairment of the normal defense processes and facilitating secondary infections, including enzootic pneumonia complicated with Pasteurella multocida. The objective of the present work was to isolate and characterize strains of P. multocida obtained from pigs with clinical signs compatible with PMWS and from slaughter pigs, considering biochemical profile, capsular typing and antibiotic sensitivity testing. A total of 453 materials (lungs and swabs from lung lesions) were used, resulting in 115 bacterial isolates from 79 lungs. At the same time, the efficiency of the isolation of the bacteria from two different sites in the lung was assessed: bronchial exudate and the cut surface of the lung. In a sample of the cases it was tried to establish the relationship between PCV2 infection and lung lesions induced by P. multocida. Analyzing degrees of pneumonia, 38 lesions were classified as mild, 19 as intermediate and 15 as severe. In the bacteriological analysis, all strains were positive for catalase and oxidase, and negative for citrate and H2S, and 11.3 were negative in the indole test. Using sugar fermentation (sorbitol, manitol, trealose, maltose and arabinose) six different profiles were established. Capsular type A was diagnosed in 93.91% of the samples and type D in 6.09%. All strains were negative for the gene codifying dermonecrotic toxin (toxA). Antimicrobial resistance was low, and tetracycline was the product showing higher resistance (15.65%).

Mycoplasma hyopneumoniae é o agente etiológico da pneumonia enzoótica, enfermidade distribuída mundialmente em rebanhos suínos nas fases de crescimento e terminação. A pneumonia enzoótica tem sido considerada uma das mais importantes causas de perdas econômicas na suinocultura mundial. Tendo em vista a disponibilidade dos genomas completos de três linhagens diferentes de M. pneumoniae, sendo duas patogênicas (linhagens 7448 e 232) e outra não patogênica (linhagem J) e a ausência de sistemas genéticos adequados para o estudo destes genomas, é necessidade emergente o desenvolvimento de ferramentas genéticas funcionais neste organismo. Atualmente, cinco espécies de micoplasmas possuem vetores replicativos disponíveis para transformação. No entanto nenhum deles possui a oriC de M. hyopneumoniae, e estudos sugerem que estes vetores são espécie-específicos e não seriam replicados em M. hyopneumoniae. Este trabalho teve como objetivos a construção de um vetor replicativo e o desenvolvimento de um sistema para transformação de M. hyopneumoniae. Os resultados alcançados constituem uma etapa prévia e imprescindível para o estudo de supostas regiões promotoras nesta espécie. O plasmídio replicativo pOSTM construído neste trabalho foi obtido a partir do vetor pUC18, adicionando-se a origem de replicação de M. hyopneumoniae e o cassete de expressão do gene de resistência à tetraciclina (tetM), controlado pelo promotor do gene da espiralina de Spiroplasma citri. A transformação foi realizada através de eletroporação e as células transformantes foram selecionadas pelo fenótipo de resistência à tetraciclina. Os transformantes resistentes à tetraciclina foram confirmados através da amplificação por PCR de porção do vetor inserido nas células. Tal comprovação permite concluir que o M. hyopneumoniae é um organismo susceptível à transformação e que o determinante tetM heterólogo é funcional neste patógeno. / Mycoplasma hyopneumoniae is the etiological agent of enzootic pneumonia of pigs.The disease has a worldwide distribution in growing and finishing pigs. The enzootic pneumonia has been considered one of the most important causes of economic losses in the worldwide swine breeding. The now available complete sequences of the genomes of two pathogenic (7448 and 232) and one non-pathogenic strain (J) of M. hyopneumoniae and the lack of suitable genetic systems to study these genomes points to the emergent need for the development of functional genetic tools for this organism. Currently, there are replicating vectors available for five species of mycoplasmas. However none of them posses oriC of M. hyopneumoniae, and studies suggest that these vectors are species-specific and they would not be functional in M. hyopneumoniae. The aim of the present study was to construct a replicating vector and the development of a system for transformation of M. hyopneumoniae. These constitute a previous and essential stage for the study of putative promoter regions in this species. To construct the replicating plasmid pOSTM the oriC of M. hyopneumoniae and the expression cassette containing the gene for tetracycline resistance (tetM), controlled by spiralin gene promoter of Spiroplasma citri, were introduced into the vector pUC18. The transformation was achieved by electroporation and transformants were selected for tetracycline resistance. Tetracycline resistance transformants were confirmed through PCR amplification of portion of the inserted vector. Such evidence allows the conclusion that M. hyopneumoniae is amenable to transformation and heterologous tetM determinant is functional in this pathogen.

A Pasteurella multocida é o agente causador da pasteurelose pulmonar dos suínos, sendo comum a ocorrência dessa infecção associada com o Mycoplasma hyopneumoniae no curso da pneumonia enzoótica. O agente é encontrado em pulmões de várias espécies animais e no homem. A infecção de suínos com o circovírus suíno tipo 2 (PCV2) causa uma forma de infecção sistêmica com profundos efeitos no sistema linfóide, causando prejuízos aos processos normais de defesa e facilitando a instalação de infecções secundárias, incluindo a pneumonia enzoótica complicada pela Pasteurella multocida. O objetivo deste trabalho foi isolar e caracterizar amostras de P. multocida obtidas de suínos com sinais clínicos compatíveis com os da circovirose e de animais de frigorífico quanto ao seu perfil bioquímico, capsular e sensibilidade a antimicrobianos. Foram utilizados 453 materiais (pulmões e suabes das lesões pulmonares), resultando em 115 isolados bacterianos de 79 pulmões. Paralelamente, procurou-se avaliar a eficiência do isolamento da bactéria a partir de dois sítios de amostragem no pulmão: do exsudato bronquial e da superfície de corte pulmonar. Numa amostragem dos casos, procurou-se estabelecer a relação entre a infecção com PCV2 e as lesões pulmonares induzidas pela P. multocida. Numa análise do grau de pneumonia foram classificadas 38 lesões como leves, 19 como médias e 15 graves. Na análise bacteriológica, todas as amostras foram positivas para o teste da catalase e oxidase e negativas para o citrato e H2S, e 11,3% foram negativas ao teste do indol. Utilizando-se os substratos sorbitol, manitol, trealose, maltose e arabinose foram observados seis perfis distintos. O tipo capsular A esteve presente em 93,91% das amostras e o tipo D em 6,09%. Nenhuma das amostras possuía o gene codificador da toxina dermonecrótica (toxA) e a resistência antimicrobiana foi baixa e a oxitetraciclina o princípio ativo com maior resistência 15,65%. / Pasteurella multocida is the etiologic agent of swine respiratory pasteurellosis and the infection occurs specially associated with Mycoplasma hyopneumoniae in the course of enzootic pneumonia. The agent can be isolated from the lung of several animal species and man. Infection of pigs with porcine circovirus (PCV2) causes a systemic infection with deep effects on the lymphoid system (porcine multisystemic wasting syndrome, PMWS), resulting in impairment of the normal defense processes and facilitating secondary infections, including enzootic pneumonia complicated with Pasteurella multocida. The objective of the present work was to isolate and characterize strains of P. multocida obtained from pigs with clinical signs compatible with PMWS and from slaughter pigs, considering biochemical profile, capsular typing and antibiotic sensitivity testing. A total of 453 materials (lungs and swabs from lung lesions) were used, resulting in 115 bacterial isolates from 79 lungs. At the same time, the efficiency of the isolation of the bacteria from two different sites in the lung was assessed: bronchial exudate and the cut surface of the lung. In a sample of the cases it was tried to establish the relationship between PCV2 infection and lung lesions induced by P. multocida. Analyzing degrees of pneumonia, 38 lesions were classified as mild, 19 as intermediate and 15 as severe. In the bacteriological analysis, all strains were positive for catalase and oxidase, and negative for citrate and H2S, and 11.3 were negative in the indole test. Using sugar fermentation (sorbitol, manitol, trealose, maltose and arabinose) six different profiles were established. Capsular type A was diagnosed in 93.91% of the samples and type D in 6.09%. All strains were negative for the gene codifying dermonecrotic toxin (toxA). Antimicrobial resistance was low, and tetracycline was the product showing higher resistance (15.65%).

Made available in DSpace on 2014-08-20T14:37:54Z (GMT). No. of bitstreams: 1 tese_sergio_jorge.pdf: 2951290 bytes, checksum: 56f3ca5434b1ecaa09d8776156f09097 (MD5) Previous issue date: 2014-03-06 / Mycoplasma hyopneumoniae is the etiological agent of enzootic pneumonia (EP), a contagious respiratory disease that affects swine production worldwide. M. hyopneumoniae colonizes the ciliated epithelial cells of the respiratory tract, damaging the cells and predisposing the infected animals to secondary infections, causing significant economic losses. The commonly used vaccines to control this disease consist of inactivated whole cells (bacterins). These bacterins provide only partial protection and do not prevent the colonization of M. hyopneumoniae on the epithelial cells. Efforts to develop a more effective vaccine against mycoplasmas have been proposed and vaccines developed using recombinant DNA technology represents a promissing alternative. Although the genomes of four strains of. M hyopneumoniae have been sequenced, few recombinant antigens have been evaluated as candidate vaccines. Our research group produced and evaluated the immunogenicity and antigenicity of 35 secreted recombinant proteins and 6 transmembrane recombinant proteins. Some of these proteins were identified as having the potential to be used as vaccine antigens, including the molecular chaperone DnaK (P42 heat shock protein). The aim of this study was to assess the potential of recombinant P42 in vaccine preparations against EP, using swine animal model housed under field condictions in a M. hyopneumoniae-positive farm. Both, humoral and cellular immune responses were elicited when rP42 was delivered in Phosphate buffer saline, when combined to an oil based adjuvant, and when added to a whole cell vaccine preparation. The results indicate that immunization with rP42 emulsified in oil based adjuvant is able to induce antibodies against M. hyopneumoniae as well as the expression and the anti-inflammatory cytokine IL-10 in pigs. These immunogenic properties make recombinant antigen P42 a promising candidate for a recombinant subunit vaccine against EP. / Mycoplasma hyopneumoniae é o agente etiológico da Pneumonia Enzoótica Suína (PES). A bactéria coloniza e paralisa as células epiteliais do trato respiratório, predispondo o hospedeiro a infecções secundárias, causando significativas perdas econômicas. As vacinas atualmente disponíveis são compostas por células bacterianas inteiras inativadas (bacterinas), as quais proporcionam apenas uma proteção parcial aos suínos. Elas são capazes de reduzir as lesões pulmonares e os sinais clínicos, mas não impedem a colonização pelo agente. Com a finalidade de desenvolver uma vacina mais eficiente contra a PES, o uso da tecnologia do DNA recombinante representa uma estratégia promissora. Após o sequenciamento e análise proteômica de quatro cepas de M. hyopneumoniae, nosso grupo de pesquisa produziu e avaliou a imunogenicidade e antigenicidade de 35 proteínas recombinantes secretadas e 6 proteínas transmembrana. Algumas destas proteínas apresentaram potencial para serem usadas como antígenos vacinais, onde se destacou a chaperona molecular DnaK P42 (proteína de choque térmico). O objetivo deste estudo foi avaliar a proteina recombinante P42 em formulações vacinais contra a PES. Para tanto, foram realizados ensaios utilizando suínos mantidos em condições de campo numa granja com status de positiva para M. hyopneumonia. Foram avaliadas as respostas humoral e celular dos grupos de animais imunizados com a rP42 em tampão fosfato salina, com a rP42 emulsificada em adjuvante oleoso e com a rP42 associada à bacterina comercial. Os resultados mostraram que a imunização com rP42 emulsificada em adjuvante oleoso é capaz de induzir anticorpos contra M. hyopneumoniae além da expressão da citocina anti-inflamatória IL-10. Estas propriedades imunogênicas tornam o antigeno rP42 um candidato para o desenvolvimento de uma vacina de subunidade recombinante contra a PES.