The DNA damage response is an important barrier to tumorigenesis. Impairment of p53 function is crucial to tumorigenesis by allowing evasion of p53 dependent responses. The mechanisms involve either (i) missense mutations, (ii) partial abrogation of signaling pathways or effector molecules that regulate p53, (iii) epigenetic deregulation. The tyrosine to cysteine mutation, Y220C, in p53 is found in around 100,000 new cancer cases per annum. This mutation destabilizes the core domain by 4 kcal mol-1 and destabilizes p53 under physiological conditions. The large to small mutation results in the fusing of two shallow pockets to create an extended surface cleft that a number of different fragments bind. The small molecule PK083, 1-(-ethyl-9H-carbazol-3-yl)-N-methanamine, binds the mutant-specific crevice with a KD = 150 μM and raised the protein mutant's half-life to over 15 minutes vs. 4 minutes in the absence of the ligand. This presents an ideal starting point towards the design of a p53 rescuing drug. A library of carbazoles was designed and synthesized, guided by SAR studies, crystallographic information and computational chemistry, with the aim of optimizing the structure toward a more potent PK083 analogue. Affinity gains were achieved by exploitation of direct fluorine-protein interactions between PK9255 (N-methyl-1-(9- (2,2,2-trifluoroethyl)-9H-carbazol-3-yl)methanamine), and the backbone carbonyls of Leu145 and Trp146 and the thiol of Cys220, resulting in a Kd = 28 μM. Further affinity gains were achieved through SAR studies targeting the proline-rich subsite II. Chemistry was optimized to allow a diversity-oriented synthesis toward 2,6,9- substituted carbazoles. A small library of PK083 analogues, where the subsite II targeting group was a halogen, ether, ester, amide or heterocycle were synthesized, identifying the heterocyclic compounds as most potent. A scan of heterocyclic compounds was carried out to identify the most potent heterocyclic substitution.

Made available in DSpace on 2018-08-01T21:35:05Z (GMT). No. of bitstreams: 1 tese_12339_Dissertação_Vinicius Mendes Eduardo.pdf: 1080730 bytes, checksum: 5a5942cebcb4a270d6c8129b73cfc107 (MD5) Previous issue date: 2018-03-19 / Determinação e validação de biomarcadores tumorais são importantes para avaliar o prognóstico de pacientes com câncer. Este estudo teve como objetivo avaliar o perfil de metilação e de expressão do gene CDKN2a como possível a biomarcador de prognóstico em pacientes com carcinoma epidermóide oral (CEO). Foram selecionados 115 casos com diagnóstico conclusivo de CEO destes 70 apresentavam tecido tumoral congelado. Dados clínico-patológicos foram obtidos por meio de entrevista e análise de prontuários. Cinquenta e cinco amostras de DNA com qualidade obtidas foram submetidas a PCR específica para metilação, e os casos positivos foram submetidos ao sequenciamento de Sanger para avaliar os dinucleotídeos citosina-guanina hipermetilados. Expressão da proteína p16 foi avaliada por imunohistoquímica. As análises estatísticas relacionando os resultados foram feitas e as curvas de Sobrevida Global e Sobrevida Livre de Doença foram elaboradas pelo método de Kaplan-Meier. A frequência de hipermetilação do CDKN2a na população estudada foi de 36,4%, sendo que a maior parte das citosinas localizadas em regiões CpG estavam hipermetiladas e citosinas fora da região CG também apresentaram metilação. A expressão de p16 foi predominantemente baixa (76,7%) nestas amostras. O perfil de metilação não mostrou associação com os indicadores de prognóstico, bem como não interferiu na Sobrevida Global e Livre de Doença. No entanto, os indicadores de prognóstico tamanho do tumor, estádio clínico, metástase linfonodal e modalidade de tratamento mostraram estar associados à Sobrevida Global. Concluímos que a hipermetilação do gene CDKN2a não se mostrou um bom biomarcador de prognóstico no grupo analisado neste estudo, mas parece desempenhar papel importante na carcinogênese do CEO.

Die Expression des p16-Tumorsuppressorgens spielt in der Früherkennung von Gebärmutterhalskrebs eine außerordentlich wichtige Rolle. Hier dient p16INK4a als immunhistochemisch evaluierter Biomarker für präkanzeröse Läsionen der Zervix. In der vorliegenden Arbeit wurde die Expression des p16-Proteins immunhistologisch anhand obligaten Präkanzerosen, potentiell präkanzeröser Entzündungen und Karzinomen der Mundhöhle untersucht. Hierzu wurden 80 Fälle aus dem histologischen Archiv der Klinik und Poliklinik für Dermatologie, Venerologie und Allergologie des Universitäts-Klinikums Würzburg sowie aus dem Institut für Pathologie der Universität Würzburg verwendet. Die Fälle stammen aus dem Zeitraum von 2000 bis 2011. Ziel der vorliegenden Arbeit war zu untersuchen, inwiefern das p16INK4a-Protein als Biomarker für prämaligne und maligne Läsionen fungieren kann. Die untersuchten Präparate beinhalteten orale Leukoplakien mit geringen und hoch dysplastischen Veränderungen sowie orale als auch extraorale Lichen planus und orale Plattenepithelkarzinome. Als Ergebnis lässt sich festhalten, dass die p16-Expression der oralen Leukoplakien nicht mit dem vorliegenden Dysplasiegrad korrelierte und ausgesprochen schwach ausfiel. Die Plattenepithelkarzinome der Mundhöhle zeigten größtenteils (75%) keine p16-Expression im invasiven Anteil des Tumors. Hier geht man davon aus, dass durch homozygote Deletionen, inaktivierende Mutationen sowie durch eine nicht korrekt ausgeführte Promotormethylierung die p16-Expression ausgeschaltet wird. Darüber hinaus wiesen die Fälle des Lichen planus eine zumeist stark positive Expression von p16INK4a auf, da 93,3 % der oralen und 95% der extraoralen Lichen planus positiv ausfielen. Verglichen mit oralen Leukoplakien weisen der orale und kutane Lichen planus ein sehr viel geringeres Risiko der malignen Transformation auf. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die hier demonstrierten Ergebnisse die Hypothese zulassen, dass eine Überexpression des p16-Proteins das Risiko einer malignen Entartung niedrig hält. Ein Herunterfahren des p16-Tumorsuppressorgens kann somit ein erster Schritt der Genese eines malignen Tumors sein. Die Diskussion dieser Hypothesen sollte jedoch durch weiterführende Untersuchungen bestätigt werden. / The expression of tumor suppressor gene p16 plays a particularly important role in the early diagnosis of cervical cancer, with p16INK4a serving as a immunohistochemical evaluated biomarker for precancerous lesions of the uterine cervix. In this study the immunohistological expression of the p16 protein was examined in obligate and potential precancerous lesions and carcinomas of the oral cavity. To this end, 80 cases from the histological archives of the departments of dermatology and pathology of the University Hospital Würzburg were analyzed. All cases date from 2000 to 2011. The aim of the present study was to investigate to what extent the protein p16INK4a can serve as a biomarker for premalignant and malignant lesions. The examined biopsies comprised oral leukoplakia with low-grade and high-grade dysplasia as well as both oral and extraoral lichen planus and oral squamous cell carcinomas. The results showed that the p16 expression in oral leukoplakia was relatively weak and did not correlate with the grade of dysplasia. Most of the squamous cell carcinomas (75%) of the oral cavity showed no p16 expression in the invasive part of the tumor. Loss of the p16 expression can be attributed to homozygous deletions, inactivating mutations and aberrant promoter methylation. Moreover, in most cases of lichen planus the expression of p16INK4a was highly positive, with 93.3% of the oral and 95% of the extraoral lichen planus being positive. Compared to oral leukoplakia, both forms of lichen planus have a considerably lower risk of malignant transformation. In conclusion it can be suggested that the results of this study support the hypothesis that the over-expression of the p16 protein keeps the risk of malignant transformation low. Therefore loss of tumor suppressor gene p16 can be a first step towards the genesis of a malignant tumor. However, these hypotheses are to be confirmed by further studies.

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Realizar estudo imuno-histoquímico com os marcadores p16 e Ki-67 nas lesões de líquen plano bucal em pacientes assintomáticos e sintomáticos, verificando a presença e modo de marcação, analisando se existe correlação entre os resultados que possa indicar os riscos de transformação maligna. MATERIAL E MÉTODOS: nove pacientes assintomáticos e 12 sintomáticos de líquen plano bucal. Cinco amostras de hiperplasia fibrosa inflamatória foram empregadas como grupo controle. Foram utilizados anticorpos p16 (pré-diluído – BioSB/EUA) e Ki-67 (clone MIB-1 – DAKO/EUA) pela técnica Envision Labelled (DAKO). Os resultados foram analisados de acordo com os parâmetros baseados no estudo de Klaes et al. (2001) avaliando a porcentagem de células marcadas, a distribuição pela camada epitelial e a intensidade da marcação. A análise estatística procedeu ao estudo do risco relativo entre pacientes assintomáticos e sintomáticos com relação ao local da expressão celular (nuclear, citoplasmática ou ambas), com as localizações mais prevalentes da lesão (mucosa jugal e língua) e com os tipos clínicos mais comuns (reticular e atrófico). RESULTADOS: a correlação entre pacientes assintomáticos e sintomáticos foi estatisticamente significativa (p<0,05) quando avaliamos a distribuição da p16 pela camada epitelial com relação ao local da expressão celular e com a localização da lesão. Odds ratio da marcação nuclear foi de 4,091. A total (nuclear e citoplasmática) foi de 5,179. Já a marcação somente citoplasmática teve odds ratio de 8,461. A correlação com a localização resultou num odds ratio de 5,130 para a língua e 14,234 para a mucosa jugal. As outras categorias avaliadas, porcentagem e intensidade da p16, as características clínicas avaliadas e os resultados do Ki-67, não foram significativos em nenhum item avaliado. CONCLUSÕES: o risco relativo maior quando da marcação somente citoplasmática nos mostra que este é um importante sítio de expressão da p16, não devendo ser desprezado, como sugerido por alguns estudos. A localização apontada na literatura como de maior prevalência nos casos de transformação maligna é a língua, porém o risco relativo no nosso estudo foi maior na mucosa jugal. Como a distribuição foi o único item estatisticamente significativo, faz-se necessário estudo futuro para incluir ou excluir a presença do vírus do papiloma humano nas lesões de líquen plano bucal, visto que a proteína p16 vem sendo indicada para detectar anormalidades celulares nas amostras de cérvice uterina, sendo atribuída a sua superexpressão com a presença de HPV de alto riso, além de estudo da p16 nos casos de displasias liquenóides. / We realized immunohistochemical procedures with p16 and Ki-67 in lesions of oral lichen planus to verify the presence and kind of its immunoexpression amog the two groups of patients, asymptomatic and symptomatic, correlating the clinical and histopathological diagnosis with the immunohistochemical data in order to verify if oral lichen planus can be considered a lesion with risk of malignant transformation. MATERIAL AND METHOD: nine asymptomatic patients and 12 symptomatic of oral lichen planus. Five cases of inflammattory fibrous hyperplasia were included as control group. For immunohistochemical studies we used p16 (prediluted–BioSB/USA) and Ki-67 (clone MIB-1–DAKO/USA) by Envision Labelled techniques (DAKO). Results were annalyzed according to parameters based on Klaes et al. (2001) evaluating the immunomarked cell rates, the distribution through the epithelial layer and the immunoexpression intensity. The statistics analysis proceeded the study of relative risk between asymptomatic and symptomatic patients regarding to its cellular immunoexpression (nuclear, cytoplasmic or both), the more prevalent topography of the lesion (buccal mucosa and tongue) and clinical characteristics (atrophic and reticular types). RESULTS: the correlation between asymptomatic and symptomatic patients was statistically significant (p<0.05) when comparison was made of the distribution of p16 throug the epithelial layer by analysis its cellular imumunoexpression. The nuclear immunoexpression of p16 showed an odds ratio of 4.091. The nuclear and cytoplasmatic were 5.179. The odds ratio for cytoplasmatic expression was 8.461. The correlation between immunoexpression and topography resulted in an odds ratio of 5.130 for tongue and 14.234 for buccal mucosa. The other categories availed as percentage and intensity of the p16 immunoexpression, clinical characteristics, besides the Ki-67 results gave non significant results. CONCLUSIONS: The citoplasmatic expression results indicates that this immunoexpression must not be discarded, as suggested by some studies. The high relative risk saw in buccal mucosa rather than tongue was an unexpected result, because the localization pointed as with greater involvement in cases of malignat transformation is the tongue. The distribution was the only one that reached a statistically significant result, so further studies must be made in order to include or exclude the human papillomavirus presence in oral lichen planus lesions, since the p16 protein is currently nowadays used as an indicator of cellular abnormalities in cervical lesions, where its overexpression is related to the presence of high risk human papillomavirus, beyond study of p16 in the cases of liquenoid dysplasia.

Várias evidências sugerem que a dieta é um fator relevante na modificação dos riscos de desenvolvimento de câncer e que a interação nutriente-genoma tem uma influência significativa para a manutenção da saúde. A nutrigênomica estabelece uma relação entre dieta e a investigação das alterações epigenéticas do DNA, que podem ter um papel importante na etiologia de várias doenças degenerativas. A metilação do DNA é um evento epigenético importante na modificação da expressão gênica e já existem relatos de cânceres associados com a metilação da região promotora de genes supressores tumorais, como o gene p16. A metionina (Met) é um aminoácido essencial e necessário para a manutenção do ciclo de metionina, um importante mecanismo nas reações de metilação. Outro fator que pode alterar o padrão de metilação do DNA são os quimioterápicos. A alteração da metilação do DNA, também pode modificar a estrutura dos cromossomos e levar a instabilidade genômica, relacionada com o desenvolvimento de neoplasia. O objetivo deste trabalho foi avaliar o efeito da suplementação de metionina sobre as alterações no padrão de metilação da região promotora do gene p16 no fígado e rins de ratos e as possíveis modificações induzidas pela interação com o antitumoral doxorrubicina (DXR), além da possível instabilidade genômica em células da medula óssea. Para isso, seis grupos de ratos Wistar machos (n=60) foram tratados durante seis semanas com ração comercial normal ou suplementada com 2% de Met, sendo que na 3º semana e 24 horas antes da eutanásia administrou-se salina ou DXR (1 ou 10 mg/Kg p.c.), intraperitonealmente. Os rins e o fígado foram utilizados para extração do DNA e para o estudo do padrão de metilação pelo método COBRA, após a modificação do DNA com bissulfito de sódio e amplificação por PCR. As enzimas EcoRI, TaqI e HphI foram utilizadas para verificar o padrão de metilação da região promotora do gene p16 e a enzima TasI para avaliar a modificação do DNA pelo bissulfito. Em todos os animais houve a restrição do fragmento de estudo pelas enzimas TasI e HphI, porém nenhuma restrição com as enzimas EcoRI e TaqI. O padrão de metilação da região promotora do gene p16 nos rins e no fígado não foi alterado pela suplementação de Met ou pela administração de DXR, quando se comparou os grupos controles e os tratados. A justificativa é que o gene p16 é importante na regulação do ciclo celular, apoptose e senescência e sua regulação segue um mecanismo bem controlado. Para estudar o efeito da suplementação de Met na instabilidade genômica, realizou-se o teste do micronúcleo (MN) na medula óssea dos ratos. Pela a análise do MN, a suplementação com Met não alterou a frequência de MN, mas o tratamento com a DXR (1 e 10mg/Kg) induziu a formação de MN quando comparado com o grupo Controle. A associação de Met+DXR não reduziu a freqüência de MN induzida pela DXR. Conclui-se que a Met na dieta ou a administração do quimioterápico DXR não alterou o padrão de metilação da região promotora do gene p16. O excesso de Met não apresentou ação mutagênica no teste do MN. Não houve efeito antimutagênico da Met quando associada com a DXR. / Several evidences suggest that to diet is a relevant factor in modifying the risks of developing cancer and the nutrient-genome interaction has a significant influence for the maintenance of a good health condition. Nutrigenomic establishes a relation between to diet and the investigation of epigenetic DNA modifications, which may play an important role in the etiology of various degenerative diseases. DNA methylation is an important epigenetic event modification of gene expression and there been reports of cancers associated with promoter methylation region of tumor suppressor genes such as p16 gene. Methionine (Met) is an essential aminoacid to maintain methionine cycle, very important mechanism in methylation reactions. Another factor that can change the methylation pattern is the chemotherapeutic drugs. DNA methylation alteration can also modify chromosome structure and lead to a genomic instability related to the development of neoplasia. The aim of this study was to analyze the effect of methionine supplementation on changes in the methylation pattern of the promoter region of the p16 gene in the liver and kidneys of rats and the possible changes induced by interaction with the antitumoral doxorubicin (DXR), besides the possible genomic instability in bone marrow cells. Six Wistar rats groups (n=60) received commercial diet or commercial diet plus Met 2% for six weeks. At third week and 24 hours before euthanasia they received saline or DXR (1 or 10 mg/Kg) intraperitoneally. DNA extraction of the kidneys and liver was used for the study of the methylation pattern of promoter region on the p16 gene by COBRA method, after DNA sodium bisulfite modification and PCR amplification. EcoRI, TaqI and HphI enzymes were used to determine the methylation pattern of promoter region of the p16 gene and TasI enzyme was used to validate bisulfite conversion. All animals had digestion with TasI and HphI enzymes, however no restriction with EcoRI and TaqI enzymes. Kidneys and liver DNA methylation pattern promoter region of p16 gene did not change by Met supplementation or DXR administration, when comparing the controled and the treated groups. The justification is that the p16 gene is very important in cycle cellular regulation, apoptosis and senescence and its regulation follows a well controlled mechanism. To study Met supplementation in genomic instability the micronucleus (MN) test was realized in the rat bone marrow. By Micronuclei analysis, met supplementation did not alter MN frequency, but DXR treatment (1 or 10 mg/Kg) induced MN formation when compared to Control group. The association of Met+DXR did not decrease MN frequency by induced DXR. In conclusion, Met on the diet or DXR administration did not change methylation pattern of promoter region of the p16 gene. The supplemented Met did not show mutagenic effect in MN test. There was no antimutagenic effect of Met when associated to DXR.

A neoplasia escamosa da superfície ocular constitui é uma das lesões mais frequentes que envolve a conjuntiva ou a córnea e tem como principais fatores de risco a exposição solar (radiação ultravioleta), a infecção pelo vírus do papiloma humano (HPV) e os estados de imunodeficiência, especialmente a infecção pelo vírus da imunodeficiência humana (HIV). Em suas formas mais avançadas, a neoplasia pode cursar com infiltração do globo ocular, da órbita e, mais raramente, com ocorrência de metástases para linfonodos ou a distância. O presente estudo teve como objetivo investigar os dados clínicos, histopatológicos, a presença de HPV e a expressão das proteínas p16 e p53 em 45 casos de neoplasia escamosa da superfície ocular diagnosticados no Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto, Universidade de São Paulo, no período de 2005-2015. Avaliação histopatológica das lesões, estudo imuno-histoquímico para a detecção das proteínas e hibridização in situ cromogênica (CISH) para a detecção do DNA de HPV de alto e baixo grau foram realizados em todas as amostras. As lesões foram mais frequentes em homens de cor branca, com idade superior a 40 anos. A avaliação histopatológica revelou 31 casos (69%) de carcinoma invasivo e 14 casos (31%) de carcinoma in situ. Em 6 casos (13%) foi detectado DNA de HPV de alto grau por CISH. A frequência de expressão de proteínas p53 e p16 foi alta nas lesões, 89% e 53%, respectivamente. Em nosso estudo, a neoplasia escamosa da superfície ocular predomina em homens de cor branca, com idade acima dos 40 anos, com presença de HPV de alto grau em 13% dos casos. A expressão de p16 não apresentou um valor preditivo positivo alto quanto a possibilidade de associação com o vírus. / Ocular surface squamous neoplasia (OSSN) is one the most frequent lesions involving the conjunctiva or cornea and its main risk factors are solar exposure (ultraviolet radiation), human papilloma virus (HPV) infection and immunodeficiency states, especially human immunodeficiency virus (HIV) infection. In advanced cases one can observe eyeball or orbital infiltration and, rarely, lymph node or distant metastases. The present study aimed to investigate the clinical and histopathological data, as well as the presence of HPV and the expression of proteins p16 e p53 in 45 cases of OSSN diagnosed at the Clinics Hospital of Ribeirão Preto Medical School, University of São Paulo, from 2005 through 2015. Histopathological examination, immunohistochemical study for proteins p16 and p53, and chromogenic in situ hybridization (CISH) for low and high grade HPV were performed in all samples. Lesions were more frequent in white males, above 40 years old. Histopathological examination revealed 31 cases (69%) of invasive carcinoma and 14 cases (31%) of carcinoma in situ. In 6 cases (13%) high grade HPV was detected by CISH. The expressions of p53 and p16 were high, 89% and 53%, respectively. In our study, increased incidence of OSSN was observed in white males, above 40 years old, with high grade HPV in 13% of the cases. The expression of p16 did not show a high positive predictive value for HPV positivity in OSSN.

A neoplasia escamosa da superfície ocular constitui é uma das lesões mais frequentes que envolve a conjuntiva ou a córnea e tem como principais fatores de risco a exposição solar (radiação ultravioleta), a infecção pelo vírus do papiloma humano (HPV) e os estados de imunodeficiência, especialmente a infecção pelo vírus da imunodeficiência humana (HIV). Em suas formas mais avançadas, a neoplasia pode cursar com infiltração do globo ocular, da órbita e, mais raramente, com ocorrência de metástases para linfonodos ou a distância. O presente estudo teve como objetivo investigar os dados clínicos, histopatológicos, a presença de HPV e a expressão das proteínas p16 e p53 em 45 casos de neoplasia escamosa da superfície ocular diagnosticados no Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto, Universidade de São Paulo, no período de 2005-2015. Avaliação histopatológica das lesões, estudo imuno-histoquímico para a detecção das proteínas e hibridização in situ cromogênica (CISH) para a detecção do DNA de HPV de alto e baixo grau foram realizados em todas as amostras. As lesões foram mais frequentes em homens de cor branca, com idade superior a 40 anos. A avaliação histopatológica revelou 31 casos (69%) de carcinoma invasivo e 14 casos (31%) de carcinoma in situ. Em 6 casos (13%) foi detectado DNA de HPV de alto grau por CISH. A frequência de expressão de proteínas p53 e p16 foi alta nas lesões, 89% e 53%, respectivamente. Em nosso estudo, a neoplasia escamosa da superfície ocular predomina em homens de cor branca, com idade acima dos 40 anos, com presença de HPV de alto grau em 13% dos casos. A expressão de p16 não apresentou um valor preditivo positivo alto quanto a possibilidade de associação com o vírus. / Ocular surface squamous neoplasia (OSSN) is one the most frequent lesions involving the conjunctiva or cornea and its main risk factors are solar exposure (ultraviolet radiation), human papilloma virus (HPV) infection and immunodeficiency states, especially human immunodeficiency virus (HIV) infection. In advanced cases one can observe eyeball or orbital infiltration and, rarely, lymph node or distant metastases. The present study aimed to investigate the clinical and histopathological data, as well as the presence of HPV and the expression of proteins p16 e p53 in 45 cases of OSSN diagnosed at the Clinics Hospital of Ribeirão Preto Medical School, University of São Paulo, from 2005 through 2015. Histopathological examination, immunohistochemical study for proteins p16 and p53, and chromogenic in situ hybridization (CISH) for low and high grade HPV were performed in all samples. Lesions were more frequent in white males, above 40 years old. Histopathological examination revealed 31 cases (69%) of invasive carcinoma and 14 cases (31%) of carcinoma in situ. In 6 cases (13%) high grade HPV was detected by CISH. The expressions of p53 and p16 were high, 89% and 53%, respectively. In our study, increased incidence of OSSN was observed in white males, above 40 years old, with high grade HPV in 13% of the cases. The expression of p16 did not show a high positive predictive value for HPV positivity in OSSN.

Angesichts der nach wie vor hohen Mortalität und Morbidität des Bronchialkarzinoms ist die Entwicklung geeigneter Methoden zur früheren Diagnostik eine wichtige Notwendigkeit, um die geringe durchschnittliche 5-Jahres-Überlebensrate von 15% – 18% zu steigern. Unter diesem Gesichtspunkt wurde in der vorliegenden Arbeit das Atemkondensat von Patienten mit Bronchialkarzinom als nicht-invasiv und kostengünstig zu gewinnendes Medium auf das Vorliegen eines potentiellen Screeningmarkers – dem methylierten Tumorsuppressor-Gen p16 – untersucht. Dazu wurde ein Versuchsablauf entwickelt, bei dem trotz des geringen DNA-Gehaltes im Atemkondensat p16-Methylierungen nachgewiesen werden konnten. Die letztendlich etablierte Methode war eine methylierungsspezifische nested-PCR mit anschließendem Restriktionsverdau durch das Restriktionsenzym BstUI. Des Weiteren erfolgte die Untersuchung von in Paraffin eingebetteten Tumorpräparaten der Patienten. In der anschließenden statistischen Auswertung wurde der Einfluss von verschiedenen Faktoren wie COPD-Grad, Tumorlage, Tumorart, Nikotinabusus und stattgehabte Chemo- oder Strahlentherapie auf den Methylierungsstatus des p16-Gens analysiert.

Realizar estudo imuno-histoquímico com os marcadores p16 e Ki-67 nas lesões de líquen plano bucal em pacientes assintomáticos e sintomáticos, verificando a presença e modo de marcação, analisando se existe correlação entre os resultados que possa indicar os riscos de transformação maligna. MATERIAL E MÉTODOS: nove pacientes assintomáticos e 12 sintomáticos de líquen plano bucal. Cinco amostras de hiperplasia fibrosa inflamatória foram empregadas como grupo controle. Foram utilizados anticorpos p16 (pré-diluído – BioSB/EUA) e Ki-67 (clone MIB-1 – DAKO/EUA) pela técnica Envision Labelled (DAKO). Os resultados foram analisados de acordo com os parâmetros baseados no estudo de Klaes et al. (2001) avaliando a porcentagem de células marcadas, a distribuição pela camada epitelial e a intensidade da marcação. A análise estatística procedeu ao estudo do risco relativo entre pacientes assintomáticos e sintomáticos com relação ao local da expressão celular (nuclear, citoplasmática ou ambas), com as localizações mais prevalentes da lesão (mucosa jugal e língua) e com os tipos clínicos mais comuns (reticular e atrófico). RESULTADOS: a correlação entre pacientes assintomáticos e sintomáticos foi estatisticamente significativa (p<0,05) quando avaliamos a distribuição da p16 pela camada epitelial com relação ao local da expressão celular e com a localização da lesão. Odds ratio da marcação nuclear foi de 4,091. A total (nuclear e citoplasmática) foi de 5,179. Já a marcação somente citoplasmática teve odds ratio de 8,461. A correlação com a localização resultou num odds ratio de 5,130 para a língua e 14,234 para a mucosa jugal. As outras categorias avaliadas, porcentagem e intensidade da p16, as características clínicas avaliadas e os resultados do Ki-67, não foram significativos em nenhum item avaliado. CONCLUSÕES: o risco relativo maior quando da marcação somente citoplasmática nos mostra que este é um importante sítio de expressão da p16, não devendo ser desprezado, como sugerido por alguns estudos. A localização apontada na literatura como de maior prevalência nos casos de transformação maligna é a língua, porém o risco relativo no nosso estudo foi maior na mucosa jugal. Como a distribuição foi o único item estatisticamente significativo, faz-se necessário estudo futuro para incluir ou excluir a presença do vírus do papiloma humano nas lesões de líquen plano bucal, visto que a proteína p16 vem sendo indicada para detectar anormalidades celulares nas amostras de cérvice uterina, sendo atribuída a sua superexpressão com a presença de HPV de alto riso, além de estudo da p16 nos casos de displasias liquenóides. / We realized immunohistochemical procedures with p16 and Ki-67 in lesions of oral lichen planus to verify the presence and kind of its immunoexpression amog the two groups of patients, asymptomatic and symptomatic, correlating the clinical and histopathological diagnosis with the immunohistochemical data in order to verify if oral lichen planus can be considered a lesion with risk of malignant transformation. MATERIAL AND METHOD: nine asymptomatic patients and 12 symptomatic of oral lichen planus. Five cases of inflammattory fibrous hyperplasia were included as control group. For immunohistochemical studies we used p16 (prediluted–BioSB/USA) and Ki-67 (clone MIB-1–DAKO/USA) by Envision Labelled techniques (DAKO). Results were annalyzed according to parameters based on Klaes et al. (2001) evaluating the immunomarked cell rates, the distribution through the epithelial layer and the immunoexpression intensity. The statistics analysis proceeded the study of relative risk between asymptomatic and symptomatic patients regarding to its cellular immunoexpression (nuclear, cytoplasmic or both), the more prevalent topography of the lesion (buccal mucosa and tongue) and clinical characteristics (atrophic and reticular types). RESULTS: the correlation between asymptomatic and symptomatic patients was statistically significant (p<0.05) when comparison was made of the distribution of p16 throug the epithelial layer by analysis its cellular imumunoexpression. The nuclear immunoexpression of p16 showed an odds ratio of 4.091. The nuclear and cytoplasmatic were 5.179. The odds ratio for cytoplasmatic expression was 8.461. The correlation between immunoexpression and topography resulted in an odds ratio of 5.130 for tongue and 14.234 for buccal mucosa. The other categories availed as percentage and intensity of the p16 immunoexpression, clinical characteristics, besides the Ki-67 results gave non significant results. CONCLUSIONS: The citoplasmatic expression results indicates that this immunoexpression must not be discarded, as suggested by some studies. The high relative risk saw in buccal mucosa rather than tongue was an unexpected result, because the localization pointed as with greater involvement in cases of malignat transformation is the tongue. The distribution was the only one that reached a statistically significant result, so further studies must be made in order to include or exclude the human papillomavirus presence in oral lichen planus lesions, since the p16 protein is currently nowadays used as an indicator of cellular abnormalities in cervical lesions, where its overexpression is related to the presence of high risk human papillomavirus, beyond study of p16 in the cases of liquenoid dysplasia.