Thèse (M.Sc.)--Université Laval, 2003. / Bibliogr.: f. [95]-106. Publié aussi en version électronique.

Thèse (M.Sc.)--Université Laval, 2002. / Bibliogr.: f. 103-110. Publié aussi en version électronique.

Thèse de doctorat : Médecine. Aspects moléculaires et cellulaires de la biologie : Nantes : 2006. / Bibliogr.

Thèse (Ph. D.)--Université Laval, 2007. / Bibliogr.: f. 224-254. Publié aussi en version électronique dans la Collection Mémoires et thèses électroniques.

Thèse (M.Sc.)--Université Laval, 2009. / Bibliogr.: f. [76]-97. Publié aussi en version électronique dans la Collection Mémoires et thèses électroniques.

Thèse (M.Sc.)--Université Laval, 2003. / Bibliogr.: f. 80-88. Publié aussi en version électronique.

La dystrophie musculaire de Duchenne, maladie héréditaire causée par la mutation du gène codant la protéine appelée dystrophine, se caractérise par une dégénérescence musculaire progressive et létale. Présentement, c’est une maladie incurable. La transplantation de cellules myogéniques (TM) est une des approches thérapeutiques envisagées pour améliorer la condition et l’espérance de vie des patients. Cette thérapie consiste à prélever des myoblastes d’un donneur sain et de les transplanter dans les muscles d’un patient dystrophique. Cette approche comporte plusieurs difficultés, dont la survie des myoblastes post-transplantation. Premièrement, les myoblastes injectés meurent rapidement et massivement, le succès de la transplantation ne reposant alors que sur une faible portion de cellules transplantées. Tous les facteurs impliqués dans cette mortalité cellulaire ne sont pas encore déterminés. Néanmoins, il est établi que la régénération musculaire se base sur les capacités de prolifération et de différenciation des myoblastes. Le premier article de cette thèse propose l’administration de la forme active de la vitamine D3 pour compenser la perte initiale des myoblastes injectés. Nous avons confirmé l’effet mitogénique et morphogénique de la vitamine D3 sur les myoblastes humains permettant ainsi, via son administration, d’augmenter le succès des TMs. La deuxième partie de cette thèse traite du rejet immunitaire lié à la TM allogénique. Actuellement, pour bloquer ce rejet, les approches cliniques proposent une immunosuppression soutenue des patients, se révélant toxique à long terme et augmentant le risque de contracter des maladies iatrogènes. Une autre procédure, moins délétère, repose sur le développement d’une tolérance immunologique, via l’établissement d’un chimérisme hématopoïétique mixte. Pour obtenir ce chimérisme, les procédures existantes nécessitent un lourd conditionnement des patients, incluant l’injection d’anticorps bloquants ou déplétants, ainsi qu’une irradiation pancorporelle. Le deuxième article de ce manuscrit propose l’administration de drogues cytoréductrices, déjà connues et approuvées en clinique. Ce protocole conduit au développement d’un statut de tolérance stable ainsi que le maintien à long terme des TMs. Les travaux effectués au cours de cette thèse proposent donc deux solutions pour circonvenir à la destruction précoce et plus tardive des myoblastes transplantés. Ces deux approches pourraient réduire l’aspect invasif de l’essai clinique basé sur la TM. / Duchenne muscular dystrophy is a fatal neuromuscular recessive disease characterized by widespread muscle damage throughout the body. No cure is currently available this disease. Myoblast transplantation (MT) is an interesting approach to enhance the life quality and life expectancy of patients. This therapy consists in harvesting myoblasts of a non-dystrophic donor and in transplanting them in dystrophic muscles. This approach involves many drawbacks and predominantly the loss of the grafted cells in post-transplantation period. Firstly, an important part of injected myoblasts quickly dies following their injection. Thus, the graft success relies on the survival of a little proportion of grafted cells. The pathways involved in this important death of cells are not well established. However, following a muscle injury, the muscular regeneration depends on the proliferation and the differentiation of myoblasts. In a first study, we propose an administration of the activated form of vitamin D3 on human myoblasts to compensate the early loss of injected cells. Actually, some previous studies demonstrated that this vitamin acted directly on myoblasts, regulating their proliferation and fusion. We have confirmed these effects and demonstrated that the administration of the vitamin D3 enhances the success of human MT. The second part of this thesis broaches the specific immune rejection associated with the allogeneic MT. Currently, Duchenne patients are treated with chronic immunosuppression for MT. However, the problem in humans is that the long-term use of immunosuppressive treatments has adverse effects: nephrotoxicity, increased cancer risk etc... Mixed-haematopoietic chimerism is a promising approach to circumvent sustained immunosuppression but most of proposed protocols need antibodies treatment or host irradiation. The second study of this thesis shows that we have developed a protocol based on a short term administration of two cytoreductive drugs, both approved for clinical use. The mixed-chimerism development obtained with our conditioning regimen promotes donor specific stable tolerance. Taken together, this thesis gives two solutions to circumvent the early and late destruction of transplanted myoblasts. These approaches could be further included in the clinical essay developed for the Duchenne muscular dystrophy by promoting the efficiency and decrease the clinical risk related to the MT.

La dystrophie musculaire de Duchenne (DMD) est une maladie dégénérative qui touche les jeunes garçons. L’absence de dystrophine, une protéine présente à la surface des fibres musculaires, entraîne la faiblesse des muscles caractéristique de la maladie. Plusieurs approches sont envisagées pour ralentir la progression mais aussi traiter la myopathie de Duchenne. La transplantation de cellules myogéniques ou myoblastes est une avenue qui permet de réintroduire la dystrophine dans les muscles atteints. La procédure consiste à injecter des cellules saines, contenant le gène normal de la dystrophine, aux patients. Malheureusement, certains problèmes sont associés avec cette approche. En effet, une perte cellulaire massive est observée dans les jours suivant la greffe. Ce déficit quantitatif peut être en partie compensé en injectant de grandes quantités de myoblastes. Par ailleurs, les cellules myogéniques se dispersent peu lors de leur injection dans le muscle. Il est donc nécessaire de faire de multiples injections rapprochées afin de traiter un muscle entier. Les facteurs de croissance sont de petits peptides qui peuvent moduler plusieurs activités cellulaires. Le facteur de croissance similaire à l’insuline (IGF-1) favorise la prolifération, la différenciation et la survie des cellules myogéniques. L’IGF-1 possède plusieurs isoformes comme le facteur de croissance associé au dommage mécanique (MGF). Les travaux présentés dans cette thèse démontrent qu’un peptide synthétique contenu dans le MGF favorise, quant à lui, la prolifération des myoblastes. De nouvelles fonctions pro-migratoires furent démontrées pour les deux peptides. En effet, l’IGF-1 et le peptide synthétique MGF sont en mesure de promouvoir la migration des cellules myogéniques humaines in vivo en modulant certains systèmes protéolytiques. D’autre part, mes travaux ont aussi démontré que le peptide MGF contribue au succès de la transplantation lorsqu’il est administré par injections intramusculaires ou sous-cutanées. Cette amélioration est possiblement causée par la capacité pro-mitogénique du peptide MGF qui compenserait un peu la perte cellulaire suite à l’injection. L’utilisation de l’IGF-1 et/ou du peptide synthétique MGF pourrait donc aider à diminuer le nombre d’injections requises pour traiter un muscle tout en contribuant au succès de la transplantation de myoblastes chez des patients atteints de dystrophie musculaire de Duchenne. / Duchenne muscular dystrophy (DMD) is a degenerative disease that affects young boys. The absence of the dystrophin, a protein located on the surface of the muscular fibers, contributes to muscle weakness that characterizes the disease. Many approaches are considered not only to slow down the progression but also to treat Duchenne myopathy. Myogenic cell or myoblast transplantation is an avenue which enables the reintroduction of the normal dystrophin gene in the affected muscles. The procedure consists of injecting normal cells, which contain the normal dystrophin gene, to the patients. Unfortunatly, some problems are associated with this approach. In fact, a massive cellular lost is observed during the days just after the graft. The injection of large quantities of myoblasts can make up for this quantitative deficit. Moreover, the myogenic cells do not migrate a lot when they are injected in the muscle. It is therefore necessary to make multiple close injections in order to treat an entire muscle. Growth factors are small peptides that can modulate many cellular activities. The insulin-like growth factor (IGF-1) favours myogenic cells proliferation, differentiation and survival. IGF-1 possesses many isoforms like the mechano growth factor (MGF). The results presented in this thesis demonstrate that a synthetic peptide within the MGF also favours myoblast proliferation. New pro-migratory functions have been demonstrated for both IGF-1 and MGF synthetic peptide. Indeed, they are both able to promote in vivo migration of human myogenic cells by modulating important proteolytic systems. On the other hand, my results have also demonstrated that the MGF peptide can increase the transplantation success when murine receivers are treated by intramuscular injections or systemic administration. This improvement is possibly caused by the MGF peptide pro-mitogenic capacity which could compensate for the initial cell lost. IGF-1 and MGF synthetic peptide could be used to help diminish the number of injections required to treat a muscle while contributing to myoblast transplantation success in patients affected by Duchenne muscular dystrophy.

La transplantation de myoblastes est une thérapie envisagée pour le traitement de la Dystrophie musculaire de Duchenne (DMD). La mort précoce des cellules injectées et leurs faibles migrations limitent son succès. Le MGF-Ct24E, un peptide synthétique qui représente le peptide E de l’isoforme Ec de l’IGF-1, a été utilisé. Il a augmenté la prolifération cellulaire en médiant son effet par un récepteur différent de celui à l’IGF-1. Des injections systémique et intramusculaire ont amélioré le taux de greffe, ce qu’un pré-traitement et une co-injection du peptide n’a pas permis. La surexpression du récepteur à l’IGF-1 avec un lentivirus a augmenté la prolifération des cellules et n’a eu aucun effet sur leur différentiation. La sélection de cellules surexprimant fortement le récepteur à l’IGF-1 et phosphorylant fortement Akt a amélioré le succès de transplantation. Ces résultats offrent une perspective encourageante pour l’amélioration de la transplantation cellulaire pour des patients atteints de DMD. / Myogenic cells transplantation is one of the promising therapies to treat dystrophic patients. Early cells death and poor migration are important problems who limit this therapy’s success. MGF-Ct24E, a synthetic copy of the peptide E from the IGF-1 Ec isoform, was used. The peptide increases the proliferation of cells and did no effect on the differentiation. Injected systematically and intramuscularly, MGF-Ct24E increased the graft success. When the cells were pretreated with the peptide and co-injected with it, no increase in the graft success was seen. The overexpression of IGF-1 receptor on human cells with a lentivirus increased the proliferation rate and did no effect on their differentiation. When the cells were selected for a high expression of the IGF-1 receptor and for a high phosphorylation of Akt, the graft success was increased. Together, those results are offering an interesting avenue for the amelioration of cells transplantation in DMD.

[Préconditionnement hypoxique des myoblastes humains ; préconditionnement pharmacologique des myoblastes humains]. / Problématique: La transplantation des myoblastes est une approche thérapeutique potentielle pour la dystrophie musculaire de Duchenne. Un des facteurs limitant de cette approche est la mort précoce de près de 80 % des myoblastes transplantés durant les premiers jours suivant la greffe. Nous avons vérifié si le préconditionnement hypoxique et pharmacologique des myoblastes humains permettait de réduire leur taux de mortalité in vitro. Par ailleurs, un 'cocktail' pro-survie constitué de facteurs anti-apoptotiques a été utilisé dans le but d'en tester l'effet sur la survie des myoblastes in vivo. Méthode: In vitro, la mortalité a été évaluée par marquage à l'Annexine V et par analyse au FACS. In vivo, la quantité de cellules vivantes a été estimée par scintigraphie en mesurant la quantité de carbone 14 radioactif incorporé dans l'ADN des myoblastes. Résultats: In vitro, le préconditionnement hypoxique des myoblastes permet d'augmenter le taux de prolifération des myoblastes. Le préconditionnement pharmacologique des myoblastes au DETA-NO (10 muM), un donneur d'oxyde nitrique permet d'améliorer leur survie in vitro (p<O.05). Par ailleurs, le traitement des myoblastes au diazoxide (1 00 muM), un activateur de canaux potassiques sensibles à l'ATP, combiné à un traitement au DETA-NO (50 muM ) permet d'améliorer de façon significative la survie des myoblastes in vitro (p<O.Ol). Le cocktail pro-survie permet de protéger les myotubes humains d'un stress anoxique prolongé (96 heures) in vitro. De plus, la transplantation des myoblastes humains suspendus dans le cocktail permet d'augmenter de 7 fois leur survie au bout de 5 jours après la greffe (p<O.Ol). Conclusion: Les préconditionnements hypoxique et pharmacologique sont des stratégies qui permettent de protéger les myoblastes humains du stress oxydatif in vitro. Le cocktail pro-survie peut être utilisé afin d'améliorer la transplantation des myoblastes. / Problématique: La transplantation des myoblastes est une approche thérapeutique potentielle pour la dystrophie musculaire de Duchenne. Un des facteurs limitant de cette approche est la mort précoce de près de 80 % des myoblastes transplantés durant les premiers jours suivant la greffe. Nous avons vérifié si le préconditionnement hypoxique et pharmacologique des myoblastes humains permettait de réduire leur taux de mortalité in vitro. Par ailleurs, un 'cocktail' pro-survie constitué de facteurs anti-apoptotiques a été utilisé dans le but d’en tester l'effet sur la survie des myoblastes in vivo. Méthode: In vitro, la mortalité a été évaluée par marquage à l'Annexine V et par analyse au FACS. In vivo, la quantité de cellules vivantes a été estimée par scintigraphie en mesurant la quantité de carbone 14 radioactif incorporé dans l'ADN des myoblastes. Résultats: In vitro, le préconditionnement hypoxique des myoblastes permet d'augmenter le taux de prolifération des myoblastes. Le préconditionnement pharmacologique des myoblastes au DETA-NO (10 ~M), un donneur d'oxyde nitrique permet d'améliorer leur survie in vitro (p<O.05). Par ailleurs, le traitement des myoblastes au diazoxide (1 00 ~M), un activateur de canaux potassiques sensibles à l'ATP, combiné à un traitement au DETA-NO (50 ~M ) permet d'améliorer de façon significative la survie des myoblastes in vitro (p<O.Ol). Le cocktail pro-survie permet de protéger les myotubes humains d'un stress anoxique prolongé (96 heures) in vitro. De plus, la transplantation des myoblastes humains suspendus dans le cocktail permet d'augmenter de 7 fois leur survie au bout de 5 jours après la greffe (p<O.Ol). Conclusion: Les préconditionnements hypoxique et pharmacologique sont des stratégies qui permettent de protéger les myoblastes humains du stress oxydatif in vitro. Le cocktail pro-survie peut être utilisé afin d'améliorer la transplantation des myoblastes. / Background: Myoblast transplantation is a potential therapeutical approach for Duchenne muscular dystrophy. One limiting problem is that up to 80 % of the transplanted myoblasts die few days following the graft. We have demonstrated that the hypoxic and pharmacological preconditioning reduces cell death in vitro. Moreover, a pro-survival cocktail composed of anti-apoptotic factors has been tested on the survival of human myoblasts transplanted into immunodeficient mice. Method: In vitro, cell death was evaluated by labeling cells with Annexin V followed by FACS analysis. In vivo, the percentage of cell viability was measured by the thymidine quantity in the transplanted cell DNA. Results: In vitro, the hypoxic preconditioning of myoblasts improved the proliferation of myoblasts. Pharmacologie preconditioning with DETA-NO (10 ~M), a nitric oxide donor, improved myoblasts survival in vitro (p<0.05). Furthermore, diazoxide (100 ~M), an ATP-dependent channel opener, combined with DETA-NO (50 ~M) improved significantly myoblasts survival in vitro (p<O.O 1). In addition to that, the prosurvival cocktail protected human myotubes from anoxie injury (96 hours). This cocktail improves myoblast survival 7-fold, five days after their transplantation (p<O.Ol). Conclusion: Hypoxic and pharmacologie al preconditioning can be used to protect myoblast from oxidative stress injury in vitro. AIso, the pro-survival cocktail. can be used to improve myoblast transplantation.