Thèse (Ph. D.) -- Université Laval, 1997. / Légendes sur f. en regard des ill. Bibliogr.: f. [334]-364. Publié aussi en version électronique.

La dystrophie musculaire de Duchenne est une myopathie récessive causée par l'absence d'une protéine, la dystrophine. Notre laboratoire travaille sur un traitement potentiel qui consiste à remplacer la protéine manquante en transplantant des myoblastes normaux ou génétiquement modifiés dans le muscle du patient atteint. Par contre, cette technique comporte des limitations; la mort cellulaire précoce, la faible dispersion ainsi que le rejet immunitaire nuisent à son succès. Ce projet de maîtrise vise à améliorer la greffe de myoblastes grâce à l'utilisation de l'epigallocatechin-gallate (EGCG), une composante majeure du thé vert. Récemment, il a été rapporté que l'inhibition de RAGE (Receptor for Advanced Glycation End-products) mène à une augmentation de la prolifération et de la migration et à une diminution de la différenciation et de la mort par apoptose des myoblastes [3]. L'EGCG, reconnu pour ces propriétés anti-oxydantes, pourrait en plus d'aider à réduire le stress oxydatif et l'inflammation causés lors de la transplantation, permettre une amélioration de la survie des myoblastes transplantés puisqu'elle pourrait avoir un effet sur l'expression du récepteur RAGE [4]. Nous nous sommes donc intéressés à l'effet de l'EGCG sur RAGE dans le contexte de la greffe de myoblastes. Notre hypothèse est donc que l'EGCG pourrait inhiber transitoirement l'expression de RAGE et augmenter la prolifération et la migration et diminuer la fusion et la mort par apoptose des myoblastes transplantés pour ainsi améliorer le succès de greffe. Nous avons confirmé que l'EGCG pouvait diminuer le niveau d'expression de RAGE dans les myoblastes et dans les muscles de souris. Nous avons obtenu une augmentation de la survie des myoblastes lorsque confrontés à un stress tel que la glucose oxydase. Nous avons aussi remarqué une diminution de la fusion des myoblastes in vitro mais malheureusement, nous ne pouvons confirmer l'augmentation du succès de greffe. Un test de migration pourrait être effectué pour vérifier l'effet de l'EGCG sur la migration des myoblastes ainsi qu'une autre expérience pour confirmer le succès de greffe.

La dystrophie musculaire de Duchenne est une dystrophie héréditaire secondaire à l’absence de la dystrophine, ce qui induit une faiblesse et une dégénérescence des muscles. Bien que plusieurs études ont démontré que la greffe de myoblastes permet de rétablir l’expression de la dystrophine, aucune étude physiologique n’a été réalisée, jusqu’à présent, pour démontrer qu’elle peut améliorer les propriétés contractiles du muscle. Dans ce travail, j’ai étudié l’effet de la greffe de myoblastes normaux sur les propriétés contractiles du muscle de la souris mdx, un modèle animal de la maladie de Duchenne. Mes travaux ont permis de démontrer que cette greffe protège le muscle mdx durant les contractions excentriques et que cet effet n’est pas expliqué seulement par l’expression de la dystrophine. En effet, l’étude des propriétés contractiles des muscles mdx transplantés avec des myoblastes mdx, montre que les muscles greffés sont aussi moins vulnérables aux contractions excentriques que les muscles mdx non greffés. / Duchenne muscular dystrophy is a hereditary dystrophy that results from a mutation of the dystrophin gene, which induces the weakness of muscles. Although several studies have already shown that the transplantation of normal myoblasts permit to restore the expression of dystrophin, no physiological study was made to verify whether myoblast transplantation is able to improve the muscle contractile properties. In this study, I have studied the effects of normal myoblast transplantation on the contractile properties of muscles of mdx mice, a model of Duchenne Muscular Dystrophy. My studies have shown that the transplantation of normal myoblasts protects mdx muscle from damage induced by eccentric contractions, and that this effect can not be explained only by the expression of dystrophin. Indeed, the comparison of mdx muscles transplanted with mdx myoblasts with non-transplanted muscles indicated that the transplanted muscles are more resistant to eccentric contractions than the non-transplanted ones.

Les blessures musculaires sont fréquentes et engendrent un coût social élevé en hausse constante. Suite à une blessure, une réadaptation musculaire efficace s'appuyant sur des évidences scientifiques est souhaitable. Les processus de résolution de l'inflammation et de réparation sont loin d'être compris dans leur ensemble. Le but de cette thèse était donc de contribuer à l'élargissement des connaissances se rapportant aux mécanismes moléculaires et cellulaires utilisés par les différents acteurs impliqués dans ces processus. Dans un premier temps, nous avons démontré in vitro que les mastocytes, reconnus pour leurs rôles inflammatoires, stimulent la prolifération des cellules musculaires. De façon plus précise, il a été établi que la tryptase exogène stimule la prolifération des myoblastes L6 via l'activation du récepteur activé par une protease de type 2 {protease-activated receptor, PAR-2) et la modulation subséquente de l'activité de la cyclooxygénase-2 (COX-2). De plus, la production de la prostaglandine 15-deoxy-delta-¹², ¹⁴-prostaglandine h (I5A-PGJ₂) serait potentiellement impliquée. Ensuite, l'effet direct des mastocytes sur la stimulation de la prolifération des myoblastes L6 a été confirmé in vitro. Parallèlement, il a été établi in vivo que les mastocytes sont activés suite à une blessure musculaire induite par l'injection intramusculaire de bupivacaïne et qu'en plus d'être modulée immédiatement après la blessure, l'expression de la tryptase augmente ultérieurement à un stade correspondant au début de la myogenèse. Contrairement à nos observations in vitro, l'inhibition de l'activité des mastocytes a induit une stimulation de la prolifération des myoblastes in vivo associée à une augmentation de la densité de cellules immunitaires (neutrophiles, macrophages Ml et M2) dont certaines sont reconnues pour stimuler la myogenèse. Les mastocytes sont impliqués dans plusieurs processus inter-reliés et l'isolation d'un seul effet est expérimentalement difficile. Finalement, les mécanismes assurant l'accumulation des macrophages dans le muscle post-blessure ont été investigués. Il a été établi que les macrophages Ml prolifèrent davantage lorsque leurs précurseurs sanguins sont éliminés alors que l'accumulation des macrophages M2 repose autant sur la prolifération locale que sur l'infiltration de précurseurs. En conclusion, plusieurs acteurs présents dans la phase inflammatoire jouent également un rôle essentiel dans la réparation musculaire.

La dystrophie myotonique de type 1 (DM1), la maladie neuromusculaire la plus fréquente chez l’adulte, est causée par une expansion de CTG dans la partie 3’ non traduite du gène codant pour la protéine dystrophy myotonic protein kinase, DMPK. La forme adulte de la maladie est caractérisée, notamment, par une faiblesse musculaire, de la myotonie, des cataractes et des troubles cardiaques. La forme congénitale, la forme la plus sévère de la maladie, est caractérisée par de l’hypotonie, une détresse respiratoire aiguë et un retard psychomoteur important. La régénération des fibres musculaires est déficiente dans la forme adulte de DM1, tandis qu’un retard de maturation du système musculaire est observé dans la forme congénitale. A ce jour, les mécanismes moléculaires par lesquels l’expansion de CTG affecte le développement ou la régénération du système musculaire sont inconnus. Des travaux ont démontré que le sérum de mères ayant un enfant atteint de la forme congénitale de la DM1 contient un facteur soluble inhibant la différenciation terminale des myoblastes. Il est encore indéterminé si ce facteur est produit par la mère ou sécrété par le fœtus. Nous avons émis l’hypothèse qu’un facteur soluble était sécrété par les myoblastes prélevés de patients atteints de forme congénitale de la DM1 qui inhibe la différenciation terminale des précurseurs des cellules musculaires. Les résultats obtenus démontrent que les myoblastes DM1 sécrètent un facteur soluble de masse moléculaire inférieure à 30 kDa inhibant la différentiation myogénique. Cet effet est associé une diminution spécifique de la myogenin. L’effet de ce facteur soluble est proportionnel à la longueur de l’expansion des CTG. L’identification et la caractérisation du facteur soluble sécrété spécifiquement par les myoblastes DM1 permettra une meilleure compréhension des mécanismes moléculaires responsable des défauts de développement du système musculaire observés dans la forme congénitale, et des défauts de régénération des fibres musculaires observés dans la forme adulte de la DM1. L’identification de ce facteur soluble est présentement en cours. / Myotonic dystrophy (DM1), the most common form of inherited neuromuscular disease in adults, affects 1 in 8000 individuals worldwide. DM1 is an autosomal dominant muscular dystrophy with very variable symptom presentations. Adult onset DM1 is primarily characterized by myotonia, muscle wasting and weakness, but also affects a number of organs and tissues. One characteristic of the disease is the presence of a severe congenital form (CDM1), which differs from the adult form. CDM1 is characterized by a delay in the development of skeletal muscles. This form is associated with hypotonia, respiratory complications and mental retardation. DM1 is caused by the expansion of an unstable CTG trinucleotide repeat in the 3’untranslated region of the myotonic dystrophy protein kinase (DMPK) gene. To date, the mechanisms by which the DM1 mutation affects skeletal muscles development or regeneration are unknown. A previous study demonstrated that serum produced by mothers of children with congenital myotonic dystrophy inhibits myogenic differentiation. In this study, we hypothesized that CDM1 myoblasts secrete a soluble factor that blocks myogenic differentiation. We provide evidence that this soluble factor is produced by DM1 and CDM1 myoblasts which may be involved in their deficiency to fuse. The inhibitory effect is proportional to the length of the CTG repeat expansion. In addition, the delay in muscle differentiation is associated with a specific reduction in myogenin gene expression. We believe that the DM1 mutation triggers the expression of a soluble factor, which is able to block myogenic differentiation. The identification of this soluble factor is presently under investigation.

La transplantation de myoblastes (cellules précurseurs du muscle) est une thérapie potentielle prometteuse pour le traitement de la dystrophie musculaire de Duchenne. À ce jour, aucun traitement efficace n'existe pour cette maladie. Cette thérapie consiste en l'injection des cellules directement dans le muscle malade. Comme tous les autres types de transplantation allogénique, les myoblastes sont rapidement rejetés par le système immunitaire, mais le rejet peut être contrôlé par l'emploi soutenu d'immunosuppresseurs. L'utilisation de ces immunosuppresseurs serait idéale si ce n'était de leurs effets indésirables importants. Pour contourner ce problème, il est possible d'induire une tolérance immunologique envers les myoblastes transplantés. Cet état de tolérance peut-être induit par deux voies principales : la tolérance périphérique et la tolérance centrale. Plusieurs protocoles d'induction de tolérance périphérique et centrale ont été démontrés efficaces dans la littérature chez des modèles animaux et, dans certains cas, chez l'humain. Nous avons donc appliqué certains de ces protocoles d'induction de tolérance à la transplantation de myoblastes. Lors de cette étude, il est démontré que l'induction de tolérance périphérique, avec les protocoles utilisés, n'ont permis que la prolongation de la survie des myoblastes et qu'une modulation centrale du système immunitaire pourrait améliorer les résultats de survie. C'est pourquoi nous nous sommes tournés vers l'utilisation de protocoles non-myéloablatifs de greffe de moelle osseuse utilisant des anticorps monoclonaux bloquant les signaux d'activation des lymphocytes. Par le développement de chimérisme, nous avons démontré, pour la première fois, l'induction d'une tolérance robuste et spécifique à la transplantation de myoblastes, sans aucune immunosuppression soutenue. Cette démonstration montre que l'induction de tolérance par modulation centrale pourrait un jour être appliquée à un traitement de transplantation de myoblastes pour la dystrophie musculaire de Duchenne, améliorant ainsi l'espoir d'une qualité de vie meilleure pour ces jeunes malades.

La dystrophie musculaire de Duchenne est une maladie neuromusculaire affectant un garçon sur 3200. Cette maladie se caractérise par l'absence d'une simple protéine, la dystrophine, qui assure normalelnent l'intégrité des fibres musculaires. Sans cette protéine, les fibres musculaires sont plus facilement endommagées, provoquant une dégénérescence musculaire. Rapidement, les facultés locomotrices diminuent, confinant habituellement le patient à un fauteuil roulant vers l'âge de 10 ans. L'utilisation d' une assi stance respiratoire s'avère généralement nécessaire au début de la vingtaine et le décès peut survenir dès l'âge de 17 ans. Les patients atteignent rarement la trentaine. La thérapie cellulaire se situe parmi les traitements curatifs potentiels et consiste à implanter au patient dystrophique des myoblastes contenant le gène normal de la dystrophine. Évidemment, cette thérapie présente quelques inconvénients, dont une réaction immune du patient contre les myoblastes transplantés. C'est ici qu'interviennent les travaux présentés dans ce mémoire avec comme objectif principal d'utiliser les Iymphocytes T régulateurs (Tregs) afin de créer un protocole de tolérance non-toxique pour les patients dystrophiques. Jusqu 'à maintenant, nous avons réussi à isoler efficacement et de manière reproductible ces Tregs en utilisant une armada d'anticorps spécifiques. Plus précisément, nous avons actuellement une pureté moyenne se situant entre 90% et 95%. Par après, en démontrant l'expression du FoxP3 au sein de ces cellules, ces travaux prouvent hors de tout doute que les cellules purifiées sont des Tregs au sens propre du tenne. Finalement, par des essais in vitro, nous avons efficacement démontré que les Tregs isolés conservaient leur capacité immunorégulatrice. En effet, suite à une stimulation artificielle, les lymphocytes T CD4⁺ mis en co-culture avec un ratio de Tregs de 1:4 se divisent deux fois moins que ceux sans Tregs. Afin de conclure ces travaux, il reste deux étapes majeures avant de crier victoire. Premièrement, il faut réussir à multiplier des Tregs spécifiques afin d'en avoir un nombre suffisant et d'avoir une plus grande spécificité. Deuxièmement, il faudra les réintroduire chez un modèle animal afin de tester s' ils empêchent le rejet d' une greffe allogénique.

Une des thérapies cellulaires pour le traitement de la Dystrophie Musculaire de Duchenne consiste à greffer aux patients des myoblastes provenant de donneurs sains. Ces myoblastes doivent être cultivées dans un milieu contenant du sérum fœtal bovin (FBS), or, cet additif n'est pas souhaitable dans le cadre d'une thérapie cellulaire. En effet, la présence de FBS dans le milieu de culture présente un problème de sécurité pour la santé humaine. Par ailleurs, les protéines qui composent le FBS sont très nombreuses et se trouvent dans des proportions extrêmement déséquilibrées. Identifier les protéines responsables de l’activité du FBS constitue donc un défi de taille. L’objectif global de ce projet est de mettre au point une série de méthodes de fractionnement de fluides biologiques, le FBS et le colostrum bovin, dans l’espoir de découvrir des fractions définies stimulant la croissance des myoblastes. Dans cette étude, les procédures de fractionnement du FBS choisies sont de trois types: l’électrodialyse sur membrane d’ultrafiltration, ainsi que deux méthodes affinitaires. D’autre part, du colostrum bovin dénommé, LP1.5, provenant de la société Métanature, a été testé pour son effet sur la prolifération des myoblastes. Les résultats montrent que le fractionnement du FBS a été réalisé avec succès. Néanmoins, les fractions obtenues n’ont pas montré d’effet significatif sur la croissance des myoblastes. En ce qui concerne les travaux avec le colostrum bovin, les fractions obtenues ont montré un effet stimulant sur la croissance des myoblastes, en présence d’une concentration réduite en FBS.

La dystrophie myotonique de type I est la pathologie neuromusculaire la plus répandue chez l'adulte. Elle est caractérisée par une atteinte multisystémique plus ou moins prononcée en fonction de l'extension des répétitions CTG, mutation à l'origine de l'atteinte. Le muscle squelettique est particulièrement touché avec un phénomène de myotonie ainsi qu'une atrophie. Les myoblastes, à l'origine de la formation des muscles et de leur régénération potentielle, présentent, chez les patients DM1, une capacité proliférative limitée par rapport à des myoblastes issus d'individus sains. C'est l'activation précoce de la voie p16 qui est à l'origine de cette sénescence prématurée des cellules DM1. Les mécanismes conduisant à ce phénotype sont néanmoins inconnus. Au cours de cette étude, nous avons tenté de décrypter une partie de ces mécanismes et notamment les liens potentiels entre les expansions CTG, la sensibilité au stress oxydatif et l'activation précoce de la voie p16 conduisant à la sénescence des myoblastes DM1

Thèse (M.Sc.)--Université Laval, 2007. / Bibliogr.: f. [55]-72. Publié aussi en version électronique dans la Collection Mémoires et thèses électroniques.