Jaburetox (Jbtx) é um peptídeo de 10 kDa derivado de uma das isoformas de urease de Canavalia ensiformis. Em um estudo anterior realizado com o triatomíneo vetor da doença de Chagas Triatoma infestans, esse peptídeo foi encontrado interagindo com a proteína UDP-N-acetilglicosamina pirofosforilase (UAP), alterando também sua atividade enzimática no sistema nervoso central, in vivo e in vitro. A UAP já foi encontrada em eucariotos, bactérias e vírus, estando relacionada com as rotas de produção de quitina, N-glicosilação e síntese de glicoinositolfosfolipídeos. Assim, o presente trabalho tem três objetivos: i) investigar o efeito de Jbtx sobre a atividade enzimática e a expressão gênica da UAP do inseto modelo Rhodnius prolixus, ii) clonar e expressar a UAP e iii) estudar a UAP filogeneticamente. Para a primeira parte, foram avaliados, no triatomíneo R. prolixus, a atividade enzimática da UAP e o perfil de expressão dessa enzima e da quitina sintase em insetos controles e alimentados com Jbtx. Para a segunda, o cDNA da enzima de R. prolixus foi clonado em vetor pET-15b e expressado em Escherichia coli Rosetta 2. A purificação da enzima recombinante foi feita por cromatografia de afinidade a níquel. Para a terceira parte, foram buscadas sequências de aminoácidos homólogas às da UAP de R. prolixus no servidor pHmmer e foi construída uma árvore filogenética com o método de Máxima Verossimilhança. Os resultados obtidos indicam que o Jbtx aumenta a atividade enzimática da UAP em glândulas salivares, corpo gorduroso e epiderme, enquanto diminui a expressão da UAP em intestino médio anterior, túbulos de Malpighi, glândulas salivares, corpo gorduroso, epiderme e sistema nervoso central, assim como a expressão da quitina sintase nos mesmos órgãos e no intestino médio posterior. Foi obtida uma UAP recombinante de 56 kDa, compatível com peso molecular previsto in silico. A árvore filogenética construída contém 40 sequências, sendo 38 de insetos e 2 sequências de grupo externo. A árvore segue o padrão de evolução dos insetos e foi identificado um novo organismo com potenciais dois genes codificantes de UAP. Esse trabalho apresenta a primeira evidência de que Jbtx altera a expressão gênica em R. prolixus. O resultado obtido pela análise filogenética indica que a UAP é uma enzima ancestral à diversificação em Insecta. / Jaburetox (Jbtx) is a 10 kDa peptide derived from a urease isoform of Canavalia ensiformis. In a previous work with the triatomine vector of Chagas’ disease Triatoma infestans, this peptide was found interacting with the protein UDP-N-acetylglucosamine pyrophosphorylase (UAP), also increasing the UAP enzymatic activity in the central nervous system in vivo and in vitro. UAP has been described in eukaryotes, bacteria and virus, and is involved in chitin production, N-linked glycosylation and glyco inositol phospholipids synthesis pathway. Thus, the present work has three main aims: i) to understand the effect of Jbtx on this enzyme on the model insect Rhodnius prolixus, ii) to clone and express UAP and iii) to study UAP from a phylogenetic point of view. Firstly, UAP enzymatic activity and its expression profile, as well as the chitin synthase expression, were analysed in the triatomine R. prolixus in saline- or Jbtx-fed insects. Secondly, the cDNA from R. prolixus’ UAP was cloned into the pET-15b vector and expressed in Escherichia coli Rosetta 2. The recombinant enzyme was purified through a nickel affinity chromatography. Thirdly, homolog sequences to R. prolixus’ UAP were searched in pHmmer database and a phylogenetic tree was built using the Maximmum Likelihood method. The results obtained indicate that Jbtx increases UAP enzymatic activity in salivary glands, fat body and epidermis, while decreasing UAP’s expression in the anterior and posterior midgut, Malpighian tubules, salivary glands, fat body, epidermis and central nervous system, as well as the chitin synthase expression in the same organs and the posterior midgut. A 56 kDa recombinant UAP was obtained, in agreement with the in silico estimated size. The phylogenetic tree built has 40 sequences, from which 38 are from insects and 2 are from mammals (external group). The tree follows the insect evolution patterns and a new organism containing two potential UAP coding genes was identified. This work presents the first evidence that Jbtx is able to interfere in the gene expression in R. prolixus. The results obtained through phylogenetic analysis shows that UAP is an enzyme ancestral to the diversification in Insecta.

Jaburetox (Jbtx) é um peptídeo de 10 kDa derivado de uma das isoformas de urease de Canavalia ensiformis. Em um estudo anterior realizado com o triatomíneo vetor da doença de Chagas Triatoma infestans, esse peptídeo foi encontrado interagindo com a proteína UDP-N-acetilglicosamina pirofosforilase (UAP), alterando também sua atividade enzimática no sistema nervoso central, in vivo e in vitro. A UAP já foi encontrada em eucariotos, bactérias e vírus, estando relacionada com as rotas de produção de quitina, N-glicosilação e síntese de glicoinositolfosfolipídeos. Assim, o presente trabalho tem três objetivos: i) investigar o efeito de Jbtx sobre a atividade enzimática e a expressão gênica da UAP do inseto modelo Rhodnius prolixus, ii) clonar e expressar a UAP e iii) estudar a UAP filogeneticamente. Para a primeira parte, foram avaliados, no triatomíneo R. prolixus, a atividade enzimática da UAP e o perfil de expressão dessa enzima e da quitina sintase em insetos controles e alimentados com Jbtx. Para a segunda, o cDNA da enzima de R. prolixus foi clonado em vetor pET-15b e expressado em Escherichia coli Rosetta 2. A purificação da enzima recombinante foi feita por cromatografia de afinidade a níquel. Para a terceira parte, foram buscadas sequências de aminoácidos homólogas às da UAP de R. prolixus no servidor pHmmer e foi construída uma árvore filogenética com o método de Máxima Verossimilhança. Os resultados obtidos indicam que o Jbtx aumenta a atividade enzimática da UAP em glândulas salivares, corpo gorduroso e epiderme, enquanto diminui a expressão da UAP em intestino médio anterior, túbulos de Malpighi, glândulas salivares, corpo gorduroso, epiderme e sistema nervoso central, assim como a expressão da quitina sintase nos mesmos órgãos e no intestino médio posterior. Foi obtida uma UAP recombinante de 56 kDa, compatível com peso molecular previsto in silico. A árvore filogenética construída contém 40 sequências, sendo 38 de insetos e 2 sequências de grupo externo. A árvore segue o padrão de evolução dos insetos e foi identificado um novo organismo com potenciais dois genes codificantes de UAP. Esse trabalho apresenta a primeira evidência de que Jbtx altera a expressão gênica em R. prolixus. O resultado obtido pela análise filogenética indica que a UAP é uma enzima ancestral à diversificação em Insecta. / Jaburetox (Jbtx) is a 10 kDa peptide derived from a urease isoform of Canavalia ensiformis. In a previous work with the triatomine vector of Chagas’ disease Triatoma infestans, this peptide was found interacting with the protein UDP-N-acetylglucosamine pyrophosphorylase (UAP), also increasing the UAP enzymatic activity in the central nervous system in vivo and in vitro. UAP has been described in eukaryotes, bacteria and virus, and is involved in chitin production, N-linked glycosylation and glyco inositol phospholipids synthesis pathway. Thus, the present work has three main aims: i) to understand the effect of Jbtx on this enzyme on the model insect Rhodnius prolixus, ii) to clone and express UAP and iii) to study UAP from a phylogenetic point of view. Firstly, UAP enzymatic activity and its expression profile, as well as the chitin synthase expression, were analysed in the triatomine R. prolixus in saline- or Jbtx-fed insects. Secondly, the cDNA from R. prolixus’ UAP was cloned into the pET-15b vector and expressed in Escherichia coli Rosetta 2. The recombinant enzyme was purified through a nickel affinity chromatography. Thirdly, homolog sequences to R. prolixus’ UAP were searched in pHmmer database and a phylogenetic tree was built using the Maximmum Likelihood method. The results obtained indicate that Jbtx increases UAP enzymatic activity in salivary glands, fat body and epidermis, while decreasing UAP’s expression in the anterior and posterior midgut, Malpighian tubules, salivary glands, fat body, epidermis and central nervous system, as well as the chitin synthase expression in the same organs and the posterior midgut. A 56 kDa recombinant UAP was obtained, in agreement with the in silico estimated size. The phylogenetic tree built has 40 sequences, from which 38 are from insects and 2 are from mammals (external group). The tree follows the insect evolution patterns and a new organism containing two potential UAP coding genes was identified. This work presents the first evidence that Jbtx is able to interfere in the gene expression in R. prolixus. The results obtained through phylogenetic analysis shows that UAP is an enzyme ancestral to the diversification in Insecta.

A N-acetilglicosamina 6-fosfato desacetilase (EC 3.5.1.25), uma enzima envolvida na via catabólica de açucares aminados da Escherichia coli, foi cristalizada pela técnica de difusão de vapor utilizando-se fosfato como agente precipitante. Experimentos de difração de raios-X mostraram que os cristais pertencem ao sistema cristalino ortorrômbico com grupo espacial P21212. Os parâmetros de cela são a=82,09(2) Å, b=114,50(1) Å e c=80,17(1) Å. Os cristais difrataram a uma resolução máxima de 1,8 Å e um conjunto de dados foi coletado até 2.0 Å. O conteúdo da unidade assimétrica provavelmente é um dímero, produzindo um coeficiente de Matthews de 2,30 Å3 Da-1 / N-acetylglucosamine 6-phosphate deacetylase (EC 3.5.1.25), an enzyme involved in amino sugar catabolismo from Escherichia coli has been crystallized by the vapor diffusion technique using phosphate as precipitant. X-ray diffraction experiments show the crystals to belong to the orthorhombic crystals system with space group P21212. The unit cell parameters are a=82,09(2) Å, b=114,50(1) Å e c=80,17(1) Å. The crystals diffract to a maximum resolution of 1.8 Å and a initial dataset was collected to 2.0 Å. The asymmetric unit content is likely to be a dimer, yielding a Matthews coefficient of 2.30 Å3 Da-1

A N-acetilglicosamina 6-fosfato desacetilase (EC 3.5.1.25), uma enzima envolvida na via catabólica de açucares aminados da Escherichia coli, foi cristalizada pela técnica de difusão de vapor utilizando-se fosfato como agente precipitante. Experimentos de difração de raios-X mostraram que os cristais pertencem ao sistema cristalino ortorrômbico com grupo espacial P21212. Os parâmetros de cela são a=82,09(2) Å, b=114,50(1) Å e c=80,17(1) Å. Os cristais difrataram a uma resolução máxima de 1,8 Å e um conjunto de dados foi coletado até 2.0 Å. O conteúdo da unidade assimétrica provavelmente é um dímero, produzindo um coeficiente de Matthews de 2,30 Å3 Da-1 / N-acetylglucosamine 6-phosphate deacetylase (EC 3.5.1.25), an enzyme involved in amino sugar catabolismo from Escherichia coli has been crystallized by the vapor diffusion technique using phosphate as precipitant. X-ray diffraction experiments show the crystals to belong to the orthorhombic crystals system with space group P21212. The unit cell parameters are a=82,09(2) Å, b=114,50(1) Å e c=80,17(1) Å. The crystals diffract to a maximum resolution of 1.8 Å and a initial dataset was collected to 2.0 Å. The asymmetric unit content is likely to be a dimer, yielding a Matthews coefficient of 2.30 Å3 Da-1

Glycosylation O-linked β-N-acetylglucosamine (O-GlcNAc) is post-translational modification of proteins, regulated by β-N-acetylglucosaminyltransferase (OGT) and β-N-acetylglucosaminidase (OGA). This intracellular glycosylation differs from the other glycosylation types - it is dynamically regulated, similarly to phosphorylation, β-N-acetylglucosamine serves as a nutrient and stress sensor in cell. Chronically dysregulated O-linked glycosylation by GlcNAc is associated with pathology of various diseases, such as diabetes mellitus type II, oncological and neurodegenerative diseases. Expression of enzymes OGT and OGA is very sensitive for homeostasis of GlcNAc, which is the product of hexosamine biosynthetic pathway. Changes in expressions of these ezymes could be used as a potencial blood marker, e.g. in early stage of diabetes. The aim of this master thesis was to study changes in expression of genes encoding ezymes OGT and OGA in cohort of obese patients in comparison with healthy controls and also to compare the state before and after change of lifestyle (loosing weight). Analysed cohort comprised of 34 samples of isolated lymphocytes from peripheral blood from obese adolescent patients and 80 samples of adults patients. RNA was isolated by TriReagent, quantification of the expression of mRNA was...

Submitted by Ricardo Cedraz Duque Moliterno (ricardo.moliterno@uefs.br) on 2015-07-27T21:18:33Z No. of bitstreams: 1 Dissertac?o Jos? Jorge Silva Junior.pdf: 3038189 bytes, checksum: be43dcbd4f764e08ab18fd95a388e950 (MD5) / Made available in DSpace on 2015-07-27T21:18:33Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Dissertac?o Jos? Jorge Silva Junior.pdf: 3038189 bytes, checksum: be43dcbd4f764e08ab18fd95a388e950 (MD5) Previous issue date: 2014-07-31 / Coordena??o de Aperfei?oamento de Pessoal de N?vel Superior - CAPES / Pests are responsible for high losses in cocoa production in Brazil and other countries, among them the witches' broom (WB) is one of the most important and destructive to the cocoa, even causing losses of up to 95% of production. This plague has spread very easily in the state of Bahia due to environmental conditions that provided the spread of WB, caused by the fungus Moniliophthora pernicious. Several chemical compounds have been tested in order to prevent or eradicate WB, however it has not showed good results, so the present study aimed to perform in silico assays were obtained in order to identify inhibitors of UDP-N-acetylglucosamine pyrophosphorylase (UNAcP) of M. perniciosa. For achieve this goal, computational methods have been employed in the search for new inhibitors for UNAcP where different stages of research and evaluation were performed. The initial stage of virtual screening consisted of the choice of the scoring function, thus the following scoring functions were evaluated: Broyden Fletcher Goldfarb Shanno (BFGS) present in AutoDock VINA 1.1.2; Grid and Grid Score Score+Hawkins GB/SA both present in DOCK 6.5 and calculate the consensus score. The results were analyzed by calculating Enrichment Factor (EF) analysis of the ROC curve and its respective Area under an ROC curve (AUC). The Grid Score presented EF(5)=7.85. The ROC curve analysis allowed us to observe that the Grid Score function can identify almost 40% of active molecules with less than 10% of the database (false positive and active molecules), AUC analysis demonstrated that the Grid Score has greater accuracy (AUC=0.87). Thus, these results showed what the Grid Score was the best scoring function for this system. A database composed of molecules derived from natural sources was also used. The top ten results of virtual screening of the DOCK6.5 underwent online platform ChemGPS-NP, for the calculation of chemical descriptors. Thus, the molecules were re-categorized, based on the values of the Grid Score DOCK6.5 and chemical descriptors ChemGPS-NP. The results indicate the ZINC68592326 molecule his the best score and the analysis indicates that this has hydrophobic interactions with Ala380, Gln113, Gly112, Gly381, Ser168, Arg383, Pro221 and hydrogen bond interaction (3.32?) with Asn224. The virtual screening database of molecules derived from natural products research allowed with a universe of structures with very different characteristics. It was possible to obtain molecules with great structural diversity between the top ranking, however, also found very similar to the reference molecules. The use of chemometric methods is considered very useful and allows a systematic and consistent choice of structures, mainly by taking into account chemical descriptors and molecular characteristics, allowing for a more detailed evaluation. / Pragas s?o respons?veis por elevadas perdas na produ??o de cacau no Brasil e no mundo, dentre elas a vassoura-de-bruxa (VB) ? uma das mais importantes e destrutivas para o cacaueiro, chegando a causar perdas de at? 95% da produ??o. Essa praga disseminou-se muito facilmente no estado da Bahia devido a condi??es ambientais que proporcionaram a propaga??o da VB, causada pelo fungo Moniliophthora perniciosa. Diversos compostos qu?micos v?m sendo testados com o objetivo de prevenir ou erradicar a VB, por?m n?o foram obtidos bons resultados, portanto, o presente trabalho teve como principal objetivo realizar ensaios in silico, a fim de identificar inibidores da UDP-N-acetilglicosamina pirofosforilase (UNAcP) do M. perniciosa. Para tanto, foram empregados m?todos computacionais na busca de novos inibidores para a UNAcP, onde foram realizadas diferentes etapas de busca e avalia??o. A etapa inicial da triagem virtual consistiu na escolha da fun??o de pontua??o, assim, foram avaliadas as seguintes fun??es de pontua??o: Broyden?Fletcher?Goldfarb?Shanno (BFGS) presente no AUTODOCK VINA 1.1.2; Grid Score e Grid Score+Hawkins GB/SA ambos presentes no DOCK 6.5 e o c?lculo do escore de consenso. Os resultados foram analisados atrav?s do c?lculo de Fator de Enriquecimento (FE), analise da curva ROC e sua respectiva ?rea Sobre a Curva (AUC). O Grid Score apresentou FE(5)=7,85. A an?lise da curva ROC permitiu observar que a fun??o Grid Score consegue identificar quase 40% das mol?culas ativas com menos de 10% do banco de dados (mol?culas ativas e falso positivos), a an?lise da AUC demonstrou que o Grid Score tem maior exatid?o (AUC=0,87). Assim os resultados da avalia??o apontaram o Grid Score como melhor fun??o de pontua??o para esse sistema. Foi utilizado um banco de dados composto por mol?culas oriundas de fontes naturais. Os dez melhores resultados da triagem virtual feita no DOCK6.5 foram submetidos ? plataforma on line ChemGPS-NP, para o c?lculo dos descritores qu?micos. Assim, as mol?culas foram recategorizadas, baseando-se nos valores do Grid Score do DOCK6.5 e descritores qu?micos do ChemGPS-NP. Os resultados apontaram a mol?cula ZINC68592326 com a melhor pontua??o, a an?lise das intera??es intermoleculares indica que est? mol?cula apresenta intera??es hidrof?bicas com os res?duos Ala380, Gln113, Gli112, Gli381, Ser168, Arg383, Pro221 e liga??o de hidrog?nio do tipo aceptora com dist?ncia de 3,32? com o res?duo Asn224. A triagem virtual em banco de dados de mol?culas oriundas de produtos naturais permitiu a investiga??o com um universo de estruturas com caracter?sticas muito diversas. Foi poss?vel obter mol?culas com grande diversidade estrutural entre os primeiros do ranking, por?m, foram encontradas tamb?m mol?culas muito similares ?s mol?culas de refer?ncia. A utiliza??o de m?todos quimiom?tricos, ? considerada muito ?til e permitem uma escolha sistem?tica e consistente das estruturas, principalmente por levar em considera??o, descritores qu?micos e caracter?sticas moleculares, permitindo uma avalia??o mais criteriosa.

A análise da expressão gênica em larga escala é de fundamental importância para a melhor compreensão do funcionamento celular e dos mecanismos de regulação gênica. Ela possibilita a medida dos níveis de expressão de milhares de genes simultaneamente, o que torna possível uma visão mais abrangente do sistema biológico. Dentre as principais técnicas experimentais disponíveis para esta finalidade, a tecnologia de microarranjo tem sido amplamente utilizada. O objetivo desta dissertação foi determinar os genes de V. parahaemolyticus que têm sua expressão induzida ou reprimida na presença do aminoaçúcar N-acetilglucosamina (NAG). V. parahaemolyticus é uma bactéria marinha, comumente encontrada na água e em associação com organismos marinhos. O NAG é um dos aminoaçúcares mais abundantes no meio marinho. Para isso, Vibro parahaemolyticus RIMD2210633, foi cultivada em dois meios como fontes de energia. O primeiro meio composto por maltose e NAG e o segundo apenas por NAG. O cultivo bacteriano foi feito em condições aeróbicas, sob baixa agitação, a 28C. Foram retiradas duas amostras do cultivo no tempo de 24 horas após o início do experimento a fim de realizar a extração de mRNA e a preparação do cDNA. Os experimentos foram feitos em três replicas. As misturas de cDNA preparadas a partir do RNA extraído de cada réplica foram utilizadas em hibridizações em lâminas de microarranjo contendo um total de 4832 ORFS do genoma de V. parahaemolyticus RIMD2210633. A análise comparativa da expressão gênica de V. parahaemolyticus nas duas condições de cultivo resultou na detecção de 59 genes com expressão induzida, 38 genes reprimidos, e 4245 sem expressão modificada (aumentada ou diminuída) na presença de NAG. No total, 523 genes foram excluídos da comparação pois a hibridização não foi satisfatória. Ocorreu uma ordenação dos genes seguindo a classificação funcional do banco de dados TIGR-CMR e KEGG. Os genes com expressão induzida, pertencem principalmente às classes de funções regulatórias, metabolismo de energia, e proteínas de transporte. Foram também encontradas proteínas PilA e de quimiotaxia, sugerindo um papel da NAG na transformação. Já os genes de expressão reprimida compreendem principalmente as funções de metabolismo de energia, endereçamento celular, e proteínas hipotéticas. O presente estudo demonstrou que NAG interfere na regulação de diferentes processos celulales, incluindo a capacidade de captura de DNA do meio por V. parahaemolyticus. / Large scale gene expression analysis has fundamental importance for understanding cellular function and gene regulation mechanics. It enables the measurement of expression levels of thousands of genes simultaneously, and makes possible a wider understanding of the biological system. Among the main experimental techniques available for this purpose, microarray technology has been widely used. The objective of this work was to determine the genes of Vibrio parahaemolyticus which have their expression induced or repressed in presence of amino-sugars N-acetylglucosamine (NAG). V. parahaemolyticus is a marine bacterium, commonly found in water and in association with marine organisms. NAG is one of the most abundant amino sugars in the marine environment. For this, V. parahaemolyticus RIMD2210633, was cultivated in two media as sources of energy. The first medium consists of maltose and NAG (control) and the second only by NAG (treatment). Bacterial culture was done under aerobic conditions and low agitation at 28C. Two samples were drawn from the medium 24 hours after the experiment beginning in order to perform the extraction of mRNA and preparation of cDNA. Three replicas of the experiments were made. Mixtures of cDNA prepared from RNA extracted from each replicate were used in hybridizations in microarray slides containing a total of 4832 ORFS from the V. parahaemolyticus RIMD2210633 genome. Comparative analysis of gene expression of V. parahaemolyticus in two culture conditions resulted in detection of 59 genes with expression induced, 38 repressed genes, and 4245 without modified expression (increased or decreased) in presence of NAG. In total, 523 genes were excluded from this comparison because the hybridization was unsatisfactory. There was a gene ordination following the functional classification of the database TIGR-CMR and KEGG. The genes with induced expression mainly belong to classes of regulatory functions, energy metabolism, and transport proteins. PilA and Chemotaxis proteins were found, suggesting a role of NAG in the transformation. Repressed expression genes are mainly included in the functions of energy metabolism, cell address, and hypothetical proteins. This study demonstrated that NAG interfere in regulation of different cell processes, including the ability to capture DNA from the medium by V. parahaemolyticus.

Made available in DSpace on 2015-03-04T18:51:21Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Antonio Neto.pdf: 2082167 bytes, checksum: f56cf900db766b4f223ae0ad59348aa7 (MD5) Previous issue date: 2010-03-11 / Coordenacao de Aperfeicoamento de Pessoal de Nivel Superior / Large scale gene expression analysis has fundamental importance for understanding cellular function and gene regulation mechanics. It enables the measurement of expression levels of thousands of genes simultaneously, and makes possible a wider understanding of the biological system. Among the main experimental techniques available for this purpose, microarray technology has been widely used. The objective of this work was to determine the genes of Vibrio parahaemolyticus which have their expression induced or repressed in presence of amino-sugars N-acetylglucosamine (NAG). V. parahaemolyticus is a marine bacterium, commonly found in water and in association with marine organisms. NAG is one of the most abundant amino sugars in the marine environment. For this, V. parahaemolyticus RIMD2210633, was cultivated in two media as sources of energy. The first medium consists of maltose and NAG (control) and the second only by NAG (treatment). Bacterial culture was done under aerobic conditions and low agitation at 28°C. Two samples were drawn from the medium 24 hours after the experiment beginning in order to perform the extraction of mRNA and preparation of cDNA. Three replicas of the experiments were made. Mixtures of cDNA prepared from RNA extracted from each replicate were used in hybridizations in microarray slides containing a total of 4832 ORFS from the V. parahaemolyticus RIMD2210633 genome. Comparative analysis of gene expression of V. parahaemolyticus in two culture conditions resulted in detection of 59 genes with expression induced, 38 repressed genes, and 4245 without modified expression (increased or decreased) in presence of NAG. In total, 523 genes were excluded from this comparison because the hybridization was unsatisfactory. There was a gene ordination following the functional classification of the database TIGR-CMR and KEGG. The genes with induced expression mainly belong to classes of regulatory functions, energy metabolism, and transport proteins. PilA and Chemotaxis proteins were found, suggesting a role of NAG in the transformation. Repressed expression genes are mainly included in the functions of energy metabolism, cell address, and hypothetical proteins. This study demonstrated that NAG interfere in regulation of different cell processes, including the ability to capture DNA from the medium by V. parahaemolyticus. / A análise da expressão gênica em larga escala é de fundamental importância para a melhor compreensão do funcionamento celular e dos mecanismos de regulação gênica. Ela possibilita a medida dos níveis de expressão de milhares de genes simultaneamente, o que torna possível uma visão mais abrangente do sistema biológico. Dentre as principais técnicas experimentais disponíveis para esta finalidade, a tecnologia de microarranjo tem sido amplamente utilizada. O objetivo desta dissertação foi determinar os genes de V. parahaemolyticus que têm sua expressão induzida ou reprimida na presença do aminoaçúcar N-acetilglucosamina (NAG). V. parahaemolyticus é uma bactéria marinha, comumente encontrada na água e em associação com organismos marinhos. O NAG é um dos aminoaçúcares mais abundantes no meio marinho. Para isso, Vibro parahaemolyticus RIMD2210633, foi cultivada em dois meios como fontes de energia. O primeiro meio composto por maltose e NAG e o segundo apenas por NAG. O cultivo bacteriano foi feito em condições aeróbicas, sob baixa agitação, a 28°C. Foram retiradas duas amostras do cultivo no tempo de 24 horas após o início do experimento a fim de realizar a extração de mRNA e a preparação do cDNA. Os experimentos foram feitos em três replicas. As misturas de cDNA preparadas a partir do RNA extraído de cada réplica foram utilizadas em hibridizações em lâminas de microarranjo contendo um total de 4832 ORFS do genoma de V. parahaemolyticus RIMD2210633. A análise comparativa da expressão gênica de V. parahaemolyticus nas duas condições de cultivo resultou na detecção de 59 genes com expressão induzida, 38 genes reprimidos, e 4245 sem expressão modificada (aumentada ou diminuída) na presença de NAG. No total, 523 genes foram excluídos da comparação pois a hibridização não foi satisfatória. Ocorreu uma ordenação dos genes seguindo a classificação funcional do banco de dados TIGR-CMR e KEGG. Os genes com expressão induzida, pertencem principalmente às classes de funções regulatórias, metabolismo de energia, e proteínas de transporte. Foram também encontradas proteínas PilA e de quimiotaxia, sugerindo um papel da NAG na transformação. Já os genes de expressão reprimida compreendem principalmente as funções de metabolismo de energia, endereçamento celular, e proteínas hipotéticas. O presente estudo demonstrou que NAG interfere na regulação de diferentes processos celulales, incluindo a capacidade de captura de DNA do meio por V. parahaemolyticus.

Human African trypanosomiasis (sleeping sickness) is a devastating disease which is endemic in parts of sub-Saharan Africa. It is caused by the protozoan parasite T. brucei, which are transmitted by the bite of infected tsetse flies. Although the disease is fatal if left untreated, there is a lack of safe, effective and affordable drugs available; therefore new drugs are urgently needed. The aim of the work presented in this thesis is to develop novel trypanocidal compounds. It is divided into two parts to reflect the two distinct strategies employed to achieve this aim. The first part focuses on the inhibition of glycophosphoinositol (GPI) anchor synthesis by inhibiting the Zn2+-dependent enzyme, GlcNAc-PI de-N-acetylase. Trypanosomes have a variable surface glycoprotein (VSG) coat, which allows them to evade the human immune system. The GPI anchor attaches the VSG to the cell membrane; therefore inhibiting GPI synthesis should expose the parasite to the immune system. Initially, large substrate analogues were synthesized. These showed weak inhibition of the enzyme. Zinc-binding fragments were screened, and small molecule inhibitors based on salicylhydroxamic acid were then synthesized. These compounds showed modest inhibition, but the excellent ligand efficiency of salicylhydroxamic acid indicates this may be a promising starting point for further inhibitors. The second part details the P2 strategy. The P2 transporter is a nucleoside transporter unique to T. brucei, which concentrates adenosine. The transporter also binds and selectively concentrates compounds that contain benzamidine and diaminotriazine P2 motifs, which can enhance the potency and selectivity of these compounds. The sleeping sickness drugs melarsoprol and pentamidine contain P2 motifs. Compounds comprising a P2 targeting motif, a linker and a trypanocidal moiety were synthesized. Initially, a diaminotriazine P2 motif was attached to a trypanocidal tetrahydroquinoline (THQ) protein farnesyl transferase (PFT) inhibitor, with limited success. The P2 strategy was also applied to a non-selective, trypanocidal, quinol moiety. The quinol moiety was attached to diaminotriazine and benzamidine P2 motifs, and an increase in selectivity for T. brucei over MRC5 cells was observed.

Microglial activation and behavioral abnormalities occur before neuronal loss in experimental murine prion disease; the behavioral changes coincide with a reduction in synaptic plasticity. Because synaptic plasticity depends on an intact perineuronal net (PN), a specialized extracellular matrix that surrounds parvalbumin (PV)-positive GABAergic (gamma-aminobutyric acid [GABA]) inhibitory interneurons, we investigated the temporal relationships between microglial activation and loss of PN and PV-positive neurons in ME7 murine prion disease. Anesthetized C57Bl/6J mice received bilateral intracerebral microinjections of ME7-infected or normal brain homogenate into the dorsal hippocampus. Microglial activation, PrP accumulation, the number of PV-positive interneurons, and Wisteria floribunda agglutinin-positive neurons (i.e. those with an intact PN) were assessed in the ventral CA1 and subiculum at 4, 8, 12, 16, and 20 weeks postinjection. Hippocampal areas and total neuron numbers in the ventral CA1 and subiculum were also determined. Loss of PN coincided with early microglial activation and with a reduction in synaptic plasticity. No significant loss of PV-positive interneurons was observed. Our findings suggest that the substrate of the earliest synaptic and behavioral abnormalities in murine prion disease may be inflammatory microglia-mediated degradation of the PN.