Angesichts der nach wie vor hohen Mortalität und Morbidität des Bronchialkarzinoms ist die Entwicklung geeigneter Methoden zur früheren Diagnostik eine wichtige Notwendigkeit, um die geringe durchschnittliche 5-Jahres-Überlebensrate von 15% – 18% zu steigern. Unter diesem Gesichtspunkt wurde in der vorliegenden Arbeit das Atemkondensat von Patienten mit Bronchialkarzinom als nicht-invasiv und kostengünstig zu gewinnendes Medium auf das Vorliegen eines potentiellen Screeningmarkers – dem methylierten Tumorsuppressor-Gen p16 – untersucht. Dazu wurde ein Versuchsablauf entwickelt, bei dem trotz des geringen DNA-Gehaltes im Atemkondensat p16-Methylierungen nachgewiesen werden konnten. Die letztendlich etablierte Methode war eine methylierungsspezifische nested-PCR mit anschließendem Restriktionsverdau durch das Restriktionsenzym BstUI. Des Weiteren erfolgte die Untersuchung von in Paraffin eingebetteten Tumorpräparaten der Patienten. In der anschließenden statistischen Auswertung wurde der Einfluss von verschiedenen Faktoren wie COPD-Grad, Tumorlage, Tumorart, Nikotinabusus und stattgehabte Chemo- oder Strahlentherapie auf den Methylierungsstatus des p16-Gens analysiert.

Die Methode der Atemkondensatmessung kann als nicht-invasive Methode die Situation der tiefen Atemwege widerspiegeln und vermag Entzündungen, Exazerbationen aber auch maligne Prozesse zu identifizieren. Auch wenn sich anhand der bisherigen Untersuchungen diese vielfältigen Einsatzmöglichkeiten von Atemkondensat ergeben haben, muss diese wie jede Methode einen gewissen Standard erfüllen und vor allem reproduzierbare Ergebnisse liefern, um sich im Praxisalltag durchzusetzen. Doch zwischen den zur Verfügung stehenden Systemen bestehen zum Teil erhebliche Unterschiede. Inwieweit Ergebnisse von verschiedenen Sammelsystemen vergleichbar sind, ist dabei noch nicht vollständig geklärt. Ziel der Arbeit war es daher zwei unterschiedliche Systeme (EcoScreen und TURBO DECCS) zur Atemkondensatgewinnung anhand bereits untersuchter Parameter bei gleichen Bedingungen und Probanden zu vergleichen und daraus neue Erkenntnisse zu gewinnen. Bei unseren Untersuchungen zeigte sich eine starke Abhängigkeit der Atemkondensatbildung und der Konzentration der Bestandteile vom verwendeten Atemkondensatsystem. Allein die Kondensatmenge unterschied sich signifikant mit höheren Volumina bei den EcoScreen-Proben. Dies erlaubt im Alltag eine kürzere Untersuchungsdauer bei gleicher Ausbeute. Der Proben-pH gilt als robuster Parameter und konnte in verschiedenen Studien mit Verlauf und der Stärke entzündlichen Atemwegserkrankungen korreliert werden. In unseren Untersuchungen zeigte sich, dass die pH-Werte der Kondensatproben vom DECCS-System deutlich azidotischer im Vergleich zum EcoScreen-System waren. Eine Abgrenzung von Lungenkranken zu Lungengesunden gelang nur in den EcoScreen-Proben. Die Atemkondensatproben des DECCS-Systems lagen bezüglich des pH-Wertes für alle untersuchten Gruppen auf einem ähnlichen Niveau. Ebenso wie bei der pH-Messung konnte bei der Bestimmung von Nitrit eine signifikante Differenzierung zwischen COPD und Lungengesunden nur bei den Proben des EcoScreens beobachten werden. In allen untersuchten Gruppen wiesen die Proben des DECCS-Systems signifikant niedrigere Nitritkonzentrationen auf. Um die Entdeckung und Analyse von Biomarkern verschiedener entzündlicher und tumoröser Atemwegserkrankungen zu ermöglichen, ist eine ausreichende Proteinkonzentration in den Atemkondensatproben notwendig. Fast die Hälfte aller Proben, welche mit dem DECCS-System gesammelt wurden, enthielten kein messbares Protein, während dies beim EcoScreen nur 1 Probe betraf. Auch die Proteinkonzentration in den Protein-positiven Proben war am EcoScreen signifikant höher. Die Nutzung von DNA-Analysen ist ein wichtiger Faktor zur Früherkennung oder Nachsorge von Lungenkrebserkrankungen. In den 30 untersuchten Proben gelang in 13 EcoScreen-Proben der Nachweis von DNA-Material, während dies nur auf 2 der Proben zutraf, welche mittels DECCS-System gewonnen wurden. Diese Differenzen in den Kondensatergebnissen zwischen den Systemen scheinen ihre Ursache im unterschiedlichen Aufbau der verwendeten Systeme haben. Die in dieser Studie verwendeten Systeme unterschieden sich in ihrer Arbeitstemperatur erheblich (EcoScreen-System: -30°C und DECCS-System: -5,5°C), sodass hier ein Einfluss auf das Ergebnis zu vermuten war. Entsprechende eigene Untersuchungen zeigten eine Zunahme der Kondensatmenge in Abhängigkeit von der verwendeten Temperatur beim DECCS-System. Einen Einfluss auf die Proteinkonzentration konnte nicht nachgewiesen werden. Als weiterer wichtiger Faktor, der die Eigenschaften eines Sammelsystems bestimmt, rückt auch das verwendete Material des Sammelbehälters in den Vordergrund. Obwohl dieser Faktor in unseren Untersuchungen nicht getestet wurde, scheint das beim EcoSystem verwendete Teflon Vorteile gegen über dem Kunststoff-Tube aus Polyethylen/Polypropylen, welches beim DECCS-System genutzt wird, zu besitzen. Dieser Parameter wird auch in der Literatur entsprechend breit diskutiert. Zusammenfassend kann man sagen, dass aktuell eine Vielzahl kommerzieller Atemkondensatsysteme existieren, welche sich zum Teil erheblich in ihrem Aufbau unterscheiden. Unsere Untersuchungen legen dar, welchen entscheidenden Einfluss das verwendete Sammelsystem auf die Ergebnisse hat und warum deshalb keine einheitlichen Ergebnisse erzielt werden konnten. Diesem Aspekt muss in der Zukunft mehr Bedeutung zugemessen werden, da sonst ein Einsatz der Atemkondensatmessung im klinischen Alltag schwer möglich ist. Insgesamt ist deshalb eine Standardisierung beim Sammeln von Atemkondensat notwendig, um so den Einzug dieser nicht-invasiven Messmethode mit vielfältigem Einsatzgebiet in die klinische Praxis zu ebnen.:Abkürzungsverzeichnis Abbildungsverzeichnis Tabellenverzeichnis 1 Einleitung 1.1 Übersicht über Erkrankungen und Diagnostik in der Pneumologie 1.2 Ausgewählte Atemwegserkrankungen 1.2.1 Chronisch obstruktive Lungenerkrankung (COPD) 1.2.1.1 Pathophysiologie 1.2.1.2 Epidemiologie 1.2.1.3 Therapie- und Diagnostikansätze in der Forschung 1.2.2 Lungenkarzinom 1.2.2.1 Epidemiologie 1.2.2.2 Pathophysiologie 1.2.2.3 Prognose und Screeningmöglichkeiten 1.3 Diagnostik von Atemwegsmaterialien 1.3.1 Bronchoalveoläre Lavage (BAL) 1.3.2 Sputumdiagnostik 1.3.3 Messung des fraktionierten exhalierten Stickstoffmonoxids (FeNO-Messung) 1.3.4 Atemkondensat 1.3.4.1 Entstehung und Zusammensetzung des Atemkondensats 1.3.4.2 Einflussfaktoren bei der Atemkondensatgewinnung 1.3.4.3 EBC-Bestandteile und ihre Einsatzfähigkeit 2 Fragestellung 3 Material und Methoden 3.1 Probanden/Patienten 3.2 Atemkondensat-Systeme 3.2.1 EcoScreen 3.2.2 TURBO DECCS 3.3 Parameterbestimmung 3.3.1 Materialien 3.3.1.1 Geräte 3.3.1.2 Computersoftware 3.3.1.3 Reagenzien und Chemikalien 3.3.2 pH-Messung 3.3.3 Atemkondensatmenge und Atemminutenvolumen 3.3.4 Proteinmessung 3.3.5 Amylaseaktivität 3.3.6 Nitrit-Messung 3.3.7 Nachweis von DNA mittels Polymerase-Kettenreaktion (PCR) 3.4 Statistik 4 Ergebnisse 4.1 Amylaseaktivität 4.2 Atemkondensatmenge 4.3 pH-Messung 4.4 Proteinnachweisbarkeit 4.5 Proteinkonzentration 4.6 Nitrit-Messung 4.7 Nachweisbarkeit von DNA mittels PCR 4.8 Volumen und Proteinkonzentration bei Veränderung des DECCS-Testaufbaus 4.9 Atemminutenvolumen 5 Diskussion Zusammenfassung Literaturverzeichnis Anhang

Angesichts der nach wie vor hohen Mortalität und Morbidität des Bronchialkarzinoms ist die Entwicklung geeigneter Methoden zur früheren Diagnostik eine wichtige Notwendigkeit, um die geringe durchschnittliche 5-Jahres-Überlebensrate von 15% – 18% zu steigern. Unter diesem Gesichtspunkt wurde in der vorliegenden Arbeit das Atemkondensat von Patienten mit Bronchialkarzinom als nicht-invasiv und kostengünstig zu gewinnendes Medium auf das Vorliegen eines potentiellen Screeningmarkers – dem methylierten Tumorsuppressor-Gen p16 – untersucht. Dazu wurde ein Versuchsablauf entwickelt, bei dem trotz des geringen DNA-Gehaltes im Atemkondensat p16-Methylierungen nachgewiesen werden konnten. Die letztendlich etablierte Methode war eine methylierungsspezifische nested-PCR mit anschließendem Restriktionsverdau durch das Restriktionsenzym BstUI. Des Weiteren erfolgte die Untersuchung von in Paraffin eingebetteten Tumorpräparaten der Patienten. In der anschließenden statistischen Auswertung wurde der Einfluss von verschiedenen Faktoren wie COPD-Grad, Tumorlage, Tumorart, Nikotinabusus und stattgehabte Chemo- oder Strahlentherapie auf den Methylierungsstatus des p16-Gens analysiert.