There are more than 500,000 new cases of uterine cervical cancer (CCU) worldwide, which is the second most common cancer among women, and the second leading cause of death among women aged between 14 and 44 years. There is a known relationship between the CCU and the presence of human papillomavirus (HPV). In Brazil, one in four sexually active women are infected with HPV (in the Northeast, one in three), resulting in 19 cases of uterine cancer per 100,000 inhabitants. Laboratory evidence shows that, at present, preventive molecular test HPV-linked cancer through the detection and typing of viral DNA, may be associated with reduced mortality between men and women infected with HPV. It is known that there is a discrepancy between the histological and cytomorphological detection of HPV lesions in routine tests, so the molecular test is very important in this scenario. Thus, this study aimed to determine the HPV prevalence and the socio-demographic profile of infected women in State of Alagoas, hence propose a low cost kit for the more prevalent high risk HPV detection. Cervical samples from women living in the state of Alagoas - Brazil were assessed; these patients were submitted to a questionnaire and signed the free and informed consent form, through which we could collect information relating to the main co-factors commonly associated with the development of cervical lesions. Genomic DNA extraction was performed according to Illustra kit methodology (Asmersham Biosciences), while the DNA concentration in each sample was estimated using spectrophotometry. Viral evidence was obtained by PCR amplification of a 450bp viral DNA region (L1 gene) using the degenerate primers MY09 and MY11 We used the co-amplification of human β- globin gene (268 bp) as positive control, through GH20 and PC04 primers, and human DNA without HPV as negative control. The expected size PCR products were sequenced automatically. To identify the virus type, the sequences were aligned and compared with others using the Blastn tool in NCBI (National Center for Biotechnology Information). From the 757 samples analyzed, 123 (16.3%) were positive for HPV. There was a prevalence of high-risk HPV types (58,5%), with 12,3% HPV 16 positive samples. Individually, the most frequent type was the HPV 6 (21.5%), considered low risk. Regarding the co-factors, it was observed significant difference in the age of the patients; number of partners; number of children; and being pregnant at the time of data collection. The proposed kit will enable detection of the main oncogenic types present in the state by multiplex PCR analysis. The primers used responded well to the established analysis. Further steps are being taken towards the implementation of a commercial test kit. / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Mundialmente ocorrem mais de 500 mil novos casos de câncer cervical uterino (CCU) por ano, sendo a terceira neoplasia mais comum entre mulheres, e a segunda causa de morte na faixa etária entre 14 e 44 anos. Há uma conhecida associação entre CCU e a presença do papilomavírus humano (HPV). No Brasil, uma em cada quatro mulheres sexualmente ativas está infectada pelo HPV (no Nordeste, uma em três), resultando em 19 casos de câncer uterino por 100 mil habitantes. Evidências laboratoriais revelam que a detecção e tipagem do DNA viral para prevenção do câncer causado por HPV, pode estar associado à redução da mortalidade entre pacientes infectados. Sabe-se que há discrepância entre os resultados citomorfológicos e histológicos na detecção de lesões por HPV nos exames rotineiros, por isso o teste molecular assume grande importância. O presente trabalho teve como objetivos definir a prevalência do HPV no Estado de Alagoas e o perfil sociodemográfico das mulheres infectadas, com o intuito de propor um “kit” de baixo custo para detecção dos HPV de alto risco mais prevalentes. Amostras cervicais de mulheres residentes no Estado foram analisadas; as pacientes foram submetidas a um questionário, para a coleta de informações referentes aos principais cofatores comumente associados ao desenvolvimento de lesões cervicais. A extração do DNA genômico foi realizada conforme metodologia do kit Illustra (Asmersham Biosciences), enquanto a concentração de DNA em cada amostra foi estimada através de espectrofotometria. A comprovação da presença viral foi feita por PCR, através da amplificação de uma região de 450pb do DNA viral (gene L1), com iniciadores degenerados MY09 e MY11. Como controle positivo utilizou-se a co-amplificação do gene humano β-globina (268 pb) com os iniciadores GH20 e PC04, além de um controle negativo, DNA humano sem HPV. Os produtos de PCR foram sequenciados automaticamente. Para identificar o tipo viral, as sequências foram alinhadas e comparadas a outras utilizando-se a ferramenta Blastn no NCBI (National Center for Biotechnology Information). Foi possível estabelecer que das 757 amostras analisadas 123 (16,3%) foram positivas para HPV. Houve prevalência dos tipos de HPV de alto risco (58,5%), sendo o HPV16 observado em 12,3% das amostras positivas. O HPV de maior frequência foi o HPV 6 (21,5%), considerado de baixo risco. Sobre os cofatores, pôde-se observar diferença significativa em relação à idade das pacientes; número de parceiros; número de filhos; e ser gestante no momento da coleta de dados. O kit de detecção proposto possibilitará a determinação dos principais tipos oncogênicos presentes no Estado por PCR multiplex. Os iniciadores utilizados responderam bem às análises estabelecidas. Novas etapas se fazem necessárias para implementação do “kit”.

Made available in DSpace on 2014-07-29T15:30:36Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Dissertacao Andrea Alves Ribeiro.pdf: 1577076 bytes, checksum: 24bc7ace843786b03ff879da0df4f7aa (MD5) Previous issue date: 2009-12-15 / Human papillomavirus (HPV) is considered the central etiological agent involved in the genesis of cervical cancer. The HPV viruses are classified according to their biological niche, oncogenic potential and phylogenetic position. According to the criteria established by the International Committee on Taxonomy of Viruses (ICTV), the various groups of human papillomaviruses that infect the female genital tract are classified phylogenetically in the Alphapapillomavirus genus, including species classified among phylogenetic species 1 and species 15. The main high risk HPV are classified in species 9 (HPV 16, 31, 33, 35, 52, 58, 67), and in species 7 (18, 39, 45, 59, 56, 66, 68 and 70). HPV 16 is the most prevalent type irrespective of diagnosis, principally in more severe lesions. Coinfection with multiple-types HPV is a common finding of many molecular studies. Some HPV types might interact or act synergistically to induce progression. Few studies have investigated the interactions of viral genotypes or species in multiple-type HPV infections. Therefore, the objective of this study was to evaluate the effect of single or multiple-types HPV infections considering also the phylogenetic groups on the prevalence and severity of cervical intraepithelial neoplasia (CIN) among women undergoing colposcopy following a abnormal cervical smear. Methodology: In this analysis, 198 women attending at the colposcopic clinic, because of an abnormal cervical smear were included. Colposcopy was carried out in all cases and biopsies were done in 193 of 198 women included. All specimens were tested for 27 HPV genotypes by Roche s polymerase chain reaction reverse line blot assay. Results: The overall prevalence of HPV in women with an abnormal cervical smear was 86% (171/198). Of the total of HPV-positive women, 45% (77/171) were infected with HPV 16 as a single or multiple-type infections. HPV 31 and 35 were, respectively, the second and third most prevalent types. The prevalence of HPV 16 in high grade cervical intraepithelial neoplasia (CIN2/3) was 52% (40/76) and it was detected in 88.8% (8/9) in cases of invasive carcinoma. The prevalence of type 31 and 35 in high grade CIN was respectively 10.5% (8/76) and 6.6% (5/76). Single HPV infection for any type was significantly associated with neoplastic diagnosis. High grade neoplastic diagnosis (≥ CIN2) was significantly associated with HPV 16 in single or multiple infections. Also, there was significantly association between HPV 16 and others types of specie 9 and high grade neoplastic diagnosis, but no association was observed considering the HPV 16 and other of groups of species 7 or others types. Conclusion: These results indicated that the type 16 is the most important predictor of high grade cervical neoplasia. Multiple-type infections are predictors of high grade cervical neoplasia when the type 16 is present. / O Papilomavírus humano (HPV) é considerado o agente etiológico central envolvido na gênese do câncer cervical. O vírus HPV é classificado de acordo com seu nicho biológico, potencial oncogênico e classificação filogenética. De acordo com os critérios estabelecidos pelo Comitê Internacional de Taxonomia dos Vírus (ICTV), os diversos tipos de HPV que infectam o trato genital feminino são classificados filogeneticamente no gênero Alphapapillomavirus. Esta classificação inclui espécies filogenéticas classificadas entre a espécie 1 e a espécie 15, dentre as quais, as de maior interesse em relação ao potencial carcinogênico são a espécie 9 (HPV 16, 31, 33, 35, 52, 58, 67) e a espécie 7 (18, 39, 45, 56, 59, 66, 68, 70). O HPV 16 é tipo o mais predominante, independente do diagnóstico, presente principalmente nas lesões cervicais mais graves. A co-infecção com múltiplos tipos de HPV é um achado comum em muitos estudos moleculares, contudo, as interações dos genótipos virais ou espécies envolvidas nas infecções por múltiplos tipos de HPV têm sido pouco analisadas. Portanto, o objetivo deste estudo foi avaliar o efeito das infecções simples ou por múltiplos tipos de HPV, considerando também os grupos filogenéticos, sobre a prevalência e a gravidade das neoplasias cervicais. Metodologia: Este estudo de corte transversal incluiu 198 mulheres encaminhadas ao Ambulatório de Colposcopia da Santa Casa de Misericórdia de Goiânia por exame citopatológico anormal. Todas as mulheres foram esclarecidas quanto aos objetivos de estudo e assinaram o termo de consentimento livre e esclarecido. A colposcopia foi realizada em todos os casos e a biópsia em 193 das 198 mulheres incluídas. As amostras foram testadas para 27 genótipos de HPV, por reação em cadeia da polimerase (PCR); em seguida foi realizada a hibridização reversa em pontos da Roche Diagnósticos. Resultados: A prevalência de HPV em mulheres encaminhadas por exame citopatológico anormal foi de 86% (171/198). Do total de mulheres HPV-positivas, 45% (77/171) estavam infectadas por HPV 16 em infecções simples e múltiplas. Os tipos de HPV 31 e 35 foram respectivamente, o segundo e o terceiro mais prevalentes. A prevalência do HPV 16 foi de 52% (40/76) nas neoplasias intra-epiteliais cervicais de alto grau (NIC 2/3) e de 88,8% (8/9) nos casos de carcinomas invasivos. As prevalências dos tipos 31 e 35 em neoplasias intra-epiteliais cervicais de alto grau (NIC 2/3) foram de 10,5% (8/76) e 6,6% (5/76), respectivamente. A infecção simples por qualquer tipo de HPV foi significativamente associada com diagnósticos neoplásicos de alto grau (≥ NIC 2). Os diagnósticos neoplásicos de alto grau (≥ NIC 2) foram significativamente associados com o HPV 16 em infecções simples ou múltiplas, mesmo depois de ajustado pela positividade para DNA de HPV. Houve significativa associação entre o HPV 16 e outros tipos da espécie 9 e os diagnósticos neoplásicos de alto grau (≥ NIC 2), mas não foi observada associação, considerando o HPV 16 e outros tipos da espécies 7 ou outros tipos de HPV. Conclusão: Estes resultados indicam que o HPV 16 parece ser o mais importante preditor de diagnósticos neoplásicos de alto grau. As infecções múltiplas são preditoras das neoplasias cervicais de alto grau quando o HPV 16 está presente.