Jaburetox é um peptídeo recombinante (~11 kDa) derivado de uma das isoformas de ureases da planta Canavalia ensiformis, popularmente conhecida como feijão-de-porco. O peptídeo induz efeitos variados em diferentes ordens de insetos, incluindo interferência na contração muscular em baratas da espécie Nauphoeta cinerea, ativação do sistema imunitário do vetor da doença de Chagas, Rhodnius prolixus e também, modula a atividade da enzima UDP-N-acetilglicosamina pirofosforilase (UAP) e da óxido nítrico sintase (NOS) no sistema nervoso central de R. prolixus e Triatoma infestans. Além disso, quando injetado, o Jaburetox é letal para ninfas de R. prolixus e insetos adultos de T. infestans. No presente trabalho foi avaliado o efeito inseticida do Jaburetox em baratas adultas da espécie N. cinerea, assim como, exploramos os efeitos induzidos pelo peptídeo no sistema nervoso central, focando na atividade enzimática das enzimas UAP, NOS, fosfatases ácidas (ACP) e acetilcolinesterase (AChE). Os ensaios enzimáticos foram realizados após tratamentos in vivo e in vitro com o Jaburetox, utilizando homogenatos de sistema nervoso central. Técnicas espectrofotométricas foram utilizadas para mensurar a atividade enzimática e a expressão proteica foi avaliada através de Western blot. Para o ensaio inseticida, Jaburetox foi administrado via oral e via injeção no inseto, utilizando uma dose de 50 μg de Jaburetox por g de inseto, ou o mesmo volume de tampão como controle. Em N. cinerea, ambos os tratamentos, in vivo e in vitro, inibiram parcialmente a atividade da NOS, sem modificar os níveis proteicos da mesma. Nenhuma alteração foi observada nos níveis da ACP após tratamentos com Jaburetox. A enzima UAP apresentou diminuição da atividade após 18 h de tratamento in vivo com o Jaburetox. Além disso, em todos os tratamentos in vivo com o peptídeo foi observado um aumento da atividade da AChE, sugerindo um possível mecanismo de resposta aos inseticidas. Contudo, mesmo após injeção e ingestão de Jaburetox as baratas adultas não tiveram taxas de mortalidade significativas, indicando resistência ao efeito inseticida do peptídeo. Em suma nossos resultados sugerem que o Jaburetox afeta as vias nitrinérgica, assim com a atividade da UAP e da AChE na barata. O fato do peptídeo afetar diferentemente as atividades enzimáticas dos R. prolixus e da N. cinerea podem explicar o porquê as baratas não são susceptíveis ao Jaburetox. / Jaburetox is a recombinant peptide (~11 kDa) derived from one of the Canavalia ensiformis (Jack bean) urease isoforms. The peptide induces several effects on insects of different orders, including the interference on muscle twitch tension in the cockroach Nauphoeta cinerea, the activation of the immune system in the Chagas’ disease vector Rhodnius prolixus, and the modulation of the enzyme activities of the UDP-N-acetylglucosamine pyrophosphorylase (UAP) and nitric oxide synthase (NOS) in the central nervous system of R. prolixus and the related triatomine Triatoma infestans. Moreover, when injected, the peptide is lethal for R. prolixus nymphs and T. infestans adults. Here, we evaluated the insecticidal effect of Jaburetox on N. cinerea adult cockroaches and explored the effects induced by Jaburetox on the central nervous system, focusing on the enzymatic activities of UAP, NOS, acid phosphatases (ACP), and acetylcholinesterase (AChE). The enzymatic experiments were performed after in vitro and in vivo treatments with Jaburetox using central nervous system homogenates from adult cockroaches. Spectrophotometric assays were employed to measure the enzyme activities and the protein expression of UAP and NOS was evaluated by Western blot. The insecticidal assay was conducted by injection and ingestion of 50 μg of Jaburetox per g of insect or the same volume of buffer for the controls. In N. cinerea, both in vivo and in vitro treatments with the peptide partially inhibited the activity of NOS, without modifying the protein levels. No alterations on ACP activity were observed upon Jaburetox treatment. In addition, the enzyme activity of UAP only had its activity affected at 18 h after injection. The peptide increased the AChE activity, suggesting a possible mechanism involved in overcoming the toxic effects of the insecticide. Moreover, the cockroaches did not die after Jaburetox injection and ingestion, indicating resistance to the toxic action of the peptide. Taken together, our findings indicate that Jaburetox alters the nitrinergic signaling as well as the AChE and UAP activities. The fact that Jaburetox affects differently the enzyme activities in R. prolixus and N. cinerea may explain why the cockroach is not susceptible to the lethal effect of the peptide.

Ureases, enzimas que catalisam a hidrólise da ureia formando amônia e dióxido de carbono, são sintetizadas por plantas, fungos e bactérias. A espécie leguminosa Canavalia ensiformis, conhecida em inglês como Jack Bean, produz diferentes isoformas de ureases, sendo a chamada Jack Bean Urease (JBU) a isoforma majoritária. Ureases possuem atividade inseticida já comprovada para diferentes espécies de insetos e um dos seus efeitos no animal é o bloqueio neuromuscular. O objetivo deste trabalho foi compreender o mecanismo de ação responsável pela atividade neurotóxica da JBU e pelo bloqueio neuromuscular em insetos. A injeção de JBU em baratas (Nauphoeta cinerea), apesar de não letal, induziu uma inibição da enzima acetilcolinesterase no SNC. A urease, assim como a acetilcolina ou o anticolinérgico neostigmina, também induziu um aumento no ritmo cardíaco das baratas. Insetos tratados com JBU tiveram um aumento no tempo de grooming, efeito comportamental este mimetizado com o tratamento por octopamina. Os resultados acima citados indicam um efeito da JBU no SNC do animal, interferindo com a neurotransmissão colinérgica e octopaminérgica e, possivelmente, também GABAérgica. A atividade de JBU sobre o sistema neuromuscular de insetos também foi estudada através de registros eletrofisiológicos do potencial de ação neural, muscular e de placa motora. Em preparação de músculo tarsal de gafanhoto (Locusta migratoria), a urease reduziu a amplitude do potencial de ação evocado; entretanto quando aplicada diretamente no músculo oviductal isolado, a JBU não alterou a resposta contrátil. Em preparações de placa motora de larvas da mosca-da-fruta Drosophila melanogaster, a urease aumentou a amplitude dos potenciais excitatórios pós-sinápticos (EJPs) e a frequência dos eventos miniaturas (mEJPs). O efeito da JBU sobre a junção neuromuscular de insetos foi reduzido conforme a concentração de cálcio no meio extracelular também foi reduzida e completamente revertido quando o cálcio foi removido do meio (presença de EGTA e cloreto de Co2+), indicando que a mobilidade de íons de cálcio possui um papel importante na toxicidade induzida por JBU no inseto. Experimentos de imagem de cálcio em gânglios de N. cinerea confirmaram um maior influxo de cálcio no neurônio na presença de JBU, indicando que mobilidade do cálcio através da membrana foi alterada. Os resultados obtidos confirmam que a urease induz neurotoxicidade em insetos tanto a nível central como periférico, atuando sobre os gânglios do cordão nervoso, sobre neurônios aferentes e sobre o terminal pré-sináptico de neurônios motores. A neurotoxicidade induzida por JBU aparenta ser dependente do influxo de íons de cálcio no neurônio. / Ureases, enzymes that catalyse the hydrolysis of urea into ammonia and carbon dioxide, are synthesized by plants, fungi and bacteria. The legume Canavalia ensiformis, known as jack bean, produces different isoforms of ureases, being the jack bean urease (JBU) its major isoform. Ureases have insecticidal activity against different insect species and one of effects induced by JBU is a neuromuscular blockage. The aim of this work is to further understand the mechanism of action behind this blockage. The injection of JBU into cockroaches (Nauphoeta cinerea), despite not lethal, caused inhibition of brain acetylcholinesterase enzyme. Urease, as well as acetylcholine or the anticholinesterase drug neostigmine, induced a positive cardiac chronotropism in cockroaches. Similar to octopamine, JBU induced an increase in the time spent on grooming behaviour. These results indicate that JBU may act on the central nervous system of the animal by interfering with neurotransmission, more specifically on the cholinergic, octopaminergic and, possibly, GABAergic pathways. The activity of JBU on the neuromuscular junction of insects was studied through electrophysiological recordings. On the tarsus muscle of locust (Locusta migratoria), JBU reduced the amplitude of evoked muscle potentials, but did not alter the contractile response when applied to the oviduct muscle isolated. When applied on the end-plate of flies (Drosophila melanogaster) JBU led to an increase in the amplitude of Excitatory Junctional Potentials (EJPs), as well as to higher frequency of miniature Excitatory Junctional Potentials (mEJPs). JBU’s effect on the neuromuscular junction was reduced when the extracellular calcium concentrations decreased, and it was completely reversed when in calcium free preparations (in the presence of EGTA and Cobalt chloride), indicating that calcium mobility may play an important role in JBU-induced toxicity. Calcium imaging of cockroach ganglions revealed increased calcium influx upon exposition to JBU. These results indicate that JBU induces a central and peripheral neurotoxicity in insects, by interfering on neurotransmitters release or signalling in the ventral nerve cord, in the afferent neurons and in the motor neurons. Moreover, JBU-induced neurotoxicity depends on the influx of calcium ions into the neurons.

Ureases, enzimas que catalisam a hidrólise da ureia formando amônia e dióxido de carbono, são sintetizadas por plantas, fungos e bactérias. A espécie leguminosa Canavalia ensiformis, conhecida em inglês como Jack Bean, produz diferentes isoformas de ureases, sendo a chamada Jack Bean Urease (JBU) a isoforma majoritária. Ureases possuem atividade inseticida já comprovada para diferentes espécies de insetos e um dos seus efeitos no animal é o bloqueio neuromuscular. O objetivo deste trabalho foi compreender o mecanismo de ação responsável pela atividade neurotóxica da JBU e pelo bloqueio neuromuscular em insetos. A injeção de JBU em baratas (Nauphoeta cinerea), apesar de não letal, induziu uma inibição da enzima acetilcolinesterase no SNC. A urease, assim como a acetilcolina ou o anticolinérgico neostigmina, também induziu um aumento no ritmo cardíaco das baratas. Insetos tratados com JBU tiveram um aumento no tempo de grooming, efeito comportamental este mimetizado com o tratamento por octopamina. Os resultados acima citados indicam um efeito da JBU no SNC do animal, interferindo com a neurotransmissão colinérgica e octopaminérgica e, possivelmente, também GABAérgica. A atividade de JBU sobre o sistema neuromuscular de insetos também foi estudada através de registros eletrofisiológicos do potencial de ação neural, muscular e de placa motora. Em preparação de músculo tarsal de gafanhoto (Locusta migratoria), a urease reduziu a amplitude do potencial de ação evocado; entretanto quando aplicada diretamente no músculo oviductal isolado, a JBU não alterou a resposta contrátil. Em preparações de placa motora de larvas da mosca-da-fruta Drosophila melanogaster, a urease aumentou a amplitude dos potenciais excitatórios pós-sinápticos (EJPs) e a frequência dos eventos miniaturas (mEJPs). O efeito da JBU sobre a junção neuromuscular de insetos foi reduzido conforme a concentração de cálcio no meio extracelular também foi reduzida e completamente revertido quando o cálcio foi removido do meio (presença de EGTA e cloreto de Co2+), indicando que a mobilidade de íons de cálcio possui um papel importante na toxicidade induzida por JBU no inseto. Experimentos de imagem de cálcio em gânglios de N. cinerea confirmaram um maior influxo de cálcio no neurônio na presença de JBU, indicando que mobilidade do cálcio através da membrana foi alterada. Os resultados obtidos confirmam que a urease induz neurotoxicidade em insetos tanto a nível central como periférico, atuando sobre os gânglios do cordão nervoso, sobre neurônios aferentes e sobre o terminal pré-sináptico de neurônios motores. A neurotoxicidade induzida por JBU aparenta ser dependente do influxo de íons de cálcio no neurônio. / Ureases, enzymes that catalyse the hydrolysis of urea into ammonia and carbon dioxide, are synthesized by plants, fungi and bacteria. The legume Canavalia ensiformis, known as jack bean, produces different isoforms of ureases, being the jack bean urease (JBU) its major isoform. Ureases have insecticidal activity against different insect species and one of effects induced by JBU is a neuromuscular blockage. The aim of this work is to further understand the mechanism of action behind this blockage. The injection of JBU into cockroaches (Nauphoeta cinerea), despite not lethal, caused inhibition of brain acetylcholinesterase enzyme. Urease, as well as acetylcholine or the anticholinesterase drug neostigmine, induced a positive cardiac chronotropism in cockroaches. Similar to octopamine, JBU induced an increase in the time spent on grooming behaviour. These results indicate that JBU may act on the central nervous system of the animal by interfering with neurotransmission, more specifically on the cholinergic, octopaminergic and, possibly, GABAergic pathways. The activity of JBU on the neuromuscular junction of insects was studied through electrophysiological recordings. On the tarsus muscle of locust (Locusta migratoria), JBU reduced the amplitude of evoked muscle potentials, but did not alter the contractile response when applied to the oviduct muscle isolated. When applied on the end-plate of flies (Drosophila melanogaster) JBU led to an increase in the amplitude of Excitatory Junctional Potentials (EJPs), as well as to higher frequency of miniature Excitatory Junctional Potentials (mEJPs). JBU’s effect on the neuromuscular junction was reduced when the extracellular calcium concentrations decreased, and it was completely reversed when in calcium free preparations (in the presence of EGTA and Cobalt chloride), indicating that calcium mobility may play an important role in JBU-induced toxicity. Calcium imaging of cockroach ganglions revealed increased calcium influx upon exposition to JBU. These results indicate that JBU induces a central and peripheral neurotoxicity in insects, by interfering on neurotransmitters release or signalling in the ventral nerve cord, in the afferent neurons and in the motor neurons. Moreover, JBU-induced neurotoxicity depends on the influx of calcium ions into the neurons.

Ureases, enzimas que catalisam a hidrólise da ureia formando amônia e dióxido de carbono, são sintetizadas por plantas, fungos e bactérias. A espécie leguminosa Canavalia ensiformis, conhecida em inglês como Jack Bean, produz diferentes isoformas de ureases, sendo a chamada Jack Bean Urease (JBU) a isoforma majoritária. Ureases possuem atividade inseticida já comprovada para diferentes espécies de insetos e um dos seus efeitos no animal é o bloqueio neuromuscular. O objetivo deste trabalho foi compreender o mecanismo de ação responsável pela atividade neurotóxica da JBU e pelo bloqueio neuromuscular em insetos. A injeção de JBU em baratas (Nauphoeta cinerea), apesar de não letal, induziu uma inibição da enzima acetilcolinesterase no SNC. A urease, assim como a acetilcolina ou o anticolinérgico neostigmina, também induziu um aumento no ritmo cardíaco das baratas. Insetos tratados com JBU tiveram um aumento no tempo de grooming, efeito comportamental este mimetizado com o tratamento por octopamina. Os resultados acima citados indicam um efeito da JBU no SNC do animal, interferindo com a neurotransmissão colinérgica e octopaminérgica e, possivelmente, também GABAérgica. A atividade de JBU sobre o sistema neuromuscular de insetos também foi estudada através de registros eletrofisiológicos do potencial de ação neural, muscular e de placa motora. Em preparação de músculo tarsal de gafanhoto (Locusta migratoria), a urease reduziu a amplitude do potencial de ação evocado; entretanto quando aplicada diretamente no músculo oviductal isolado, a JBU não alterou a resposta contrátil. Em preparações de placa motora de larvas da mosca-da-fruta Drosophila melanogaster, a urease aumentou a amplitude dos potenciais excitatórios pós-sinápticos (EJPs) e a frequência dos eventos miniaturas (mEJPs). O efeito da JBU sobre a junção neuromuscular de insetos foi reduzido conforme a concentração de cálcio no meio extracelular também foi reduzida e completamente revertido quando o cálcio foi removido do meio (presença de EGTA e cloreto de Co2+), indicando que a mobilidade de íons de cálcio possui um papel importante na toxicidade induzida por JBU no inseto. Experimentos de imagem de cálcio em gânglios de N. cinerea confirmaram um maior influxo de cálcio no neurônio na presença de JBU, indicando que mobilidade do cálcio através da membrana foi alterada. Os resultados obtidos confirmam que a urease induz neurotoxicidade em insetos tanto a nível central como periférico, atuando sobre os gânglios do cordão nervoso, sobre neurônios aferentes e sobre o terminal pré-sináptico de neurônios motores. A neurotoxicidade induzida por JBU aparenta ser dependente do influxo de íons de cálcio no neurônio. / Ureases, enzymes that catalyse the hydrolysis of urea into ammonia and carbon dioxide, are synthesized by plants, fungi and bacteria. The legume Canavalia ensiformis, known as jack bean, produces different isoforms of ureases, being the jack bean urease (JBU) its major isoform. Ureases have insecticidal activity against different insect species and one of effects induced by JBU is a neuromuscular blockage. The aim of this work is to further understand the mechanism of action behind this blockage. The injection of JBU into cockroaches (Nauphoeta cinerea), despite not lethal, caused inhibition of brain acetylcholinesterase enzyme. Urease, as well as acetylcholine or the anticholinesterase drug neostigmine, induced a positive cardiac chronotropism in cockroaches. Similar to octopamine, JBU induced an increase in the time spent on grooming behaviour. These results indicate that JBU may act on the central nervous system of the animal by interfering with neurotransmission, more specifically on the cholinergic, octopaminergic and, possibly, GABAergic pathways. The activity of JBU on the neuromuscular junction of insects was studied through electrophysiological recordings. On the tarsus muscle of locust (Locusta migratoria), JBU reduced the amplitude of evoked muscle potentials, but did not alter the contractile response when applied to the oviduct muscle isolated. When applied on the end-plate of flies (Drosophila melanogaster) JBU led to an increase in the amplitude of Excitatory Junctional Potentials (EJPs), as well as to higher frequency of miniature Excitatory Junctional Potentials (mEJPs). JBU’s effect on the neuromuscular junction was reduced when the extracellular calcium concentrations decreased, and it was completely reversed when in calcium free preparations (in the presence of EGTA and Cobalt chloride), indicating that calcium mobility may play an important role in JBU-induced toxicity. Calcium imaging of cockroach ganglions revealed increased calcium influx upon exposition to JBU. These results indicate that JBU induces a central and peripheral neurotoxicity in insects, by interfering on neurotransmitters release or signalling in the ventral nerve cord, in the afferent neurons and in the motor neurons. Moreover, JBU-induced neurotoxicity depends on the influx of calcium ions into the neurons.

The trade-off between gametes and soma is central to life-history evolution. Oosorption has been proposed as a mechanism that can mediate this trade-off. When conditions are not conducive to successful reproduction, females are expected to be able to recoup nutrients from unfertilized oocytes and reinvest them into the somatic processes that promote survival and hence future reproduction. Although positive correlations between oocyte degradation and lifespan have been documented in oviparous insects, the adaptive significance of this process in species with more complex reproductive biology has not been explored. Oocyte degradation via apoptosis (programmed cell death) occurs in response to enforced virginity in females of the ovoviviparous cockroach, Nauphoeta cinerea. Observed apoptosis may represent oosorption, however, an alternative but not mutually exclusive argument is that oocyte apoptosis may represent oocyte ageing and clearance in order to maintain reproductive synchrony. The aim of this thesis was to test the hypothesis that the function of oocyte apoptosis is oosorption in N. cinerea. I found that in addition to enforced virginity, starvation induces oocyte apoptosis. However, the life history outcome following one form of stress is the opposite of the other. Hence, the functional role of oocyte apoptosis appears to be different depending on whether apoptosis is induced through starvation or age. Following a period of starvation-induced apoptosis females exhibit the increase in survival and future reproduction predicted by oosorption. Whereas, following a period of age-induced apoptosis females suffer fecundity and longevity cuts. However, age-induced apoptosis does not appear to simply be cellular ageing and clearance. In conjugation with age-induced apoptosis, ovariole number declines whilst the size of surviving oocytes increases. Hence, it appears that resources from sacrificed oocytes are being recycled into the survivors, and that this reinvestment in current reproduction trade-offs with future reproductive capacity. My thesis shows the importance of studying proximal mechanisms alongside more traditional measures of life history, as the relationship between isolated biological levels is not always clear.

The aim of this thesis was to find out whether selected types of food substrates affect the adult´s productivity, the weight of newborn nymphs and laid oothecas and whether changes in adult´s productivity and the weight of nymphs occur due to one source of food during the experiment. In this experiment, the Blaptica dubia, Nauphoeta cinerea and Schelfordella tartara species were used. The reason for selection of those species was their high rate of reproduction, undemanding breeding and a short period of growth. The experiment was conducted in six types of feed substrates. The cockroaches were kept at a room temperature. The scales accurate to 0,2 g were used for the determination of the weight (AVINET). The Blaptica dubia species proved the dependence of its adults´ productivity and nymphs´ weight on the month of observation and the dependence of nymphs´ growth on a feed. The Nauphoeta cinerea species proved the dependence of nymphs´ growth on a feed. The Schelfordella tartara species proved the dependence of its adults´ productivity and oothecas´ weight on a feed and on the month of observation. The results of this thesis could emphasize the importance of the influence of a feed on the life of cockroaches breeded in captivity and help breeders to their better results with regard to the selection of a suitable food.