Introducción: Giardia intestinalis es el protozoario intestinal más común a nivel mundial y su diagnóstico parasitológico está basado en el examen microscópico, sin embargo, debido al carácter intermitente de la excreción del parásito en las heces el método puede revelar baja sensibilidad, esto ha motivado la búsqueda de nuevas alternativas de diagnóstico entre las que destacan aquellas que tiene como base la biología molecular. Objetivos: Evaluar 3 primeros para la detección molecular de G. intestinalis en muestras fecales. Diseño: Se realizó un estudio observacional, de corte transversal. Lugar: Instituto de Medicina Tropical “Daniel A. Carrión”, UNMSM. Procedimiento: Se evaluaron primers que amplifican las regiones de la beta-giardina y de la proteína de choque térmico 70 del ADN de G. intestinalis. Principales medidas de resultados: Se recolectó muestras fecales positivas y negativas a G. intestinales y a otros parásitos, las cuales fueron concentradas por centrifugación, luego almacenadas a -20°C y posteriormente analizadas mediante la técnica de PCR convencional. Resultados: Se estableció una temperatura de hibridación de 60°C para los primers de la beta-giardina y la proteína de choque térmico 70. La mezcla de reacción se estandarizó con las siguientes condiciones: Cl 2 Mg 1.5 mM, primers 0.6 µM, dNTPmix 0.3 mM y taq polimerasa 0.75 U. El límite de detección de los primeros fue de 87.3 ng/µL para beta-giardina, 359.5 ng/µL para GHSP70-1 y 24.1 ng/µL para GHSP70-2. Conclusiones: Se estableció una temperatura de hibridación y concentración de cloruro de magnesio común para los primers. Se observó un mejor límite de detección para el primer GHSP70-1 identificándose bandas en 7 diluciones con una sensibilidad y especificidad mayor que para el primer de la beta-giardina. / Introducción: Giardia intestinalis is the most common intestinal protozoan worldwide and its parasitologic diagnosis is based in microscopic examination; nonetheless, due to the intermittent parasites excretion in the feces, this method could reveal low sensitivity, this has motivated the search of new diagnostic alternatives such as those based on molecular biology. Goals: To assess 3 primers for the molecular detection of G. intestinalis in stool samples. Design: an observational, cross-sectional study was implemented. Settings: Tropical Medicine Institute “Daniel A. Carrión”, UNMSM. Procedures: We assessed primer that amplifies beta-giardin and heat-shock protein 70 of the G. intestinalis. Main measures of: Positives and negatives stool samples for G. intestinalis and for other parasites were collected and then concentrated by centrifugation and stored at -20°C for further analysis using conventional PCR. Results: A 60°C hybridization temperature was established for the primers of beta-giardin and the heat-shock protein 70. The master mix was standardized with the following conditions: 1.5mM Cl2Mg, 0.6 uM primers, 0.3mM dNTPmix and 0.75U Taq polimerasa. Limit detections were 87.3 ng/µL for beta-giardin, 359.5 ng/µL for GHSP70-1 and 24.1 ng/µL for GHSP70-2. Conclusions: We established a common hibridization temperature and a magnesium chloride common for the primers. A better detection limit was established for the primer GHSP70-1, identifying bands in seven dilutions with sensitivity and specificity higher for the beta-giardine primer. keywords: Giardia intestinalis, PCR, beta-giardina, heat-shock protein 70.

As proteínas de choque térmico (HSPs) são proteínas presentes nas células em condições normais e supra-expressadas em condições de estresse e choque térmico. O laser de diodo tem sido utilizado em diversos tratamentos na odontologia, dentre eles na atenuação de sintomas e na aceleração do reparo de úlceras traumáticas. O objetivo deste estudo foi verificar, através de análise imunoistoquímica da expressão das HSPs (Hsp27 e Hsp 47) e da medição de temperatura por intermédio de câmera termográfica, se o laser de diodo modifica, (e quanto modifica) a temperatura local, bem como se há alteração no padrão de expressão das proteínas citadas em três regiões distintas do fragmento analisado. Para este estudo, foram feitos testes in vitro e in vivo. Para os testes in vivo, foram utilizados 56 ratos, nos quais foi induzida úlcera em ventre lingual. Os animais foram divididos em 4 grupos: GL - grupo ulcerado com posterior irradiação com laser (parâmetros: laser diodo, 0,5 W de potência, pulsado (10 Hz), por 40 segundos (método varredura), 80J/cm2 de energia total (área de 0,25cm2) Má, e a energia por ponto?); GN - grupo ulcerado sem nenhum tratamento posterior; CP - grupo controle sem úlcera e irradiado com laser (mesmos parâmetros de GL); e CN - grupo controle sem úlcera e sem nenhum tratamento posterior. O teste in vitro foi destinado à medição da temperatura durante a irradiação laser, quando utilizaram-se línguas de ratos previamente ulceradas e extirpadas, as quais foram irradiadas com os parâmetros para o teste in vivo. Na superfície irradiada, houve aumento médio de temperatura em torno de 6,7C e, na região mais distante dessa superfície, de 2,7C. Na análise semiquantitativa da expressão imunoistoquímica da Hsp27, observou-se padrão de marcação mais intenso em GL comparando-se a GN e aos demais grupos. Na análise quantitativa da Hsp47, houve maior quantidade de células positivas no GL em relação aos demais grupos, principalmente nas regiões mais próximas da superfície irradiada. Concluiu-se que a irradiação laser provocou aumento de temperatura local, bem como desencadeou padrões de intensidade maiores e diferentes da Hsp27 e da Hsp47 em relação aos demais grupos. Isso indica que o tecido irradiado sofreu maior estresse celular, com resposta tecidual de intensa migração e diferenciação celular, bem como de maior síntese colagênica. / Heat shock proteins (HSPs) are proteins present in cells under normal conditions and over-expressed in terms of stress and thermal shock. The laser diode has been used in various treatments in dentistry, to reduce symptoms and accelerate the repair of traumatic ulcers. The aim of this study was to verify, by means of immunohistochemical expression analysis of HSPs (Hsp27 and Hsp 47) and temperature measurement using a thermographic camera, whether diode laser changes the local temperature (and how much the temperature changes), and whether there is a change in expression pattern of the above-mentioned protein in three distinct regions of the analyzed fragment. For this study, some of the tests were conducted in vitro and others in vivo. For the in vivo tests, 56 rats were used, in which ulcers were induced on the ventral surface of the tongue. The animals were divided into 4 groups: GL-group with ulcer and later laser irradiation (diode laser parameters: 0.5 W power, pulsed (10 Hz), for 40 seconds (defocused), 80J/cm2 total power in area (0.25cm2) GN- group with ulcer and without any further processing; CP- control group without ulcer and with laser irradiation (same parameters as in GL); and GN-control group without ulcer and without any further processing. The in vitro tests were conducted to measure temperature during laser irradiation, using the tongues that had previously been ulcerated in rats, and later removed and irradiated with the same parameters as those used for the in vivo test. In the irradiated surface, there was an increase in mean temperature of around 6.7oC, and in the region more distant from this surface, an increase of 2.7 oC. In the semi-quantitative analysis of immunohistochemical expression of Hsp27, greater expression of Hsp27 was shown in GL in comparison with the other groups in general. In quantitative analysis of Hsp47, there was a larger quantity of positive cells in GL, when compared with the other groups, particularly in the regions closest to irradiated surface. It was concluded that the irradiation laser caused local temperature increase, and also set off greater and different patterns of intensity of Hsp27 and Hsp47, in comparison with those of the other groups. This indicates that the irradiated tissue suffered higher cellular stress, with tissue response of intense migration and cell differentiation, as well as increased collagen synthesis.

As proteínas de choque térmico (HSPs) são proteínas presentes nas células em condições normais e supra-expressadas em condições de estresse e choque térmico. O laser de diodo tem sido utilizado em diversos tratamentos na odontologia, dentre eles na atenuação de sintomas e na aceleração do reparo de úlceras traumáticas. O objetivo deste estudo foi verificar, através de análise imunoistoquímica da expressão das HSPs (Hsp27 e Hsp 47) e da medição de temperatura por intermédio de câmera termográfica, se o laser de diodo modifica, (e quanto modifica) a temperatura local, bem como se há alteração no padrão de expressão das proteínas citadas em três regiões distintas do fragmento analisado. Para este estudo, foram feitos testes in vitro e in vivo. Para os testes in vivo, foram utilizados 56 ratos, nos quais foi induzida úlcera em ventre lingual. Os animais foram divididos em 4 grupos: GL - grupo ulcerado com posterior irradiação com laser (parâmetros: laser diodo, 0,5 W de potência, pulsado (10 Hz), por 40 segundos (método varredura), 80J/cm2 de energia total (área de 0,25cm2) Má, e a energia por ponto?); GN - grupo ulcerado sem nenhum tratamento posterior; CP - grupo controle sem úlcera e irradiado com laser (mesmos parâmetros de GL); e CN - grupo controle sem úlcera e sem nenhum tratamento posterior. O teste in vitro foi destinado à medição da temperatura durante a irradiação laser, quando utilizaram-se línguas de ratos previamente ulceradas e extirpadas, as quais foram irradiadas com os parâmetros para o teste in vivo. Na superfície irradiada, houve aumento médio de temperatura em torno de 6,7C e, na região mais distante dessa superfície, de 2,7C. Na análise semiquantitativa da expressão imunoistoquímica da Hsp27, observou-se padrão de marcação mais intenso em GL comparando-se a GN e aos demais grupos. Na análise quantitativa da Hsp47, houve maior quantidade de células positivas no GL em relação aos demais grupos, principalmente nas regiões mais próximas da superfície irradiada. Concluiu-se que a irradiação laser provocou aumento de temperatura local, bem como desencadeou padrões de intensidade maiores e diferentes da Hsp27 e da Hsp47 em relação aos demais grupos. Isso indica que o tecido irradiado sofreu maior estresse celular, com resposta tecidual de intensa migração e diferenciação celular, bem como de maior síntese colagênica. / Heat shock proteins (HSPs) are proteins present in cells under normal conditions and over-expressed in terms of stress and thermal shock. The laser diode has been used in various treatments in dentistry, to reduce symptoms and accelerate the repair of traumatic ulcers. The aim of this study was to verify, by means of immunohistochemical expression analysis of HSPs (Hsp27 and Hsp 47) and temperature measurement using a thermographic camera, whether diode laser changes the local temperature (and how much the temperature changes), and whether there is a change in expression pattern of the above-mentioned protein in three distinct regions of the analyzed fragment. For this study, some of the tests were conducted in vitro and others in vivo. For the in vivo tests, 56 rats were used, in which ulcers were induced on the ventral surface of the tongue. The animals were divided into 4 groups: GL-group with ulcer and later laser irradiation (diode laser parameters: 0.5 W power, pulsed (10 Hz), for 40 seconds (defocused), 80J/cm2 total power in area (0.25cm2) GN- group with ulcer and without any further processing; CP- control group without ulcer and with laser irradiation (same parameters as in GL); and GN-control group without ulcer and without any further processing. The in vitro tests were conducted to measure temperature during laser irradiation, using the tongues that had previously been ulcerated in rats, and later removed and irradiated with the same parameters as those used for the in vivo test. In the irradiated surface, there was an increase in mean temperature of around 6.7oC, and in the region more distant from this surface, an increase of 2.7 oC. In the semi-quantitative analysis of immunohistochemical expression of Hsp27, greater expression of Hsp27 was shown in GL in comparison with the other groups in general. In quantitative analysis of Hsp47, there was a larger quantity of positive cells in GL, when compared with the other groups, particularly in the regions closest to irradiated surface. It was concluded that the irradiation laser caused local temperature increase, and also set off greater and different patterns of intensity of Hsp27 and Hsp47, in comparison with those of the other groups. This indicates that the irradiated tissue suffered higher cellular stress, with tissue response of intense migration and cell differentiation, as well as increased collagen synthesis.

Made available in DSpace on 2014-08-20T14:37:54Z (GMT). No. of bitstreams: 1 tese_sergio_jorge.pdf: 2951290 bytes, checksum: 56f3ca5434b1ecaa09d8776156f09097 (MD5) Previous issue date: 2014-03-06 / Mycoplasma hyopneumoniae is the etiological agent of enzootic pneumonia (EP), a contagious respiratory disease that affects swine production worldwide. M. hyopneumoniae colonizes the ciliated epithelial cells of the respiratory tract, damaging the cells and predisposing the infected animals to secondary infections, causing significant economic losses. The commonly used vaccines to control this disease consist of inactivated whole cells (bacterins). These bacterins provide only partial protection and do not prevent the colonization of M. hyopneumoniae on the epithelial cells. Efforts to develop a more effective vaccine against mycoplasmas have been proposed and vaccines developed using recombinant DNA technology represents a promissing alternative. Although the genomes of four strains of. M hyopneumoniae have been sequenced, few recombinant antigens have been evaluated as candidate vaccines. Our research group produced and evaluated the immunogenicity and antigenicity of 35 secreted recombinant proteins and 6 transmembrane recombinant proteins. Some of these proteins were identified as having the potential to be used as vaccine antigens, including the molecular chaperone DnaK (P42 heat shock protein). The aim of this study was to assess the potential of recombinant P42 in vaccine preparations against EP, using swine animal model housed under field condictions in a M. hyopneumoniae-positive farm. Both, humoral and cellular immune responses were elicited when rP42 was delivered in Phosphate buffer saline, when combined to an oil based adjuvant, and when added to a whole cell vaccine preparation. The results indicate that immunization with rP42 emulsified in oil based adjuvant is able to induce antibodies against M. hyopneumoniae as well as the expression and the anti-inflammatory cytokine IL-10 in pigs. These immunogenic properties make recombinant antigen P42 a promising candidate for a recombinant subunit vaccine against EP. / Mycoplasma hyopneumoniae é o agente etiológico da Pneumonia Enzoótica Suína (PES). A bactéria coloniza e paralisa as células epiteliais do trato respiratório, predispondo o hospedeiro a infecções secundárias, causando significativas perdas econômicas. As vacinas atualmente disponíveis são compostas por células bacterianas inteiras inativadas (bacterinas), as quais proporcionam apenas uma proteção parcial aos suínos. Elas são capazes de reduzir as lesões pulmonares e os sinais clínicos, mas não impedem a colonização pelo agente. Com a finalidade de desenvolver uma vacina mais eficiente contra a PES, o uso da tecnologia do DNA recombinante representa uma estratégia promissora. Após o sequenciamento e análise proteômica de quatro cepas de M. hyopneumoniae, nosso grupo de pesquisa produziu e avaliou a imunogenicidade e antigenicidade de 35 proteínas recombinantes secretadas e 6 proteínas transmembrana. Algumas destas proteínas apresentaram potencial para serem usadas como antígenos vacinais, onde se destacou a chaperona molecular DnaK P42 (proteína de choque térmico). O objetivo deste estudo foi avaliar a proteina recombinante P42 em formulações vacinais contra a PES. Para tanto, foram realizados ensaios utilizando suínos mantidos em condições de campo numa granja com status de positiva para M. hyopneumonia. Foram avaliadas as respostas humoral e celular dos grupos de animais imunizados com a rP42 em tampão fosfato salina, com a rP42 emulsificada em adjuvante oleoso e com a rP42 associada à bacterina comercial. Os resultados mostraram que a imunização com rP42 emulsificada em adjuvante oleoso é capaz de induzir anticorpos contra M. hyopneumoniae além da expressão da citocina anti-inflamatória IL-10. Estas propriedades imunogênicas tornam o antigeno rP42 um candidato para o desenvolvimento de uma vacina de subunidade recombinante contra a PES.

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Organophosphorus compounds such as methyl-parathion are used in the various stages of production to control pests both in agricultural activity as in aquaculture. The mechanism of action of this type of compound is the inhibition of the enzyme acetylcholinesterase. The zebrafish (Danio rerio) has been increasingly used as an experimental model in varied fields such as development, genetics and pharmacological research. The methyl-parathion has been characterized as endocrine disruptor of the hypothalamic-pituitary-interrenal axis (HHI). An experiment was carried out of 96 hours of exposure of adult fish to the substance tested, at the concentration of 5.2 mg/L. Was evaluated the whole-body cortisol level in order to measure the endocrine response to a stressful event. Were also investigated the gene expression of glucocorticoid receptor (GR), steroidogenic acute regulatory protein (StAR) and heat shock protein 70 (HSP 70). Fish exposed that have undergone a stressor event demonstrated low levels of cortisol. In addition, the fish stressed and exposed to agro-chemical showed a decreased expression of the StAR, HSP 70 and GR genes. The data indicate that exposure to methyl-parathion causes a decrease in the ability to respond appropriately to a stressor. Fish that have an inability to produce a satisfactory answer by the HHI axis are not able to make the necessary metabolic and ion adjustments for recovery the homeostasis, getting vulnerable to stress caused by aquaculture practices or environmental changes. / Compostos organofosforados como o parationato metílico são utilizados nas diversas etapas de produção para controlar pragas tanto na atividade agrícola como na aquicultura. O mecanismo de ação desse tipo de composto é a inibição da enzima acetilcolinesterase. O peixe-zebra (Danio rerio) vem sendo cada vez mais usado como modelo experimental em variados campos, como desenvolvimento, genética e pesquisa farmacológica. O parationato metílico já foi caracterizado como interruptor endócrino do eixo hipotálamo-hipófise-interrenal (HHI). Foi realizado um experimento de 96 horas de exposição de peixes adultos à substância testada, na concentração de 5,2 mg/L. Foi avaliado o nível de cortisol de corpo inteiro, visando medir a resposta endócrina a um evento estressor. Também foram investigadas a expressão dos genes do receptor de glicocorticoide (GR), da proteína regulatória de esteroidogenese aguda (StAR) e a proteína do choque térmico 70 (HSP 70). Os peixes expostos que foram submetidos a um evento estressor demonstraram baixos níveis de cortisol de corpo inteiro. Além disso, os peixes estressados e expostos ao agroquímico apresentaram uma diminuição da expressão dos genes GR, StAR e HSP 70. Os dados indicam que a exposição ao parationato metílico provoca uma diminuição da capacidade de responder adequadamente a um evento estressor. Peixes que possuem uma incapacidade em produzir uma resposta satisfatória do eixo HHI, não são capazes de realizar os ajustes iônicos e metabólicos necessários à recuperação da homeostase, ficando vulneráveis ao estresse causado pelas práticas aquícolas ou por alterações ambientais.