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The role of Microsomal prostaglandin synthase-1 (mPGES-1) and Ephrin B2 in SclerodermaGhassemi Kakroodi, Parisa 03 1900 (has links)
La sclérodermie (sclérose systémique, ScS) est une maladie auto-immune du tissu conjonctif caractérisée par l’épaississement de la peau, l’apparition spontanée de lésions cicatricielles, des maladies des vaisseaux sanguins, divers degrés d’inflammation, en association avec un système immunitaire hyperactif. La pathogénèse exacte de cette maladie est inconnue et aucun traitement approprié n’est disponible. La fibrose est un élément distinctif de la maladie de ScS et est considérée résulter d’une incapacité à mettre fin de façon appropriée à la réponse normale de réparation des plaies. L’analyse histologique du stade initial de la ScS révèle une infiltration périvasculaire de cellules mononucléaires dans le derme, associée à une synthèse accrue de collagène dans les fibroblastes environnants. Ainsi, la compréhension des moyens de contrôler le stade inflammatoire de la ScS pourrait être bénéfique pour contrôler la progression de la maladie peu après son apparition. La mPGES-1 est une enzyme inductible qui agit en aval de la cyclo- oxygénase (COX) pour catalyser spécifiquement la conversion de la prostaglandine (PG) H2 en PGE2. La mPGES-1 joue un rôle clé dans l’inflammation, la douleur et l’arthrite;; toutefois, le rôle de la mPGES-1 dans les mécanismes de fibrose, spécifiquement en rapport avec la ScS humaine, est inconnu. Mon laboratoire a précédemment montré que les souris à mPGES-1 nulle sont résistantes à la fibrose cutanée induite par la bléomycine, à l’inflammation, à l’épaississement cutané, à la production de collagène et à la formation de myofibroblastes. Sur la base de ces résultats, j’ai formulé l’hypothèse que l’inhibition pharmacologique de la mPGES-1 régulera à la baisse la production de médiateurs pro-inflammatoires et pro-fibreux au cours de la maladie de ScS. Afin d’explorer le rôle de la mPGES-1 dans l’inflammation et la fibrose associées à la maladie de ScS, j’ai d’abord examiné l’expression de la mPGES-1 dans la peau normale comparativement à des biopsies de peau extraites de patients atteints de ScS. Mes résultats ont montré que la mPGES-1 est nettement élevée dans la peau de patients atteints de ScS en comparaison avec la peau humaine normale. De plus, les niveaux de PGE2 dérivés de la mPGES-1 étaient également significativement plus élevés dans les fibroblastes cutanés isolés de patients atteints de ScS comparativement aux fibroblastes isolés de témoins sains. J’ai également étudié l’effet de l’inhibition pharmacologique de la mPGES-1 sur l’expression de marqueurs pro- fibreux. Mes études ont montré que l’expression de médiateurs pro-fibreux clés (α-SMA, endothéline-1, collagène de type 1 et facteur de croissance du tissu conjonctif (FCTC)) est élevée dans les fibroblastes cutanés ScS en comparaison avec les fibroblastes cutanés normaux. Un traitement avec un inhibiteur de la mPGES-1 a eu pour effet de réduire significativement l’expression de l’α-SMA, de l’endothéline-1, du collagène de type 1 mais pas du FCTC dans les fibroblastes ScS, sans effet significatif sur les fibroblastes normaux. J’ai en outre examiné l’effet de l’inhibition de la mPGES-1 sur des cytokines pro-inflammatoires clés impliquées dans la pathologie de la ScS, incluant IL-6, IL-8 et MCP-1. L’inhibition pharmacologique de la mPGES- 1 a eu pour effet de réduire significativement les niveaux de production de cytokines pro- inflammatoires IL6, IL8 et MCP-1 dans les fibroblastes avec lésion ScS comparativement à des fibroblastes non traités. De plus, les patients atteints de ScS ont présenté des niveaux plus élevés de p-AKT, de p-FAK et de p-SMAD3 en comparaison avec les fibroblastes cutanés normaux. L’inhibiteur de la mPGES-1 a pu réguler à la baisse cette expression accrue de p-AKT et de p- FAK, mais pas de p-SMAD3, dans les fibroblastes ScS. Ces résultats ont suggéré que l’inhibition de la mPGES-1 pourrait être une méthode viable pour réduire le développement de sclérose cutanée et constituent une cible thérapeutique potentielle pour contrôler les mécanismes fibreux et inflammatoires associés à la pathophysiologie de la maladie de ScS.
L’un des autres processus critiques reliés à l’évolution de la réponse fibreuse associée à la maladie de ScS est la différenciation des fibroblastes en des cellules activées spécialisées
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appelées myofibroblastes, responsables de déclencher une signalisation adhésive excessive et le dépôt excessif de matrice extracellulaire, conduisant à la destruction de l’architecture de l’organe. Ainsi, l’identification des facteurs endogènes qui initient/ favorisent la différenciation fibroblaste-myofibroblaste peut mener à des stratégies thérapeutiques prometteuses pour contrôler l’excès de signalisation adhésive et de fibrose associé à la maladie de ScS. Des études antérieures dans le domaine de la biologie du cancer ont suggéré que l’éphrine B2, une protéine transmembranaire appartenant à la famille des éphrines, est impliquée dans la signalisation adhésive et le remodelage extracellulaire. Cependant, son rôle dans la fibrose n’a jamais été exploré. Dans la deuxième partie de mon étude, j’ai donc étudié le rôle de l’éphrine B2 dans la fibrose. Mes études montrent que l’expression de l’éphrine B2 est significativement augmentée dans la peau humaine ScS comparativement à la peau normale. Plus important encore, le traitement in vitro de fibroblastes de la peau humaine normale avec de l’éphrine B2 recombinante est capable de transformer des fibroblastes en cellules myofibroblastiques manifestant toutes les caractéristiques myofibroblastiques typiques, incluant la formation accrue de fibres de tension, des adhérences focales, l’activation accrue de la FAK, un accroissement de l’expression et de la migration de fibroblastes et de leur adhérence à la fibronectine à la fois chez les fibroblastes cutanés normaux et ScS. En outre, j’ai traité des souris avec de l’éphrine B2 recombinante et montré que ces souris ont développé une fibrose cutanée significative associée à une épaisseur dermique et à une synthèse de collagène augmentées, une teneur en hydroxyproline (teneur en collagène) accrue et un nombre accru de myofibroblastes exprimant de l’α-SMA, une activation augmentée de la FAK et de marqueurs pro-fibreux incluant le collagène de type 1 et le FCTC.
Dans l’ensemble, mes études ont identifié deux médiateurs endogènes cruciaux impliqués dans la propagation de l’inflammation et de la fibrose associées à la maladie de ScS. L’inhibition de la mPGES-1 pourrait représenter une bonne stratégie alternative pour contrer l’inflammation et la fibrose au moins durant les stades précoces de la maladie de ScS. De plus, une signalisation excessive de l’éphrine B2 favorise la signalisation adhésive et fibreuse en déclenchant la différenciation de fibroblastes en myofibroblastes par l’activation de la voie de signalisation de la FAK. Ainsi, l’inhibition d’éphrine B2 bloquera la formation de fibroblastes-myofibroblastes et régulera à la baisse la fibrose associée à la maladie de ScS. En somme, la mPGES-1 et l’éphrine B2 semblent toutes deux des cibles attrayantes pour le traitement de la ScS et des troubles fibreux qui y sont reliés. / Scleroderma (Systemic sclerosis, SSc) is an autoimmune disease of the connective tissue featuring skin thickening, spontaneous scarring, and blood vessel disease, varying degrees of inflammation, associated with an overactive immune system. The exact pathogenesis of this disease is unknown and there is no appropriate treatment available. Fibrosis is a hallmark of SSc disease and is considered to arise due to an inability to appropriately terminate the normal wound repair response. Histological analysis of the initial stage of SSc reveals perivascular infiltrates of mononuclear cells in the dermis, which is associated with increased collagen synthesis in the surrounding fibroblasts. Thus understanding how to control the inflammatory stage of SSc may be of benefit in controlling the progression of early onset disease. mPGES-1 is an inducible enzyme that acts downstream of cyclooxygenase (COX) to specifically catalyze the conversion of prostaglandin (PG) H2 to PGE2. mPGES-1 plays a key role in inflammation, pain and arthritis; however, the role of mPGES-1 in fibrotic mechanisms especially with respect to human SSc is unknown. My laboratory has previously shown that mPGES-1-null mice are resistant to bleomycin-induced skin fibrosis, inflammation, cutaneous thickening, collagen production and myofibroblast formation. Based on these results I hypothesized that pharmacological inhibition of mPGES-1 will downregulate the production of pro-inflammatory and pro-fibrotic mediators during SSc disease. To explore the role of mPGES-1 in inflammation and fibrosis associated with SSc disease, I first investigated the expression of mPGES-1 in normal skin compared to skin biopsies extracted from SSc patients. My results showed that mPGES-1 is markedly elevated in SSc skin compared to normal human skin. In addition, the levels of mPGES-1- derived PGE2 were also significantly higher in skin fibroblasts isolated from SSc patients compared to fibroblasts isolated from healthy controls. I further investigated the effect of pharmacological inhibition of mPGES-1 on the expression of pro-fibrotic markers. My studies showed the expression of key pro-fibrotic mediators (α-SMA, endothelin-1, collagen type 1 and connective tissue growth factor) are elevated in SSc skin fibroblasts compared to normal skin fibroblasts. Treatment with mPGES-1 inhibitor resulted in significant reduction in the expression of α-SMA, endothelin-1, collagen type 1 but not CTGF in SSc and normal fibroblasts. Further, I investigated the effect of mPGES-1 inhibition on key pro-inflammatory cytokines implicated in SSc pathology including IL-6, IL-8 and MCP-1. Pharmacological inhibition of mPGES-1 resulted in significant reduction in the production levels of pro-inflammatory cytokines, IL6, IL8 and MCP-1 in SSc-lesioned fibroblasts compared to untreated fibroblasts. In addition, SSc patients exhibited higher levels of p-AKT, p-FAK and p-SMAD3 compared to normal skin fibroblasts. mPGES-1 inhibitor was able to down regulate this increased expression of p-AKT, p-FAK but not p-SMAD3 in SSc fibroblasts. These results suggested that inhibition of mPGES-1 may be a viable method to alleviate the development of cutaneous sclerosis and is a potential therapeutic target to control fibrotic and inflammatory mechanisms associated with the pathophysiology of SSc disease.
One of the other critical processes associated with the evolution of fibrotic response associated with SSc disease is the differentiation of fibroblasts into specialized activated cells called myofibroblasts responsible for triggering excessive adhesive signaling and deposition of excessive extracellular matrix (ECM) leading to the destruction of organ architecture. Thus identifying endogenous factors which initiate/promote fibroblast-myofibroblast differentiation can lead to promising therapeutic strategies to control excessive adhesive signaling and fibrosis associated with SSc disease. Previous studies in cancer biology have suggested that ephrin B2, a transmembrane protein belonging to the family of ephrins, is involved in adhesive signaling and extracellular remodeling. However its role in fibrosis has never been explored. Therefore, in second part of my study, I investigated the role of ephrin B2 in fibrosis. My studies show ephrin
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B2 expression is significantly enhanced in human SSc skin versus normal skin. Most importantly, in vitro treatment of normal human skin fibroblasts with recombinant ephrin B2 is able to transform fibroblasts into myofibroblastic cells exhibiting all typical myofibroblastic- characteristics including increased stress fibre formation, focal adhesions, increased activation of FAK, increased expression of and enhanced fibroblast migration and adhesion to fibronectin in both normal and SSc skin fibroblasts. Further, I treated mice with recombinant ephrin B2 and showed that these mice developed significant skin fibrosis associated with enhanced dermal thickness and collagen synthesis, increased hydroxyproline content (collagen content) and increased number of α-SMA-expressing myofibroblasts, enhanced activation of FAK and pro- fibrotic markers including type-I collagen and CTGF.
Overall, my studies have identified two crucial endogenous mediators involved in propagating inflammation and fibrosis associated with SSc disease. mPGES-1 inhibition may present a good alternative strategy to counteract inflammation and fibrosis at least during early stages of SSc disease. Further, excessive ephrin B2 signaling promotes adhesive and fibrotic signaling by triggering fibroblast to myofibroblast differentiation via activation of the FAK signaling pathway. Thus, inhibition of ephrin B2 will block fibroblast-myofibroblast formation and downregulate fibrosis associated with SSc disease. Overall, both mPGES-1 and ephrin B2 seems to be attractive targets for treatment of SSc and related fibrotic disorders.
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La fibrose en deux parties : de la paillasse à la sourisLaplante, Patrick 03 1900 (has links)
L’apoptose des cellules endothéliales (CE) représente un évènement initial dans le développement de plusieurs pathologies fibrotiques telles que le rejet chronique d’allogreffe et la sclérose systémique. Nous avons démontré que les médiateurs issus des CE apoptotiques entraîne la différenciation myofibroblastique et la résistance à l’apoptose, deux mécanismes centraux à la fibrogénèse. L’activation de PI3K (phospatidylinositol-3 kinase) caractérise ces deux mécanismes. Un fragment C-terminal du perlécan (LG3) produit par les CE apoptotiques inhibe l’apoptose des fibroblastes. Les objectifs de ce travail étaient de : 1. définir les récepteurs et la signalisation impliqués dans la réponse anti-apoptotique et 2. caractériser les médiateurs fibrogéniques responsables de la différenciation myofibroblastique.
En ce qui a trait à la réponse anti-apoptotique, l’inhibition des intégrines 21 ou des kinases de la famille Src (SFK) chez les fibroblastes prévient la résistance à l’apoptose et la phosphorylation d’Akt normalement induites par le milieu conditionné par des CE apoptotiques (SSC) ou le LG3. Ces résultats suggèrent que le LG3 produit par les CE apoptotiques initie un état de résistance à l’apoptose chez les fibroblastes par des voies α2β1integrines/SFK/PI3K dépendantes. Le LG3 n’induit cependant pas la différenciation myofibroblastique. Nous avons donc caractérisé le milieu SSC de façon à identifier les médiateurs responsables de la différenciation myofibroblastique.
Les milieux conditionnés par des CE apoptotiques et non-apoptotiques (respectivement SSC et SSC-ZVAD) ont été analysés comparativement par chromatographie liquide bi-dimensionnelle, immunobuvardage et spectrométrie de masse. Le connective tissue growth factor (CTGF) est le seul facteur fibrogénique connu augmenté dans le milieu SSC. L’inhibition de la caspase-3 chez les CE prévient la relâche de CTGF. Au niveau du fibroblaste, l’inhibition de SFK ou de Pyk2 (proline-rich tyrosine kinase-2) prévient la différenciation myofibroblastique induite par le SSC ou le CTGF in vitro. L’anticorps neutralisant contre le TGF- (Transforming growth factor beta) n’est pas en mesure de bloquer la différenciation myofibroblastique induite par le SSC ou le CTGF. Des injections quotidiennes sous-cutanées de SSC chez la souris C3H pour 3 semaines entraîne une augmentation de l’épaisseur de la peau et des niveaux protéiques d’SMA, de vimentine et de collagène I. Cette réponse fibrogénique est réduite chez les souris qui ont reçu le SSC-ZVAD ou le SSC immunodéplété de son CTGF.
Ces résultats apportent de nouvelles issues mécanistiques au niveau de la réponse fibrogénique activée par la mort des CE. L’activation des caspases chez les CE apoptotiques entraîne la production de LG3 et de CTGF qui, à leur tour, activent des voies de signalisation pro-fibrotiques SFK/PI3K dépendantes chez les fibroblastes, et ce indépendamment du TGF-. / Apoptosis of endothelial cells (EC) is an early event in various fibrotic diseases including chronic allograft vasculopathy and systemic sclerosis. We showed previously that mediators released by apoptotic EC activate myofibroblast differentiation and resistance to apoptosis, two mechanisms pivotal to fibrogenesis. PI3K (phospatidylinositol-3 kinase) activation was found to be central to these two mechanisms. A C-terminal fragment of perlecan (LG3) produced by apoptotic EC was found to inhibit apoptosis of fibroblasts. The aims of the present project were : 1. to define the receptors and pathways implicated in this anti-apoptotic response and 2. to characterize the fibrogenic mediators implicated in myofibroblast differentiation.
Concerning the anti-apoptotic response, the inhibition of 21 integrin activity in fibroblasts exposed to either medium conditioned by apoptotic EC (SSC) or LG3 prevented resistance to apoptosis and was associated with decreased levels of Akt phosphorylation. Neutralizing Src family kinases (SFK) activity in fibroblasts produced the same effects. These results suggest that LG3 produced by apoptotic EC initiate a state of resistance to apoptosis in fibroblasts via an α2β1integrin/SFK/PI3K dependent pathway. LG3 did not induce myofibroblast differentiation. We went on to identify which mediators present in SSC are implicated in myofibroblast differentiation.
Media conditioned by apoptotic and non-apoptotic EC (respectively SSC and SSC-ZVAD) were analyzed comparatively by 2-dimension liquid chromatography, western blotting and mass spectrometry. Connective tissue growth factor (CTGF) was the only known fibrogenic factor increased in SSC. Caspase-3 silencing of EC demonstrated that CTGF is released by apoptotic EC downstream of caspase-3 activation. In fibroblasts, blocking the activation of SFK or silencing the proline-rich tyrosine kinase 2 (Pyk2) blocked myofibroblast differentiation triggered by either SSC or recombinant CTGF in vitro. Exposure to a pan-transforming growth factor (TGF-β) neutralizing antibody failed to attenuate myofibroblast differentiation in fibroblasts exposed to either SSC or CTGF. Subcutaneous injection of mouse SSC to C3H mice daily for three weeks led to increased skin thickness, increased protein levels of αSMA, vimentin and collagen I. This fibrogenic response was blunted in mice injected with either SSC-ZVAD or SSC immunodepleted of CTGF.
These results bring new mechanistic insights into the fibrogenic pathways activated by EC death. Caspase activation in apoptotic EC triggers the production of LG3 and CTGF which in turn activate SFK/PI3K dependant pathways in fibroblasts thus activating a TGF-β-independent fibrogenic response.
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Remodelage neuronal de la cicatrice cardiaque suite à un infarctus du myocardeEl-Helou, Viviane 09 1900 (has links)
RÉSUMÉ GÉNÉRAL
Suite à un infarctus du myocarde, la formation d’une cicatrice, nommée fibrose de réparation, représente un processus adaptatif et essentiel empêchant la rupture du myocarde. La cicatrice est constituée de myofibroblastes, de cellules vasculaires, de fibres sympathiques ainsi que de cellules souches neuronales cardiaques exprimant la nestine. Une perturbation au niveau de ces constituants cellulaires résulte en une formation maladaptative de la cicatrice et éventuellement, une diminution de la fonction cardiaque. La compréhension des événements cellulaires ainsi que les mécanismes sous-jacents participant à cette fibrose est alors d’une importance primordiale. Cette thèse est axée sur l’identification du rôle du système sympathique et des cellules souches neuronales cardiaques exprimant la nestine dans la formation de la cicatrice ainsi que leur interaction potentielle. Nos travaux examinent l’hypothèse que les cellules souches neuronales exprimant la nestine sont endogènes au cœur et que suite à un dommage ischémique, elles contribuent à la réponse angiogénique et à la réinnervation sympathique du tissu lésé.
Les cellules souches neuronales exprimant la nestine sont retrouvées dans les cœurs de différentes espèces incluant le cœur infarci humain. Elles sont résidentes dans le cœur, proviennent de la crête neurale lors du développement et sont intercalées entre les cardiomyocytes n’exprimant pas la nestine. Suite à leur isolation de cœurs infarcis de rats, les cellules souches neuronales cardiaques prolifèrent sous forme de neurosphères et, dans des conditions appropriées in vitro, se différencient en neurones exprimant le neurofilament-M. Suite à un infarctus du myocarde, les niveaux de l’ARNm de nestine sont significativement augmentés au niveau de la région infarcie et non-infarcie. Nos résultats suggèrent que cette augmentation de l’expression de nestine dans la cicatrice reflète en partie la migration des cellules souches neuronales cardiaques exprimant la nestine de la région non-infarcie vers la région infarcie. Lors de la fibrose de réparation, ces cellules représentent un substrat cellulaire pour la formation de nouveaux vaisseaux et contribuent aussi à la croissance des fibres sympathiques dans la région infarcie.
Finalement, nous démontrons que la formation de la cicatrice est associée à une innervation sympathique de la région infarcie et péri-infarcie. De plus, les fibres sympathiques présentes dans la région infarcie sont observées à proximité de vaisseaux de petits calibres. Ces données suggèrent indirectement que l’innervation de la cicatrice par les fibres sympathiques peut jouer un rôle dans la réponse angiogénique suite à un infarctus du myocarde. Suite à l’administration du corticostéroïde dexaméthasone, nous détectons un amincissement de la cicatrice, associé à une réduction significative des fibres sympathiques exprimant le neurofilament-M dans la région infarcie et péri-infarcie. La diminution de la densité de ces fibres par le dexaméthasone peut être reliée à une diminution de la prolifération des myofibroblastes et de la production de l’ARNm du facteur neurotrophique nerve growth factor. / GENERAL ABSTRACT
Following myocardial infarction, scar formation represents an adaptive response required to heal the damaged myocardium and prevent cardiac rupture. Infarct healing requires the coordinated action of scar myofibroblasts, angiogenic cells, sympathetic fibres and nestin positive cardiac neural stem cells. A perturbation of one or more of the aforementioned events could lead to inadequate scar healing and further worsening of ventricular function. A better understanding of the cellular events and the underlying mechanisms involved in scar formation is of a primordial importance. The focus of the following studies consists of elucidating the role of the sympathetic system and cardiac neural stem cells during scar healing and their potential interaction. We tested the hypothesis that nestin positive neural stem cells are endogenous to the heart, contribute to angiogenesis and sympathetic innervation of the infarcted myocardium following ischemic injury.
Nestin positive cardiac neural stem cells are found in a number of species including the infarcted human heart. Nestin positive cardiac neural stem cells represent a resident population in the heart, are derived from the neural crest and detected intercalated between nestin negative cardiac myocytes. Following their isolation from the infarcted rat heart, neural stem cells proliferate as a neurosphere and under appropriate in vitro conditions differentiate to a neurofilament-M immunoreactive neuron. Following myocardial infarction, nestin mRNA levels are significantly elevated in the viable left ventricle and infarct region. Our data further suggests that the increased expression of nestin in the infarct region reflects in part the migration of these neural stem cells from the viable myocardium. During cardiac wound healing, neural stem cells may represent a novel substrate for de novo blood vessel formation and further contribute to sympathetic fibre growth and innervation of the infarct region.
Lastly, we demonstrate that scar formation and healing is associated with sympathetic fibre sprouting of the peri-infarct/infarct region. In addition, sympathetic fibres in the infarct region were detected in close proximity to small calibre blood vessels. These latter data indirectly suggest that innervating sympathetic fibres may play a role in angiogenesis during cardiac wound healing. Following the administration of the corticosteroid dexamethasone inadequate scar healing was observed and associated with a significant reduction of neurofilament-M immunoreactive fibres in the peri-infarct/infarct region. The loss of sympathetic fibre sprouting in the scar may be related to a dexamethasone-mediated suppression of myofibroblast growth and the concomitant reduction of nerve growth factor mRNA expression.
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The role of Microsomal prostaglandin synthase-1 (mPGES-1) and Ephrin B2 in SclerodermaGhassemi Kakroodi, Parisa 03 1900 (has links)
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