No presente estudo três concentrações de N-acetil-l-cisteina (NAC) foram avaliadas no diluente equino resfriado a 5°C através da motilidade do sêmen, integridade da cromatina espermática e choque hiposmótico sobre o ejaculado em diluente Kenney na proporção 1:2 com 50% de plasma seminal. O ejaculado de nove garanhões diluído na proporção 1:2 em meio Kenney foi dividido em 4 partes iguais e suplementado com 5,0, 2,5 e 0,5mM de NAC e um grupo não suplementado (0,0mM). As avaliações foram realizadas a fresco (0h), 24 e 48h de resfriamento. A análise de motilidade nos dois experimentos foi avaliada até às 24 horas. No experimento 2, a adição de 0,5 e 5,0mM de NAC resultou em áreas de dispersão da cromatina espermática similares (59,7 e 55,5μM2, respectivamente). Entretanto, a área de dispersão da cromatina no grupo não suplementado (65,3μM2) e com 2,5mM de NAC (52,8μM2) apresentou diferença (P<0,05). O percentual de células com membrana plasmática funcional foi similar entre o grupo não suplementado e o grupo suplementado com 0,5mM de NAC (39,7 e 39,8%, respectivamente), porém superior a NAC 2,5mM (34,5%) e 5,0mM (34,2%). A motilidade progressiva dos ejaculados suplementados com NAC foram similares entre si e somente o grupo NAC 0,5mM (35,2%) apresentou similaridade de células móveis com o grupo não suplementado (36,2%). Os maiores danos à cromatina espermática no sêmen equino diluído com 50% de plasma seminal mantido resfriado a 5°C ocorrem a partir de 24h de resfriamento. A adição de 2,5 e 5,0mM de NAC comprometem a motilidade e a funcionalidade de membrana espermática equina, mas não causa efeito deletério sobre a integridade do DNA. / In this study, three concentrations of N-acetyl- l-cysteine (NAC) were evaluated by sperm motility, membrane functionality (hypo-osmotic test), and sperm chromatin integrity. the hypo-osmotic test showed only 32.4% (P <0.05) of the cells having a functional membrane 12h into the cooling process, while the fresh semen (0h) was 53.5%. The percentage of motile cells decreased within 12h of cooling from 38.9 to 19.7%, with no difference between 12 and 24h of cooling. The tests of sperm chromatin dispersion and hypo-osmotic shock revealed similarities between the periods of cooling at 24 to 48h. In Experiment 2, the nine stallion ejaculates were divided into 4 equal parts, diluted in half with Kenney milk powder supplemented with 5.0, 2.5 and 0.5mM NAC and a group not supplemented (0.0mM). The evaluations were made fresh (0h), 24 and 48h after cooling. The analysis of motility was assessed in all experiments up to 24 hours. In experiment 2, the addition of 0.5 to 5.0mM NAC resulted in areas of similar sperm chromatin dispersion (59.7 and 55.5μM2, respectively). However, the area of the chromatin dispersion between non-supplemented group=0.0mM (65.3μM2) and 2.5mM NAC (52.8μM2) differ (P <0.05). The percentage of cells with plasma membrane function were similar between the supplemented with 0.5mM NAC and non-supplemented (0.0mM) groups with (39.7 and 39.8%, respectively), but higher than 2.5mM (34.5%) and 5.0mM (34.2%). Progressive motility of ejaculates supplemented with NAC were similar, but only the group with 0.5mM NAC which resulted in 35.2% of mobile cells showed similarities with the non-supplemented group (36.2%). The greatest damage to sperm chromatin in equine semen diluted with 50% seminal plasma kept cooled to 5°C was due to 24h cooling. The addition of 2.5 and 5.0mM NAC inhibits the mobility and functionality of the equine sperm membrane, but does not cause a deleterious effect on the integrity of the DNA.

No presente estudo três concentrações de N-acetil-l-cisteina (NAC) foram avaliadas no diluente equino resfriado a 5°C através da motilidade do sêmen, integridade da cromatina espermática e choque hiposmótico sobre o ejaculado em diluente Kenney na proporção 1:2 com 50% de plasma seminal. O ejaculado de nove garanhões diluído na proporção 1:2 em meio Kenney foi dividido em 4 partes iguais e suplementado com 5,0, 2,5 e 0,5mM de NAC e um grupo não suplementado (0,0mM). As avaliações foram realizadas a fresco (0h), 24 e 48h de resfriamento. A análise de motilidade nos dois experimentos foi avaliada até às 24 horas. No experimento 2, a adição de 0,5 e 5,0mM de NAC resultou em áreas de dispersão da cromatina espermática similares (59,7 e 55,5μM2, respectivamente). Entretanto, a área de dispersão da cromatina no grupo não suplementado (65,3μM2) e com 2,5mM de NAC (52,8μM2) apresentou diferença (P<0,05). O percentual de células com membrana plasmática funcional foi similar entre o grupo não suplementado e o grupo suplementado com 0,5mM de NAC (39,7 e 39,8%, respectivamente), porém superior a NAC 2,5mM (34,5%) e 5,0mM (34,2%). A motilidade progressiva dos ejaculados suplementados com NAC foram similares entre si e somente o grupo NAC 0,5mM (35,2%) apresentou similaridade de células móveis com o grupo não suplementado (36,2%). Os maiores danos à cromatina espermática no sêmen equino diluído com 50% de plasma seminal mantido resfriado a 5°C ocorrem a partir de 24h de resfriamento. A adição de 2,5 e 5,0mM de NAC comprometem a motilidade e a funcionalidade de membrana espermática equina, mas não causa efeito deletério sobre a integridade do DNA. / In this study, three concentrations of N-acetyl- l-cysteine (NAC) were evaluated by sperm motility, membrane functionality (hypo-osmotic test), and sperm chromatin integrity. the hypo-osmotic test showed only 32.4% (P <0.05) of the cells having a functional membrane 12h into the cooling process, while the fresh semen (0h) was 53.5%. The percentage of motile cells decreased within 12h of cooling from 38.9 to 19.7%, with no difference between 12 and 24h of cooling. The tests of sperm chromatin dispersion and hypo-osmotic shock revealed similarities between the periods of cooling at 24 to 48h. In Experiment 2, the nine stallion ejaculates were divided into 4 equal parts, diluted in half with Kenney milk powder supplemented with 5.0, 2.5 and 0.5mM NAC and a group not supplemented (0.0mM). The evaluations were made fresh (0h), 24 and 48h after cooling. The analysis of motility was assessed in all experiments up to 24 hours. In experiment 2, the addition of 0.5 to 5.0mM NAC resulted in areas of similar sperm chromatin dispersion (59.7 and 55.5μM2, respectively). However, the area of the chromatin dispersion between non-supplemented group=0.0mM (65.3μM2) and 2.5mM NAC (52.8μM2) differ (P <0.05). The percentage of cells with plasma membrane function were similar between the supplemented with 0.5mM NAC and non-supplemented (0.0mM) groups with (39.7 and 39.8%, respectively), but higher than 2.5mM (34.5%) and 5.0mM (34.2%). Progressive motility of ejaculates supplemented with NAC were similar, but only the group with 0.5mM NAC which resulted in 35.2% of mobile cells showed similarities with the non-supplemented group (36.2%). The greatest damage to sperm chromatin in equine semen diluted with 50% seminal plasma kept cooled to 5°C was due to 24h cooling. The addition of 2.5 and 5.0mM NAC inhibits the mobility and functionality of the equine sperm membrane, but does not cause a deleterious effect on the integrity of the DNA.

Orientadora: Profa. Dra. Cristiane Otero Reis Salum / Dissertação (mestrado) - Universidade Federal do ABC, Programa de Pós-Graduação em Neurociência e Cognição, 2016. / O fortalecimento da hipótese de neurodesenvolvimento deficiente na esquizofrenia tem levado à utilização de modelos animais baseados em intervenções nesta fase. Um destes é o modelo que consiste na injeção do antimitótico acetato de metilazoximetanol (MAM) no décimo sétimo dia de gestação de ratas Wistar. Os filhotes destas ratas apresentam na fase adulta uma série de prejuízos comportamentais e neuroquímicos, tais como déficits no filtro sensório-motor, redução de interação social e hiperresponsividade a psicoestimulantes, evidências estas que se assemelham a alguns sintomas da esquizofrenia. Estudos apontam para uma redução do antioxidante endógeno glutationa (GSH) no líquido cefalorraquidiano de pacientes esquizofrênicos, dando margem para formação de hipóteses acerca do envolvimento do estresse oxidativo na fisiopatologia da esquizofrenia. Resultados recentes mostraram que o tratamento com um inibidor da sintase de óxido nítrico (NO) foi capaz de reverter alguns destes déficits comportamentais no modelo MAM. Considerando que o NAcetil- Cisteína (NAC) é um precursor do GSH, também conhecido por sua habilidade de sequestrar NO, o presente estudo visou avaliar se o tratamento com NAC de forma aguda ou crônica é capaz de atenuar ou abolir déficits comportamentais gerados pelo MAM e se tal efeito pode ser revertido pelo precursor do NO, a L-arginina. Dezesseis ratas grávidas foram tratadas com uma injeção i.p. de MAM (25 mg/kg) ou salina (grupo controle) no 17º dia de gestação. Na fase adulta, os filhotes machos receberam tratamento agudo ou crônico com NAC e foram submetidos aos testes comportamentais de inibição pré-pulso (IPP), interação social e hiperlocomoção induzida pelo psicotomimético MK-801, que avaliam respectivamente, o filtro sensório-motor, o comportamento social e a sensibilidade a um antagonista de NMDA. No experimento1, cada rato recebeu uma injeção i.p. de NAC (150, 250 ou 500 mg/kg) ou salina, uma hora antes dos testes comportamentais. No experimento 2, cada rato recebeu um tratamento crônico por 15 dias com NAC (250 mg/kg) ou salina e, nos últimos 5 dias, receberam também injeção i.p. de L-arginina ou salina diariamente, sendo submetidos aos mesmos testes comportamentais um dia após a última injeção. Os resultados indicaram que a dose de NAC mais eficaz em reduzir significativamente os déficits comportamentais observados em filhotes machos MAM foi a de 250 mg/kg. O tratamento crônico com NAC nesta dose em machos MAM foi capaz de reduzir a hiperlocomoção induzida por MK-801, aumentar a interação social e reduzir a resposta de sobressalto no teste de IPP. O tratamento com L-arginina reverteu os efeitos do NAC, aumentando, portanto, os déficits comportamentais nos animais MAM. Os resultados indicam que o tratamento com NAC, tanto na forma aguda quanto crônica, foi eficaz em reduzir comportamentos em ratos MAM associados aos sintomas negativos, positivos e déficits cognitivos da esquizofrenia. Estes efeitos parecem estar diretamente ligados ao mecanismo de ação do NAC como sequestrador do NO. Resultados sugerem que o NAC pode apresentar efeitos do tipo antipsicótico que devem ser investigados com ensaios clínicos futuros. / The strengthening of deficient neurodevelopment hypothesis in schizophrenia has led to the use of animal models based on interventions at this stage. One of these is the model that consists on the injection of antimitotic metilazoximetanol acetate (MAM) at the seventeenth day of gestation in Wistar rats. The puppies of these rats present in adulthood a variety of behavioral and neurochemical alterations, such as deficits in sensorimotor filter, reduced social interaction and hyperresponsiveness to psychostimulants, which are similar to some symptoms of schizophrenia. Evidences point to a reduction in endogenous antioxidant glutathione (GSH) in the cerebrospinal fluid of schizophrenic patients, giving rise to the hypotheses about the involvement of oxidative stress in the pathophysiology of schizophrenia. Recent results have shown that treatment with a nitric oxide synthase inhibitor (L-Noarg) was able to reverse some of these behavioral deficits in MAM model. Considering that N-Acetyl-L-Cysteine (NAC) is a precursor of GSH, also known for its ability of scavenging NO, this study aimed to evaluate whether acute or chronic treatment with NAC is able to reduce or abolish behavioral deficits observed in MAM model and whether this effect can be reversed by the NO precursor, L-arginine. Sixteen pregnant rats were treated with an i.p injection of MAM (25 mg/kg) or saline (control group) on the 17th day of gestation. In adulthood, the male litters received acute or chronic treatment with NAC and were exposed to behavioral tests of pre-pulse inhibition (PPI), social interaction and hyperlocomotion induced by psychotomimetic MK-801, which assess respectively the sensorimotor filter, social behavior and sensitivity to an NMDA antagonist. In experiment 1, each rat received an i.p injection of NAC (150, 250 or 500 mg/kg) or saline one hour prior to behavioral testing. In experiment 2, each rat received a chronic treatment for 15 days with NAC (250 mg/kg) or saline and for the last five days, also received an i.p injection of L-arginine or saline daily and they were subjected to the same behavioral tests one day after the last injection. Results indicated that 250 mg/kg was the most effective dose of NAC, which significantly reduced the behavioral deficits observed in MAM male offspring. Chronic treatment with NAC in this dose also reduced the hyperlocomotion induced by MK-801, increased social interaction and reduced startle response in the IPP test. Treatment with L-arginine reversed the effects of NAC, increasing, therefore, the MAM behavioral deficits in animals. Results indicate that NAC acute and chronic treatments were effective in reducing behavior deficits in MAM rats associated with negative and positive symptoms and cognitive deficits of schizophrenia. These effects appear to be directly linked to the NAC mechanism of action as an NO scavenger and suggest that NAC can provide antipsychotic-like effects that should be investigated with further clinical trials.

No presente estudo três concentrações de N-acetil-l-cisteina (NAC) foram avaliadas no diluente equino resfriado a 5°C através da motilidade do sêmen, integridade da cromatina espermática e choque hiposmótico sobre o ejaculado em diluente Kenney na proporção 1:2 com 50% de plasma seminal. O ejaculado de nove garanhões diluído na proporção 1:2 em meio Kenney foi dividido em 4 partes iguais e suplementado com 5,0, 2,5 e 0,5mM de NAC e um grupo não suplementado (0,0mM). As avaliações foram realizadas a fresco (0h), 24 e 48h de resfriamento. A análise de motilidade nos dois experimentos foi avaliada até às 24 horas. No experimento 2, a adição de 0,5 e 5,0mM de NAC resultou em áreas de dispersão da cromatina espermática similares (59,7 e 55,5μM2, respectivamente). Entretanto, a área de dispersão da cromatina no grupo não suplementado (65,3μM2) e com 2,5mM de NAC (52,8μM2) apresentou diferença (P<0,05). O percentual de células com membrana plasmática funcional foi similar entre o grupo não suplementado e o grupo suplementado com 0,5mM de NAC (39,7 e 39,8%, respectivamente), porém superior a NAC 2,5mM (34,5%) e 5,0mM (34,2%). A motilidade progressiva dos ejaculados suplementados com NAC foram similares entre si e somente o grupo NAC 0,5mM (35,2%) apresentou similaridade de células móveis com o grupo não suplementado (36,2%). Os maiores danos à cromatina espermática no sêmen equino diluído com 50% de plasma seminal mantido resfriado a 5°C ocorrem a partir de 24h de resfriamento. A adição de 2,5 e 5,0mM de NAC comprometem a motilidade e a funcionalidade de membrana espermática equina, mas não causa efeito deletério sobre a integridade do DNA. / In this study, three concentrations of N-acetyl- l-cysteine (NAC) were evaluated by sperm motility, membrane functionality (hypo-osmotic test), and sperm chromatin integrity. the hypo-osmotic test showed only 32.4% (P <0.05) of the cells having a functional membrane 12h into the cooling process, while the fresh semen (0h) was 53.5%. The percentage of motile cells decreased within 12h of cooling from 38.9 to 19.7%, with no difference between 12 and 24h of cooling. The tests of sperm chromatin dispersion and hypo-osmotic shock revealed similarities between the periods of cooling at 24 to 48h. In Experiment 2, the nine stallion ejaculates were divided into 4 equal parts, diluted in half with Kenney milk powder supplemented with 5.0, 2.5 and 0.5mM NAC and a group not supplemented (0.0mM). The evaluations were made fresh (0h), 24 and 48h after cooling. The analysis of motility was assessed in all experiments up to 24 hours. In experiment 2, the addition of 0.5 to 5.0mM NAC resulted in areas of similar sperm chromatin dispersion (59.7 and 55.5μM2, respectively). However, the area of the chromatin dispersion between non-supplemented group=0.0mM (65.3μM2) and 2.5mM NAC (52.8μM2) differ (P <0.05). The percentage of cells with plasma membrane function were similar between the supplemented with 0.5mM NAC and non-supplemented (0.0mM) groups with (39.7 and 39.8%, respectively), but higher than 2.5mM (34.5%) and 5.0mM (34.2%). Progressive motility of ejaculates supplemented with NAC were similar, but only the group with 0.5mM NAC which resulted in 35.2% of mobile cells showed similarities with the non-supplemented group (36.2%). The greatest damage to sperm chromatin in equine semen diluted with 50% seminal plasma kept cooled to 5°C was due to 24h cooling. The addition of 2.5 and 5.0mM NAC inhibits the mobility and functionality of the equine sperm membrane, but does not cause a deleterious effect on the integrity of the DNA.

Este estudo teve como objetivo avaliar o efeito da N-acetil-L-cisteína (NAC), adicionada ao diluente composto de leite em pó desnatado, sobre a viabilidade espermática e o estresse oxidativo do sêmen equino resfriado a 5°C. Ejaculados de 8 pôneis da raça Brasileira foram coletados em triplicata resultando em 24 ejaculados. O sêmen foi distribuído em 4 grupos: Equidil® + 0,00 mM (controle), 0,5 mM, 1,0 mM ou 2,5 mM de NAC. As amostras foram armazenadas em tubos de 15mL e mantidas em caixas de transporte de sêmen BotuFLEX® (Botupharma, Botucatu-SP, Brasil). Parâmetros como motilidade total (MT), motilidade progressiva (MP), vigor, pH, resposta ao teste hiposmótico (HOST) e atividade mitocondrial (MTT) foram avaliados nas 24 e 48 h, bem como no sêmen fresco, após a diluição. O vigor, MT e MP foram também avaliados após teste de termorresistência (TTR), na ausência e presença de peróxido. A MT, a MP, o vigor espermático e a MTT foram similares (P > 0.05) entre as concentrações de NAC, nas 24 e 48 h. A resposta ao HOST foi semelhante entre as concentrações de NAC (P > 0,05) nas 24 h de resfriamento, porém nas 48 h ocorreu diminuição da funcionalidade da membrana no grupo NAC 2,5 mM em comparação ao grupo EQUIDIL, sem adição de NAC. A MT, a MP e vigor, das amostras resfriadas por 24 h e submetidas ao TTR, diferiu entre sem e com peróxido (P < 0,05) nos grupos Equidil, 0,5 mM e 1,0 mM, mas foi similar na concentração de 2,5 mM de NAC. Quando o sêmen foi resfriado por 48 h, houve diferença no vigor e MT entre amostras com e sem peróxido (P < 0,05), em todos os grupos testados, mas a MP foi similar entre amostras com e sem peróxido, na concentração 2,5 mM. O pH do diluente Equidil® foi o maior e os grupos Equidil + 0,5 mM e 1,0 mM tiveram valores intermediários, enquanto a concentração de 2,5 mM de NAC gerou valores mais baixos, nos três momentos avaliados (P < 0,05). Não houve variação significativa de pH entre os momentos 0 e 24 h (P= 0,7075) e entre 0 e 48 h (P= 0,4617), em todos os grupos testados. As concentrações de NAC testadas não melhoraram a motilidade, integridade da membrana plasmática, atividade mitocondrial e resposta ao HOST de espermatozoides equinos resfriados a 5°C e armazenados por 48 h. Após TTR, as concentrações de NAC testadas não evitaram a diminuição da motilidade e vigor espermático, na presença de peróxido. / The aim of this study was to evaluate the effect of N-acetyl-L-cysteine (NAC) based on skim milk powder extender on sperm viability and oxidative stress of equine semen cooled to 5°C. Ejaculate of 8 ponies of the Brazilian breed were collected in triplicate, resulting in 24 ejaculates, distributed in 4 groups: Equidil® extender + 0.00mm (control), 0.5mM, 1.0mM and 2.5mM of NAC with the semen samples were The samples were stored in 15mL tubes and kept in BotuFLEX® semen transport boxes (Botupharm, Botucatu/SP/Brazil). Parameters, such as motility, vigor, pH, osmolarity, HOST, and MTT were evaluated at 24 and 48 h of cooling also in fresh semen. Vigor, total (TM) and progressive motility (PM) were also evaluated after thermoresistance test (TTR), in the absence and presence of peroxide. TM, PM, sperm vigor and MTT were similar (P > 0.05) between NAC concentrations at 24 and 48 h. The response to HOST was similar between NAC concentrations (P > 0.05) at 24 h cooling, but at 48 h there was a decreased in membrane functionality in 2.5mM NAC group compared to the EQUIDIL group. TM, PM, and vigor of the samples cooled by 24 h and submitted to TTR differed between without and with peroxide (P< 0.05) in the EQUIDIL, 0.5mM and 1.0mM groups, but was similar in 2.5mM NAC. After cooling for 48 h, there was difference in vigor and TM between samples with and without peroxide (P < 0.05) in all groups tested, but the PM was similar between samples with and without peroxide at concentration 2.5mM of NAC. The pH of the EQUIDIL extender was higher and the EQUIDIL + 0.5mM and 1.0mM groups had intermediate values, while the 2.5mM NAC concentration generated lower values in the three evaluated periods (P < 0.05). There was no significant variation of pH between 0 and 24 h (P=0.7075) and between 0 and 48 h (P=0.4617) in all groups tested. The concentrations of NAC tested did not improve motility, plasma membrane integrity, mitochondrial activity and response to HOST equine spermatozoa cooled to 5°C and stored for 48 h. After TTR, the concentrations of NAC tested did not prevent the decrease of motility and sperm vigor in the presence of peroxide.

Este estudo teve como objetivo avaliar o efeito da N-acetil-L-cisteína (NAC), adicionada ao diluente composto de leite em pó desnatado, sobre a viabilidade espermática e o estresse oxidativo do sêmen equino resfriado a 5°C. Ejaculados de 8 pôneis da raça Brasileira foram coletados em triplicata resultando em 24 ejaculados. O sêmen foi distribuído em 4 grupos: Equidil® + 0,00 mM (controle), 0,5 mM, 1,0 mM ou 2,5 mM de NAC. As amostras foram armazenadas em tubos de 15mL e mantidas em caixas de transporte de sêmen BotuFLEX® (Botupharma, Botucatu-SP, Brasil). Parâmetros como motilidade total (MT), motilidade progressiva (MP), vigor, pH, resposta ao teste hiposmótico (HOST) e atividade mitocondrial (MTT) foram avaliados nas 24 e 48 h, bem como no sêmen fresco, após a diluição. O vigor, MT e MP foram também avaliados após teste de termorresistência (TTR), na ausência e presença de peróxido. A MT, a MP, o vigor espermático e a MTT foram similares (P > 0.05) entre as concentrações de NAC, nas 24 e 48 h. A resposta ao HOST foi semelhante entre as concentrações de NAC (P > 0,05) nas 24 h de resfriamento, porém nas 48 h ocorreu diminuição da funcionalidade da membrana no grupo NAC 2,5 mM em comparação ao grupo EQUIDIL, sem adição de NAC. A MT, a MP e vigor, das amostras resfriadas por 24 h e submetidas ao TTR, diferiu entre sem e com peróxido (P < 0,05) nos grupos Equidil, 0,5 mM e 1,0 mM, mas foi similar na concentração de 2,5 mM de NAC. Quando o sêmen foi resfriado por 48 h, houve diferença no vigor e MT entre amostras com e sem peróxido (P < 0,05), em todos os grupos testados, mas a MP foi similar entre amostras com e sem peróxido, na concentração 2,5 mM. O pH do diluente Equidil® foi o maior e os grupos Equidil + 0,5 mM e 1,0 mM tiveram valores intermediários, enquanto a concentração de 2,5 mM de NAC gerou valores mais baixos, nos três momentos avaliados (P < 0,05). Não houve variação significativa de pH entre os momentos 0 e 24 h (P= 0,7075) e entre 0 e 48 h (P= 0,4617), em todos os grupos testados. As concentrações de NAC testadas não melhoraram a motilidade, integridade da membrana plasmática, atividade mitocondrial e resposta ao HOST de espermatozoides equinos resfriados a 5°C e armazenados por 48 h. Após TTR, as concentrações de NAC testadas não evitaram a diminuição da motilidade e vigor espermático, na presença de peróxido. / The aim of this study was to evaluate the effect of N-acetyl-L-cysteine (NAC) based on skim milk powder extender on sperm viability and oxidative stress of equine semen cooled to 5°C. Ejaculate of 8 ponies of the Brazilian breed were collected in triplicate, resulting in 24 ejaculates, distributed in 4 groups: Equidil® extender + 0.00mm (control), 0.5mM, 1.0mM and 2.5mM of NAC with the semen samples were The samples were stored in 15mL tubes and kept in BotuFLEX® semen transport boxes (Botupharm, Botucatu/SP/Brazil). Parameters, such as motility, vigor, pH, osmolarity, HOST, and MTT were evaluated at 24 and 48 h of cooling also in fresh semen. Vigor, total (TM) and progressive motility (PM) were also evaluated after thermoresistance test (TTR), in the absence and presence of peroxide. TM, PM, sperm vigor and MTT were similar (P > 0.05) between NAC concentrations at 24 and 48 h. The response to HOST was similar between NAC concentrations (P > 0.05) at 24 h cooling, but at 48 h there was a decreased in membrane functionality in 2.5mM NAC group compared to the EQUIDIL group. TM, PM, and vigor of the samples cooled by 24 h and submitted to TTR differed between without and with peroxide (P< 0.05) in the EQUIDIL, 0.5mM and 1.0mM groups, but was similar in 2.5mM NAC. After cooling for 48 h, there was difference in vigor and TM between samples with and without peroxide (P < 0.05) in all groups tested, but the PM was similar between samples with and without peroxide at concentration 2.5mM of NAC. The pH of the EQUIDIL extender was higher and the EQUIDIL + 0.5mM and 1.0mM groups had intermediate values, while the 2.5mM NAC concentration generated lower values in the three evaluated periods (P < 0.05). There was no significant variation of pH between 0 and 24 h (P=0.7075) and between 0 and 48 h (P=0.4617) in all groups tested. The concentrations of NAC tested did not improve motility, plasma membrane integrity, mitochondrial activity and response to HOST equine spermatozoa cooled to 5°C and stored for 48 h. After TTR, the concentrations of NAC tested did not prevent the decrease of motility and sperm vigor in the presence of peroxide.

Este estudo teve como objetivo avaliar o efeito da N-acetil-L-cisteína (NAC), adicionada ao diluente composto de leite em pó desnatado, sobre a viabilidade espermática e o estresse oxidativo do sêmen equino resfriado a 5°C. Ejaculados de 8 pôneis da raça Brasileira foram coletados em triplicata resultando em 24 ejaculados. O sêmen foi distribuído em 4 grupos: Equidil® + 0,00 mM (controle), 0,5 mM, 1,0 mM ou 2,5 mM de NAC. As amostras foram armazenadas em tubos de 15mL e mantidas em caixas de transporte de sêmen BotuFLEX® (Botupharma, Botucatu-SP, Brasil). Parâmetros como motilidade total (MT), motilidade progressiva (MP), vigor, pH, resposta ao teste hiposmótico (HOST) e atividade mitocondrial (MTT) foram avaliados nas 24 e 48 h, bem como no sêmen fresco, após a diluição. O vigor, MT e MP foram também avaliados após teste de termorresistência (TTR), na ausência e presença de peróxido. A MT, a MP, o vigor espermático e a MTT foram similares (P > 0.05) entre as concentrações de NAC, nas 24 e 48 h. A resposta ao HOST foi semelhante entre as concentrações de NAC (P > 0,05) nas 24 h de resfriamento, porém nas 48 h ocorreu diminuição da funcionalidade da membrana no grupo NAC 2,5 mM em comparação ao grupo EQUIDIL, sem adição de NAC. A MT, a MP e vigor, das amostras resfriadas por 24 h e submetidas ao TTR, diferiu entre sem e com peróxido (P < 0,05) nos grupos Equidil, 0,5 mM e 1,0 mM, mas foi similar na concentração de 2,5 mM de NAC. Quando o sêmen foi resfriado por 48 h, houve diferença no vigor e MT entre amostras com e sem peróxido (P < 0,05), em todos os grupos testados, mas a MP foi similar entre amostras com e sem peróxido, na concentração 2,5 mM. O pH do diluente Equidil® foi o maior e os grupos Equidil + 0,5 mM e 1,0 mM tiveram valores intermediários, enquanto a concentração de 2,5 mM de NAC gerou valores mais baixos, nos três momentos avaliados (P < 0,05). Não houve variação significativa de pH entre os momentos 0 e 24 h (P= 0,7075) e entre 0 e 48 h (P= 0,4617), em todos os grupos testados. As concentrações de NAC testadas não melhoraram a motilidade, integridade da membrana plasmática, atividade mitocondrial e resposta ao HOST de espermatozoides equinos resfriados a 5°C e armazenados por 48 h. Após TTR, as concentrações de NAC testadas não evitaram a diminuição da motilidade e vigor espermático, na presença de peróxido. / The aim of this study was to evaluate the effect of N-acetyl-L-cysteine (NAC) based on skim milk powder extender on sperm viability and oxidative stress of equine semen cooled to 5°C. Ejaculate of 8 ponies of the Brazilian breed were collected in triplicate, resulting in 24 ejaculates, distributed in 4 groups: Equidil® extender + 0.00mm (control), 0.5mM, 1.0mM and 2.5mM of NAC with the semen samples were The samples were stored in 15mL tubes and kept in BotuFLEX® semen transport boxes (Botupharm, Botucatu/SP/Brazil). Parameters, such as motility, vigor, pH, osmolarity, HOST, and MTT were evaluated at 24 and 48 h of cooling also in fresh semen. Vigor, total (TM) and progressive motility (PM) were also evaluated after thermoresistance test (TTR), in the absence and presence of peroxide. TM, PM, sperm vigor and MTT were similar (P > 0.05) between NAC concentrations at 24 and 48 h. The response to HOST was similar between NAC concentrations (P > 0.05) at 24 h cooling, but at 48 h there was a decreased in membrane functionality in 2.5mM NAC group compared to the EQUIDIL group. TM, PM, and vigor of the samples cooled by 24 h and submitted to TTR differed between without and with peroxide (P< 0.05) in the EQUIDIL, 0.5mM and 1.0mM groups, but was similar in 2.5mM NAC. After cooling for 48 h, there was difference in vigor and TM between samples with and without peroxide (P < 0.05) in all groups tested, but the PM was similar between samples with and without peroxide at concentration 2.5mM of NAC. The pH of the EQUIDIL extender was higher and the EQUIDIL + 0.5mM and 1.0mM groups had intermediate values, while the 2.5mM NAC concentration generated lower values in the three evaluated periods (P < 0.05). There was no significant variation of pH between 0 and 24 h (P=0.7075) and between 0 and 48 h (P=0.4617) in all groups tested. The concentrations of NAC tested did not improve motility, plasma membrane integrity, mitochondrial activity and response to HOST equine spermatozoa cooled to 5°C and stored for 48 h. After TTR, the concentrations of NAC tested did not prevent the decrease of motility and sperm vigor in the presence of peroxide.

Os hidróxidos duplos lamelares (HDLs) compreendem uma extensa classe de materiais naturais e sintéticos, cujas estruturas e propriedades são frequentemente comparadas com as do mineral hidrotalcita. O estudo da intercalação de espécies de interesse farmacológico em HDLs tem ganhado a atenção da comunidade científica. O objetivo desta Dissertação foi o estudo da intercalação e liberação da espécie antioxidante N-acetil-L-cisteína (NAC) em HDLs de zinco-alumínio (Zn2Al-NAC) e magnésio-alumínio (Mg2Al-NAC). Espécies antioxidantes de modo geral apresentam características como baixa estabilidade química frente à luz e ao calor, sensibilidade ao valor do pH do meio e, algumas, baixa solubilidade. HDLs podem ser utilizados como carregadores de espécies antioxidantes para contornar as características indesejadas supracitadas. Os HDLs foram sintetizados através do método de coprecipitação, utilizando diferentes condições experimentais. Os materiais obtidos foram caracterizados por técnicas estruturais, espectroscópicas, térmicas, texturais e de análise química elementar. A liberação foi estudada através de experimentos in vitro de NAC intercalada ou imobilizada em HDL, empregando meio biológico simulado, nos métodos dinâmico e estático. Os difratrogramas de raios X das amostras de HDL de zinco mostram que a síntese realizada a 55&#176;C conduz à formação de material de alta cristalinidade e reflexão (003) igual a 16,3 &#197;. O material possui partículas planas e com baixo grau de agregação. Os resultados de espectroscopia vibracional e 13C-RMN confirmam a manutenção da integridade estrutural da NAC após intercalação e, ainda, sugerem que ocorreu a desprotonação dos grupos carboxílico e tiol. As lamelas possuem sítios distintos de alumínio hexacordenado, segundo o espectro de 27Al-RMN. O conjunto de técnicas de caracterização indicam a substituição de parte dos íons hidroxila das lamelas pelo oxigênio do grupo carboxilato da NAC. Os ensaios de liberação in vitro sugerem um processo modificado (prolongado) da NAC, visto que no método dinâmico foi liberado 35% dessa espécie em 96 horas, enquanto no método estático ocorreu a liberação de 20%. As análises estratigráficas após o ensaio comprovam que ocorreu a liberação apenas das regiões mais externas do comprimido. Os resultados das sínteses do HDL de magnésio não indicam a intercalação da NAC para essa matriz, mesmo empregando diferentes parâmetros experimentais. A espectroscopia Raman sugere que ocorreu a oxidação parcial dos ânions de NAC devido ao aparecimento da banda de estiramento &#957;S-S (508 cm-1). O espectro de 13C-RMN concorda com o resultado da espectroscopia Raman. Os dados de liberação in vitro corroboram a proposta de que a NAC está apenas imobilizada na superfície do HDL, visto que no método estático levou-se 12 horas para liberar 90% da NAC, sugerindo uma liberação rápida. As análises estratigráficas dos materiais após os testes de liberação dos dois métodos comprovam liberação total da NAC. / Layered double hydroxides (LDHs) comprise an extensive class of natural and synthetic materials, which structures and properties are often compared to those of hydrotalcite mineral. The study about intercalation of species of pharmacological interest into LDHs has gained the attention of the scientific community. The aim of this Dissertation was to investigate the intercalation and release of the antioxidant N-acetyl-L-cysteine (NAC) into LDHs of zinc-aluminum (Zn2Al-NAC) and magnesium-aluminum (Mg2Al-NAC) composition. Antioxidant species generally exhibit characteristics such as low chemical stability towards light and heat, sensitivity to the pH value of the medium and, some of them, low solubility. LDHs can be used as carriers of antioxidant species to circumvent the undesirable properties. LDHs were synthesized using the coprecipitation method and exploiting different experimental conditions. The obtained materials were characterized by structural, spectroscopic, thermal, textural and elemental chemical analysis techniques. The release of intercalated or immobilized NAC was studied by in vitro experiments in simulated biological medium, using the dynamic and static methods. The X-ray diffractograms of LDH samples of zinc show that the synthesis performed at 55&#176;C leads to a high crystalline material and the (003) reflection equal to 16.3 &#197;. The material has flat particles and a low degree of aggregation. The results of vibrational spectroscopy and 13C-NMR confirm the structural integrity of NAC after intercalation, and also suggest that the deprotonation of the carboxylic and thiol groups occurred. The LDH layer has distinct sites of hexacoordinate aluminum, according to the 27Al-NMR spectroscopy. The set of characterization techniques indicates the partial substitution of hydroxide ions in the layers by the oxygen of NAC carboxylate group. The in vitro assays of NAC release suggest a modified (prolonged) process, since 35% of this species was released in 96 h in the dynamic method while occurred 20% of release in the static method. Stratigraphic analyzes of the LDH-NAC tablet after the release test demonstrate that only the species of the outermost regions of the tablet were delivered. The results of magnesium-LDH syntheses do not indicate the intercalation of NAC into the matrix, even using different experimental parameters. Raman spectroscopy suggests that partial oxidation of NAC anions occurred due to the appearance of the band assigned to &#957;S-S (508 cm-1). The 13C-NMR spectrum of Mg2Al-NAC agrees with the result of Raman spectroscopy. In vitro release data corroborate the proposition that NAC is only immobilized on the LDH surface, since it took 12 h to release 90% of NAC in the static method, suggesting a rapid process. The stratigraphic analyzes of the material after the release tests by the two methods confirm the total release of NAC.

Orientadores: Alessandra Alves de Souza, Marco Aurélio Takita / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-16T03:21:51Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Muranaka_LigiaSegatto_M.pdf: 4670725 bytes, checksum: f903ecd21649fe431b36cd1ea62d804b (MD5) Previous issue date: 2010 / Resumo: Xylella fastidiosa é uma bactéria Gram-negativa que causa várias doenças em diferentes espécies de plantas, como a clorose variegada dos citros (CVC) em Citrus sinensis, cujos danos econômicos são da ordem de milhões de dólares anuais. O desenvolvimento dos sintomas tem sido associado ao bloqueio dos vasos do xilema causado pela formação de um biofilme pela bactéria. Recentemente foi verificado que o biofilme de X. fastidiosa é mais resistente a compostos antimicrobianos que a forma planctônica. Essa resistência tem se mostrado um fenômeno complexo que não pode ser explicado por um único mecanismo, e sim por multifatores. Nesse sentido, a proposta desse trabalho foi identificar, por microarranjos de DNA, genes possivelmente associados à adaptação do biofilme na presença de compostos antimicrobianos, em concentrações letais para células em crescimento planctônico, mas que não inibiram o crescimento do biofilme. Foram encontrados 223 (7,87%) CDS induzidas na presença de cobre e 150 (5,29%) reprimidas. Com tetraciclina foram 450 (15,89%) induzidas e 449 (15,85%) reprimidas. Muitas sequências codificadoras envolvidas com funções da síntese proteica, metabolismo energético, divisão celular e movimentação foram moduladas negativamente em ambas as situações, sugerindo que tais modificações contribuiriam para um provável estado de resistência. Com a adição da dose subinibitória de cobre também foi observada a indução de genes relacionados à adesão e produção de toxinas, que estão envolvidos com a virulência da bactéria em planta, o que sugere esta seria aumentada possivelmente induzindo maior severidade de sintomas. Já com tetraciclina o oposto foi observado, repressão de genes relacionados à formação do biofilme e produção de toxinas. No entanto, identificamos a indução de um possível mecanismo de resposta SOS, pela qual genes relacionados ao sistema toxina-antitoxina seriam superexpressos. Esse sistema provavelmente está envolvido com a morte celular programada e formação de células persistentes. Assim é possível concluir que doses subinibitórias de compostos antimicrobianos poderiam ao invés de matar, induzir a virulência da bactéria, como ocorrido com o cobre, ou a formação de células persistentes, como observado com a tetraciclina. Outra abordagem desse trabalho foi à realização de experimentos in vitro e in vivo com um análogo de cisteína, o N-acetyl-L-cysteina (NAC), que já vem sendo utilizado na medicina para desestruturação de biofilmes de bactériaspatógenas de humanos. Resultados da quantificação da massa celular, número de célulasviáveis e exopolissacarídeos totais revelaram que todas as doses de NAC (1, 2 e 6 mg/mL) testadas nos experimentos in vitro diminuiram a formação do biofilme e inibiram o crescimento de X. fastidiosa, o que indica um possível efeito tóxico dessa substância. Nos experimentos in vivo foi observada uma grande redução dos sintomas de CVC em plantas de C. sinensis infectadas e tratadas com diferentes doses de NAC. Esses estudos abrem uma real perspectiva ao uso dessa substância para o manejo da CVC. / Abstract: Xylella fastidiosa is a Gram-negative bacterium that causes several diseases in different plant species, including citrus variegated chlorosis (CVC) in sweet orange (Citrus sinensis L. Osbeck), whose economic damage is of millions of dollars annually. The symptoms development has been associated with the blockage of xylem vessels caused by bacterial biofilm formation. Recently it was found that the biofilm of X. fastidiosa is more resistant to antimicrobial compounds than the planktonic cells. This resistance has been considered as a complex phenomenon that cannot be explained by a single mechanism, but by multi-factors. Accordingly, the intent of this study was to identify through DNA microarray technology, genes possibly involved in adaptation of biofilm cells to the presence of antimicrobial compounds in concentrations that are lethal to cells in planktonic growth, but do not inhibit the cell growth in biofilm. We found 223 (7.87%) genes induced in presence of copper and 150 (5.29%) genes repressed. For tetracycline, there were 450 (15.89%) induced genes and 449 (15.85%) repressed ones. Many genes encoding proteins related to protein synthesis, energy metabolism and cell division were negatively modulated in both, copper and tetracycline treatments, suggesting that these changes could contribute to a state of resistance. When a subinhibitory dose of copper was applied we could also observe the induction of genes related to adhesion and thus biofilm formation and toxin production, suggesting that the bacterial virulence should be increased. The opposite was found for tetracycline. However, we observed the induction of a possible SOS response mechanism in which genes related to a toxin-antitoxin system was overexpressed. This system is probably involved with programmed cell death and formation of persistent cells. We then concluded that subinhibitory doses of antimicrobial compounds could induce bacterial virulence as occurred for copper, or the formation of persistent cells, as observed for tetracycline rather than kill the cells. Another approach of this work was to carry out experiments in vitro and in vivo with an analogue of cysteine, N-acetyl-L-cysteine (NAC), which has been already used in medicine as a drug for disruption of biofilms formed by human pathogenic bacteria. Results of cellular mass quantification, number of viable cells and total exopolysaccharide content revealed that all doses (1.0, 2.0 and 6.0 mg / mL) of NAC tested in in vitro experiments decreased the biofilm formation and inhibited growth of X. fastidiosa, which indicated that this substance could also be toxic for the bacteria. In vivo experiments showed a strong reduction in CVC symptoms in C. sinensis plants infected and treated with different doses of NAC. These studies open a real prospect for the use of this compound in CVC management. / Mestrado / Genetica de Microorganismos / Mestre em Genética e Biologia Molecular