Le symporteur Na+/I- (NIS) médie le captage de l'iode dans la glande thyroïde et cette propriété est exploitée depuis de nombreuses années en thérapeutique pour traiter les cancers différenciés de la thyroïde à l’iode radioactif 131 (Radiothérapie métabolique ou RAI). Cependant, 5 à 10% des patients deviennent réfractaires à la RAI, ce qui indique un mauvais pronostic. La réduction de l'expression NIS et son internalisation sont caractéristiques de ce processus. La mutation activatrice BRAFV600E est la plus fréquemment identifiée au sein des cancers différenciés de la thyroïde de type papillaires (CPT), qui est le type le plus répandu. Dans les thyrocytes de souris, BRAF muté induit la sécrétion de TGF qui active ensuite la voie Smad ce qui entraîne la répression du NIS. La NADPH oxydase 4 (NOX4), enzyme génératrice d’espèces réactives de l'oxygène (ROS), est un médiateur clé de la signalisation du TGFß dans de nombreux types cellulaires et sa surexpression a été détectée dans le cancer de la thyroïde. L'objectif de ce travail est d'évaluer si NOX4 est un médiateur de la répression NIS induite par BRAFV600E dans des lignées cellulaires thyroïdiennes. En utilisant une lignée cellulaire de thyroïde normal de rat (PC-BRAF), nous avons démontré que le TGF-β ou l'expression BRAFV600E promeut la diminution de l'ARNm NIS ainsi que celle du captage de l'iodure en revanche ils augmentent l’expression de l'ARNm NOX4. Le silençage de Nox4 par siRNA ou un traitement des cellules par SIS3, un inhibiteur de pSmad3, inhibe la répression du NIS médiée par BRAFV600E, indiquant l'implication de la voie Smad3 et de Nox4 dans cette répression. Dans la lignée tumorale BCPAP derivée d’un CPT humain et porteuse de la mutation BRAFV600E, nous avons également observé une augmentation de l'expression de l'ARNm NIS lorsque BRAFV600E ou NOX4 sont inhibés. Dans les cellules BCPAP, un traitement par H2O2 augmente l'expression de la protéine ADN méthyltransférase 1 (DNMT1) dans la fraction cellulaire enrichie en protéines liées à la chromatine. Un traitement par des antioxydants ou le silençage de NOX4 réduise ce recrutement. Le TGF augmente le niveaux de protéines DNMT1 dans la fraction cellulaire enrichie en chromatine, lequel qui est renversé par un traitement par un inhibiteur de NADPH oxydase : le Diphenyleneiodonium (DPI). La méthylation de l'ADN induite par le TGF et l'hypoacétylation de l'histone H3K9/K14, qui sont des marques de répression de la transcription, sont détectées au niveau du promoteur NIS. L’ensemble de ces données suggère que Nox4 est un acteur clé de la signalisation TGF-BRAFV600 et joue un rôle répressif sur l'expression du NIS, probablement par des mécanismes épigénétiques. Cette étude apporte des données fonctionnelles pour le développement de nouveaux outils thérapeutiques. / The co-transporter Na+/ I- (NIS) mediates iodide uptake in thyroid gland which is a key step in hormonal biosynthesis. Iodide accumulation by thyrocytes is the basis of radioiodine therapy (RAI) which is the standard post-surgery therapeutic approach to efficiently eliminate remaining cancer lesions and metastasis of differentiated thyroid cancer (DTC). However, 5-10% of DTC patients become RAI-refractory which is indicative of poor prognosis. Reduced NIS expression and NIS internalization are in this process. BRAFV600E mutation is the most common genetic event in papillary thyroid cancers (PTCs), the most prevalent type of DTC. In rat thyrocytes, BRAFV600E induces secretion of TGFβ that activates Smad pathway resulting in NIS downregulation and overexpression of TGFβ is associated with NIS repression in patients. NADPH oxidase NOX4, a professional reactive oxygen species (ROS) generating enzyme, is a key mediator of TGFβ signaling in many cell types and has been previously demonstrated to be overexpressed thyroid cancers. To better understand the molecular mechanisms involved in PTC loss of iodine avidity, the aim of this work is to evaluate whether NOX4 is a key player of BRAFV600E-mediated NIS repression in thyroid cell lines. Using a normal rat thyroid cell line (PC-BRAF) we demonstrated that TGF-β administration or expression of BRAFV600E resulted in reduced NIS mRNA, reduced iodine uptake and increased NOX4 mRNA expression. NOX4 silencing or treatment with SIS3 an inhibitor of Smad pathway partially inhibited NIS repression indicating the implication of both Smad pathway and NOX4. To confirm this results we used a human thyroid cancer cell lines that harbors BRAFV600E mutation (BCPAP and 8505c) and observed an increase in NIS expression followed by BRAFV600E or NOX4 downregulation. Exogenous H2O2 induced DNA methyl-transferase 1 (DNMT1) enrichment in tight-chromatin protein fraction which was decreased by antioxidants or NOX4 silencing in BCPAP cells. TGF increased DNMT1 protein levels in chromatin-enriched cell fraction which was reversed by NADPH oxidase inhibitor, Diphenyleneiodonium (DPI). TGF-mediated DNA methylation and histone H3K9/K14 hypoacetylation were detected in NIS promoter, which is a repressive transcriptional mark. The data obtained suggest that NOX4 is a mediator of BRAFV600-TGF signaling and has a repressive role over NIS expression probably through epigenetic mechanisms. These results should lead to a better understanding of NIS expression regulation in thyroid cancer, bringing functional data for the development of new therapeutic tools.

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Une des propriétés majeures de la thyroïde est de capter l’iode de la circulation sanguine grâce à la présence d’un transporteur d’iodure (NIS pour Natrium Iodide Symporter). Cette capacité d’accumulation d’iode par les thyrocytes joue un rôle clé dans la synthèse des hormones thyroïdiennes ainsi dans le diagnostic et le traitement des cancers de la thyroïde. Cependant, en raison d’une diminution ou de l’absence de l’expression du NIS dans certaines tumeurs et métastases, des patients deviennent réfractaires à la radiothérapie métabolique et présentent une radiorésistance, causant ainsi un problème de santé publique.L’oncogène BRAFV600E, un puissant activateur de La voie MAP kinase, est détecté dans 40 - 60% des cancers thyroïdiens de type papillaires (CPT) qui représentent 80% de la totalité des cancers thyroïdiens. La mutation BRAFV600E est associée aux tumeurs thyroïdiennes les plus agressives. Cependant l’inhibition pharmacologique de la voie MAP kinase induite constitutivement par l’oncogène BRAFV600E ne permet pas, à elle seule, de rétablir l’expression du NIS chez des patients atteints d’un cancer de la thyroïde muté BRAFV600E. Ceci suggère que d’autres mécanismes compensatoires peuvent contribuer à la radiorésistance. Une étude récente menée sur un modèle murin a montré que la régulation négative du NIS par l’oncogène BRAFV600E est médiée par la voie du TGF beta. Une autre a montré que l’expression du NIS serait dépendante de l’état redox de la cellule, suggérant un rôle des espèces réactives de l’oxygène (ROS). Dans les cellules les ROS peuvent être produites par les NADPH oxydases (NOX/DUOX). La thyroïde en exprime trois : DUOX2 nécessaire à la synthèse des hormones thyroïdiennes ainsi que DUOX1 et NOX4 dont le rôle physiologique reste inconnu. NOX4, surexprimé dans les CPTs, a été montré être un nouvel effecteur clé de la voie du TGF beta dans d’autres cancers.Dans mon projet de thèse, je me suis intéressée à l’étude du rôle de NOX4 dans la régulation négative du NIS dans les CPT mutés BRAFV600E. L’étude du mécanisme, réalisée à partir de deux lignées humaines issues de cancers papillaires mutés pour BRAF (BCPAP et 8505C), a permis d’établir que l’oncogène BRAFV600E contrôle l’expression de NOX4 au niveau transcriptionnel via la voie TGF-beta/Smad3. Ces résultats ont été validés sur une lignée de rat exprimant de manière conditionnelle BRAFV600E ainsi que sur des thyrocytes humains en culture primaire. De manière importante, l’utilisation d’antioxydants tels que le N-acetyl cystéine (NAC) ou l’inhibition spécifique de l’expression de NOX4 par ARN interférence permet de réinduire l’expression du NIS. Ces résultats qui montrent que les ROS produites par NOX4 inhibent l’expression du transporteur de l’iode (NIS) établissent un lien entre l’oncogène BRAFV600E et NOX4. Une analyse comparative de l'expression de NOX4 effectuée à partir de 500 cancers papillaires de la thyroïdes mutés ou non pour BRAF (données TCGA) confirme que NOX4 est significativement augmenté dans les cancers porteurs de la mutation BRAF et que ceci est corrélé à une diminution de l’ARNm du NIS. Par ailleurs, le niveau de NOX4 est inversement corrélé au score de différenciation thyroïdien, suggérant que NOX4 pourrait être impliqué dans le processus de dédifférenciation. Cette étude ouvre une nouvelle opportunité pour l’optimisation de l’utilisation de la radiothérapie métabolique dans le traitement des cancers thyroïdiens réfractaires à l’iode I131 et présente NOX4 comme une cible thérapeutique potentielle. / One of the major properties of the thyroid is iodine uptake from the bloodstream through an iodide transporter (NIS for Natrium Iodide Symporter). This capacity plays a key role in the thyroid hormones synthesis, but also in both diagnosis and treatment of thyroid cancer. However, due to a decrease or absence of the NIS expression in some tumors and metastases, patients become refractory to the metabolic radiotherapy and present a radioresistance, which cause a public health problem.The BRAFV600E oncogene, a potent activator of the MAP kinase pathway, is detected in 40-60% of papillary thyroid cancer (PTC), which represent 80% of total thyroid cancers. The BRAFV600E mutation is associated with the more aggressive thyroid tumors. However, the pharmacological inhibition of the MAP kinase pathway, constitutively induced by the BRAFV600E oncogene, is not able to restore alone the expression of NIS in patients with BRAFV600E mutated thyroid cancer. This suggests that other compensatory mechanisms may contribute to the radioresistance. A recent study in a mouse model demonstrated that downregulation of NIS by BRAFV600E oncogene is mediated through the TGF beta activation. An other showed that the expression of NIS is dependent on the redox status of the cell, suggesting a role for the reactive oxygen species (ROS). In cells, ROS can be produced by the NADPH oxidases (NOX/DUOX). The Thyroid gland expresses three of them: DUOX2, which is necessary for the thyroid hormones synthesis, but also DUOX1 and NOX4 whose the physiological role remains unknown. NOX4, which is overexpressed in the PTCs, has been shown to be a new key effector of the TGF beta pathway.In my thesis project, I was interested in studying the role of NOX4 in the negative regulation of NIS in BRAFV600E mutated CPT. The study of the mechanism, made from two human cell lines derived from BRAF-mutated papillary thyroid cancers (BCPAP and 8505C), has revealed that the oncogene BRAFV600E controls the expression of NOX4 at the transcriptional level via the TGF-beta/Smad3 pathway. These results were validated on both a rat thyroid cell line conditionnaly expressing BRAFV600E and on human thyrocytes in primary culture. Importantly, the use of antioxidants such as N-acetyl cysteine (NAC) or specific inhibition of NOX4 expression by RNA interference allow reinduction of NIS expression. These results, which show that ROS produced by NOX4 inhibit the expression of iodine transporter (NIS), establish a link between the oncogene BRAFV600E and NOX4. A comparative analysis of the NOX4 expression, made from 500 papillary thyroid cancers mutated or not for BRAF (TCGA data), confirms that NOX4 is significantly increased in BRAF-mutated cancers and that this is correlated with a decrease of NIS mRNA. Furthermore, the level of NOX4 is inversely related to thyroid differentiation score, suggesting that NOX4 might be involved in the dedifferentiation process. This study opens a new opportunity for optimizing the use of metabolic radiotherapy in the treatment of thyroid cancers refractory to radioiodine I131and makes NOX4 as a potential therapeutic target.