Zugl.: Luzern, Universiẗat, Diss., 2008.

Tableau d’honneur de la Faculté des études supérieures et postdoctorales, 2010-2011 / Les enképhalines sont une famille de neuropeptides, appartenant à la grande famille des endorphines. Celles-ci furent impliquées dès leurs découvertes dans les réponses physiologiques et comportementales associées à un stress. Les circuits neuronaux enképhalinergiques impliqués dans le stress et l'anxiété demeurent en grande partie méconnus. Cette thèse a pour objectif principal de disséquer ces circuits aux niveaux neuroanatomique et fonctionnel, en mettant l'emphase sur trois structures impliquées dans la réponse de stress et l'anxiété: le complexe amygdalien, les noyaux du lit de la strie terminale (BST), ainsi que le noyau accumbens. Nous avons tout d'abord examiné les afférences enképhalinergiques du complexe amygdalien pour rapporter que ces afférences sont à la fois d'origine intrinsèque (divers noyaux du complexe amygdalien) et extrinsèque (BST, le noyau parabrachial, le noyau ventromedial de l'hypothalamus). Dans l'optique de pouvoir modéliser les circuits enképhalinergiques du complexe amygdalien, nous avons caractérisé le phénotype neurochimique des neurones du complexe amygdalien et du BST. Nous avons précisément décrit la distribution des neurotransmetteurs GABA et glutamate dans ces structures, pour ensuite évaluer la coexpression des enképhalines avec ces neurotransmetteurs. Nous rapportons que les enképhalines sont exprimées par les neurones GABAergiques dans certains noyaux du complexe amygdalien (e.g., le noyau central) et du BST, alors qu'elles sont exprimées uniquement par les neurones glutamatergiques dans d'autres noyaux (e.g., le noyau basolatéral). Ces résultats démontrent l'hétérogénéité neuroanatomique du complexe amygdalien, et permettent également d'émettre des hypothèses précises quant à la circuiterie enképhalinergique impliquée dans la peur et l'anxiété. Dans le but d'étudier le rôle fonctionnel des enképhalines exprimées dans le noyau central de l'amygdale, nous avons injecté localement un vecteur lentiviral induisant une baisse d'expression des enképhalines par la voie d'interférence à l'ARN et soumis les animaux à de multiples tests comportementaux mesurant la peur et l'anxiété. Ces expériences ont démontré qu'une diminution de l'expression des enképhalines dans l'amygdale centrale modulait les niveaux de la peur et de l'anxiété. Pour terminer, nous avons étudié l'expression des enképhalines lors d'une exposition à un stress chronique, et nous avons observé une diminution de l'expression des enképhalines au niveau du noyau accumbens, précisément chez les animaux anhédoniques. Une diminution de l'expression du facteur de transcription [delta]FosB est également observée chez ces animaux. Ce facteur de transcription, tout comme les enképhalines, semble promouvoir la resilience lorsqu'exprimé au niveau du noyau accumbens.

Un dispositif de thermographie par contact permettant une utilisation de liquides a été développé et caractérisé. Une chambre de perfusion a été conçue à même le dispositif et permet le développement d'applications in vitro en neurobiologie. Une résolution thermique de 2,7 mK est obtenue lors d'études sur une tranche d'hippocampe sous perfusion à température ambiante. Sa résolution spatiale (52 um) et sa fréquence d'acquisition (30 Hz) devrait permettre d'enregistrer la composante métabolique de réchauffement entraîné par l'activité cellulaire dans un tissu. Étant donné la dynamique du métabolisme cellulaire, on peut prévoir d'utiliser certaines techniques d'amplification du rapport signal sur bruit. La complémentarité du système d'imagerie thermique développé avec d'autres techniques de mesure est avantageux et les applications variées. Nous avons démontré de façon préliminaire que le capteur pouvait être utilisé afin d'étudier la diffusivité thermique et visualiser les différences structurelles à l'intérieur d'un tissu biologique.

Introduction : La lombalgie modifie le contrôle moteur de la colonne vertébrale. Ces modifications pourraient être expliquées par une plasticité centrale induite par la douleur. Bien qu'il soit connu que la douleur impacte le fonctionnement du cortex moteur primaire, son influence sur les autres systèmes moteurs impliqués dans le contrôle du dos reste peu documentée. L'objectif de ce mémoire était de déterminer l'impact d'un paradigme de douleur lombaire expérimentale sur les différents réseaux neuronaux contrôlant les muscles du dos. Méthode : Trente participants sans atteinte ont été recrutés et répartis en deux groupes : Douleur (capsaïcine+chaleur; n=15) et Contrôle (chaleur seule; n=15)). Différents réseaux neuronaux ont été testés en évaluant les réponses des muscles lumbar erector spinae (LES) avant, pendant et après la douleur. La stimulation magnétique transcrânienne a évalué l'excitabilité corticospinale (potentiel évoqué moteur - MEP) et intracorticale par des stimulations simples et pairées, respectivement. La stimulation vestibulaire électrique (EVS) a évalué l'excitabilité vestibulospinale (VMEP) et le réflexe d'étirement a évalué l'excitabilité spinale (R1) et supraspinale (R2). Les rapports MEP/R1 et VMEP/R1 ont été calculés pour mesurer l'excitabilité corticale et du tronc cérébral. Résultats : Après la disparition de la douleur, l'amplitude de R1 était diminuée pour le groupe Douleur (p=0.008), augmentée pour le groupe Contrôle (interaction Groupe x Temps ; p<0.001) et une différence significative entre les groupes était présente (p<0,0001). Cette diminution d'amplitude de R1 après la douleur était accompagnée d'une augmentation du rapport MEP/R1 (p=0.021). Aucun changement n'était présent pendant la douleur (p>0.05). Conclusion : La diminution d'amplitude de R1 associée à l'augmentation du rapport MEP/R1 après que la douleur ait disparu suggère une modulation opposée des réseaux spinaux et corticaux et reflète la présence d'effets consécutifs à la douleur sur les circuits neuronaux moteurs. D'autres études sont nécessaires pour confirmer ces résultats, notamment chez les populations cliniques. / Introduction: Low back pain modifies spine motor control. These changes could be explained by pain-induced central plasticity. Although it is known that pain impacts the function of the primary motor cortex, its influence on the other motor systems involved in motor control of the spine remains barely studied. The objective of this master's thesis was to determine the impact of an experimental low back pain paradigm on the different neural networks involved in the control of the back muscles. Method: Thirty healthy subjects were recruited and divided into two groups pain (capsaicin + heat - n=15) and Control (heat alone - n=15)). Different neural networks were tested by evaluating the responses of the lumbar erector spinae (LES) muscles before, during and after pain. Transcranial magnetic stimulation assessed corticospinal (motor evoked potential-MEP) and intracortical excitability using single and paired stimulations, respectively. Electrical vestibular stimulation (EVS) assessed vestibulospinal excitability (VMEP) and stretch reflex assessed spinal (R1) and supraspinal (R2) excitability. MEP/R1 and VMEP/R1 ratios were calculated to measure cortical and brainstem excitability. Results: After the disappearance of pain, the amplitude of R1 was decreased for the Pain group (p=0.008) and increased for the Control group (Group x Time interaction; p<0.001) and a significant difference between the groups was present (p<0.0001). This decrease in R1 amplitude after pain was accompanied by an increase in the MEP/R1 ratio (p=0.021). No change was present during pain (p>0.05). Conclusion: The decrease in R1 amplitude associated with the increase in the MEP/R1 ratio after pain disappeared suggests an opposite modulation of spinal and cortical networks and reflects the presence of pain after effect on motor neural circuits. Further studies, including clinical studies, are needed to confirm these findings, especially in clinical populations.

La représentation par réseau est un outil puissant pour la modélisation des systèmes dynamiques complexes. Elle est notamment utilisée en neurosciences pour étudier le cerveau. Cependant, extraire un connectome, soit la liste des neurones et des connexions qui les relient, demeure un défi important pour des cerveaux de plusieurs milliers de neurones. C’est le cas du cerveau de la larve du poisson-zèbre qui contient près d’une centaine de milliers de neurones. Puisque les synapses ne peuvent être directement observées, les connexions entre neurones doivent plutôt être inférées. Plusieurs méthodes classiques, dites d’inférence fonctionnelle, issues des statistiques et de la théorie de l’information, prédisent la connectivité à partir des séries temporelles qui décrivent l’activité des neurones. Plus récemment, des avancées en intelligence artificielle ont ouvert la voie à de nouvelles méthodes d’inférence. L’objectif du projet de maîtrise exposé dans ce mémoire est de comparer la performance des méthodes de l’intelligence artificielle à celle des méthodes bien établies. Puisque la connectivité réelle est nécessaire pour une telle comparaison, un simulateur de réseau de neurones est utilisé pour générer des séries temporelles d’activité à partir de connectivités réelles extraites de vidéos d’activité. Il est montré que la calibration d’un tel simulateur, dans le but d’obtenir de l’activité similaire à celle des poissons-zèbres, n’est pas une tâche triviale. Une approche d’apprentissage profond est donc conçue pour prédire, à partir de métriques d’activité globale, les paramètres de simulation idéaux. Il est ensuite montré, sur 86% des simulations générées, qu’un modèle de réseau de neurones artificiels à convolution performe significativement mieux que les autres méthodes d’inférence. Cependant, lorsqu’un entraînement supervisé est impossible, la méthode classique de transfert d’entropie performe mieux qu’un modèle d’apprentissage profond nonsupervisé sur 78% des simulations générées. / Complex network analysis is a powerful tool for the study of dynamical systems. It is often used in neuroscience to study the brain. However, extraction of complete connectomes, i.e. , the list of all neurons and connections, is still a challenge for large brains. This is the case for the brain of the zebrafish which contains almost a hundred thousand neurons. Since direct observation of synapses is still intractable for a brain of this size, connections between neurons must be inferred from their activity. It is indeed possible to extract time series of activity for all neurons, by making them fluorescent upon activation through genetic engineering and by leveraging the zebrafish’s transparency during the larval stage. Then, so-called methods of functional inference, based on information theory, can be used to predict the connectivity of neurons from time series of their activity. Recent breakthroughs in artificial intelligence have opened the door to new methods of inference. The goal of the project described in this thesis is to compare the performance of such new methods to the performance of well-established ones. Since ground truth of connectivity must be known for comparison, a simulator is used to generate synthetic time series of activity from known connectivity. It is shown that the tuning of such a simulator, in order to generate realistic data, is not an easy task. Therefore, a deep learning approach is proposed to predict optimal simulator parameters by analysis global dynamical metrics. Using the generated time series, it is shown that a convolutional neural network performs significantly better than well-established methods on 86% of simulations. However, in cases where supervised learning is impossible, the zebrafish’s case being an example, the classical method of Transfer Entropy performs better than an unsupervised deep learning model on 78% of simulations.

Percevoir la parole dans le bruit devient difficile en vieillissant. La nature de ces difficultés est incertaine, mais le déclin lié à l’âge de la structure de la voie dorsale de la parole pourrait être un facteur contributif. La pratique du chant choral pourrait aider à ralentir le vieillissement de la voie dorsale de la parole, mais les effets du chant choral sont peu connus. Les objectifs de ce mémoire étaient d’investiguer la relation entre le déclin structurel de la voie dorsale et les difficultés de perception de la parole, et d’identifier comment la pratique du chant choral modifie cette relation. Dans le cadre de ce mémoire, 44 chanteurs et 41 non-chanteurs jeunes et âgés ont complété une séance d’imagerie par résonance magnétique, ainsi que des évaluations cognitives et auditives. Un sous groupe a effectué une tâche de discrimination de syllabes dans le bruit. Dans une première étude, des avantages comportementaux ont été observés pour des chanteurs âgés avec certaines caractéristiques liées à leur pratique, ce qui suggère que le chant bénéficie à la perception de la parole seulement dans certaines conditions. Ces avantages ont été associés à la structure corticale de régions de la voie dorsale de la parole. Dans une deuxième étude, le déclin structurel de segments fronto-temporaux du faisceau arqué, qui constitue l’un des principaux faisceaux de matière blanche de la voie dorsale de la parole, a été associé aux difficultés de perception de la parole. De plus, des différences dans la structure du faisceau arqué ont été identifiées entre les groupes, mais ces différences n’étaient pas associées à la perception de la parole. En somme, ce mémoire apporte de nouvelles connaissances sur la nature des difficultés de perception de la parole, les effets du chant choral sur cette capacité ainsi que les mécanismes neurobiologiques sous-tendant ces effets. / Perceiving speech in noise becomes difficult in aging. The causes of these difficulties are mixed, but age-related decline of the dorsal speech stream may be a contributing factor. The practice of choral singing may help slow brain aging, but the effects of choral singing are not well known. The objectives of this master’s thesis were to investigate the relationship between the structural decline of the dorsal speech stream and difficulties in speech perception, and to identify how this relationship is modified by the practice of choral singing. 44 singers and 41 non-singers, young and old, completed a magnetic resonance imaging session, as well as cognitive and auditory assessments. A subgroup completed a syllable discrimination in noise task. In the first study, behavioural benefits were observed for older singers with certain characteristics related to their practice, suggesting that choral singing has the potential to benefit speech perception only under certain conditions. These benefits were particularly associated with the structure of regions of the dorsal speech stream. In a second study, the decline in the structure of several frontotemporal segments of the arcuate fasciculus,one of the main white matter fasciculi constituting the dorsal speech stream, was associated with the decline in speech perception. In addition, differences in structural asymmetry of the arcuate fasciculus were identified between groups, but these differences were not related to speech perception. In sum,these studies clarify the origin of speech perception difficulties in noise, the effects of choral singing on this ability, and the mechanisms underlying these effects.

In einer vorangegangenen Arbeit konnte eine hypomorphe Mutation innerhalb des Genlokus einer putativen Serin-/Threonin-Kinase als Auslöser der Aggregatbildung des Aktive-Zone- Proteins Bruchpilot in larvalen Motoneuronaxonen identifiziert werden (Nieratschker, 2004). Aufgrund der Homologien dieser Kinase zu SR-Proteinkinasen wurde der Name Serin- /Threonin-Proteinkinase 3 (SRPK3) vorgeschlagen. Laut ursprünglicher Annotation der „Flybase“ (http://flybase.bio.indiana.edu) codiert der Genlokus der Srpk3, der auf dem linken Arm des dritten Chromosoms innerhalb der Region 79D4 lokalisiert ist und sich über ca. 10,3 kb erstreckt, für zwei Transkripte (Srpk3-RC und Srpk3-RB). Diese beiden Transkripte haben unterschiedliche Transkriptions- und Translationsstartpunkte und unterscheiden sich in ihrem ersten kodierenden Exon, ab dem vierten Exon sind sie allerdings identisch. Das Srpk3-RCTranskript umfasst ca. 4,2 kb, das Srpk3-RB-Transkript ca. 3,8 kb. Die von diesen Transkripten kodierten Proteine bestehen aus 816 (Srpk3-RC) bzw. 749 (Srpk3-RB) Aminosäuren. Diese beiden ursprünglich annotierten Transkripte konnten durch RT-PCR-Experimente bestätigt werden. Dabei wurde auch ein zusätzliches, alternativ gespleißtes Exon von 159 bp entdeckt, das beiden Transkripten zugeordnet werden kann. Somit codiert der Srpk3-Genlokus für mindestens vier Transkripte, die Transkripte der RC/RF-Transkriptgruppe mit (Srpk3-RF) und ohne (Srpk3-RC) das alternativ gespleißte Exon und die Transkripte der RB/RETranskriptgruppe mit (Srpk3-RE) und ohne (Srpk3-RB) das alternativ gespleißte Exon. Die Existenz eines weiteren Transkriptes Srpk3-RD, die in der aktuellen Version der „Flybase“ annotiert ist, konnte durch RT-PCR-Experimente nicht nachgewiesen werden. Zu Beginn dieser Arbeit lag eine hypomorphe Mutante für die SRPK3 schon vor (Srpk3P1; Eberle, 1995). Diese Linie trägt eine P-Elementinsertion innerhalb des ersten Exons der RC/RF-Transkriptgruppe, die das Leseraster dieser Transkriptgruppe zerstört, so dass in dieser Linie nur die RB/RE-Transkriptgruppe gebildet werden kann. Wie bereits erwähnt, konnte diese Mutation in vorangegangenen Arbeiten bereits als der Auslöser der Aggregatbildung des Bruchpilot-Proteins in larvalen Motoneuronaxone, sowie einiger Verhaltensdefekte identifiziert werden (Nieratschker, 2004; Bock 2006). Diese Verhaltensdefekte ähneln stark denen, die durch einen knock-down der Bruchpilot-Expression mittels RNAi ausgelöst werden (Wagh et al., 2006; Bock, 2006), was auf eine Interaktion beider Proteine schließen lässt. Um nun den Beweis führen zu können, dass tatsächlich diese Mutation die beobachteten Phänotypen verursacht, wurden Rettungsversuche durchgeführt. Die Srpk3-RF-cDNA war dabei in der Lage die durch die hypomorphe Mutation der SRPK3 verursachten Phänotypen vollständig, oder zumindest teilweise zu retten (vgl. auch Bock, 2006; Bloch, 2007). Damit konnte belegt werden, dass die hypomorphe Mutation der SRPK3 tatsächlich die in der Mutante Srpk3P1 beobachteten Phänotypen verursacht. Um die durch in situ Hybridisierung erhaltenen Daten zur Lokalisation der SRPK3 im larvalen Gehirn (Nieratschker, 2004) bestätigen, sowie weitere Daten erhalten zu können, wurden Isoform-spezifische Antisera gegen die SRPK3 generiert. Diese Antiseren sind in der Lage überexprimiertes Protein zu detektieren (Bloch, 2007), allerdings ist es mit diesen Antiseren nicht möglich die SRPK3 in wildtypischen Präparaten nachzuweisen. Weitere Daten zur Lokalisation der SRPK3, die durch die Verwendung eines SRPK3-eGFPFusionsproteins erhalten wurden, zeigten, dass eine der ektopisch überexprimierten SRPK3- Isoformen mit Bruchpilot an der Aktiven Zone kolokalisiert. Dieses Ergebnis, in Verbindung mit den durch die Mutation der SRPK3 verursachten Bruchpilot-Aggregaten in larvalen Motoneuronaxonen und den Verhaltensdefekten, gibt Hinweise auf eine mögliche direkte Interaktion beider Proteine…. / In a previous study, a hypomorphic mutation in the gene locus of a putative serine-/threonine kinase was found to cause aggregates of the active zone protein Bruchpilot in larval motoneuron axons (Nieratschker, 2004). Because of its high homology to SR-protein kinases this gene was named serine-/threonine protein kinase 3 (Srpk3). The 10,3 kb large Srpk3 gene locus is located on the left arm of the third chromosome in the chromosomal region 79D4. According to an earlier annotation in “flybase” (http://flybase.bio.indiana.edu) the Srpk3 gene codes for two transcripts of 4,2 (Srpk3-RC) and 3,8 kb (Srpk3-RB). These two transcripts use different transcription and translation start sites, but from the fourth exon on they are identical. The Srpk3-RC and Srpk3-RB transcripts code for proteins of 816 and 749 amino acids respectively. The existence of these two originally annotated transcripts could be verified by RT-PCR. In addition, an alternatively spliced exon of 159 bp was identified, which is part of both groups of transcripts (Srpk3-RF and Srpk3-RE). Therefore the Srpk3 gene locus codes for at least four transcripts. Srpk3-RB and Srpk3-RC do not contain the newly identified, alternatively spliced exon, whereas Srpk3-RF and Srpk3-RE do. The existence of another transcript (Srpk3- RD) annotated in the current version of “flybase” could not be confirmed by RT-PCR experiments. The hypomorphic BRPK mutant Srpk3P1, which has a P-element insertion in the first exon of the RC/RF group of transcripts that destroys the open reading frame of those isoforms, already existed (Eberle, 1995). Therefore in that line only the RB/RE isoforms are expressed. That hypomorphic mutation was found to cause Bruchpilot aggregates in larval motoneuron axons (Nieratschker, 2004) and in addition several behavioral deficits (Bock, 2006). The behavioral deficits are similar to those caused by a genetic knock-down of the Bruchpilot expression using RNAi (Wagh et al., 2006; Bock, 2006). This observation points towards an exclusive interaction of both proteins. To prove that in fact the mutation of the SRPK3 causes the observed phenotypes, rescue experiments were performed. We were able to revert the mutant phenotypes by expressing the Srpk3-RF cDNA in the nervous system (see also Bock, 2006; Bloch, 2007). Therefore mutation of the SRPK3 indeed causes the observed phenotypes in the hypomorphic BRPK mutant (Srpk3P1). To confirm the data obtained by in situ hybridization on larval brains (Nieratschker, 2004) and to gain more knowledge regarding the localization of the SRPK3, isoform specific antisera have been generated. These antisera recognize over-expressed protein (Bloch, 2007), but they are not able to recognize SRPK3 in wild type animals. Further data about localization of SRPK3 could be provided by using ectopically overexpressed GFP-tagged SRPK3 isoforms. SRPK3-GFP colocalizes with Bruchpilot at the presynaptic active zone. This result along with the Bruchpilot aggregates in larval motoneuron axons and the behavioral deficits of SRPK3 mutants provide further evidence for a possible interaction of both proteins. To investigate, if a complete loss of SRPK3 expression alters the phenotypes observed in the hypomorphic SRPK3 mutant, a SRPK3 null mutant was generated by jump-out mutagenesis. The phenotypic analyses performed with the hypomorphic line Srpk3P1were repeated with the SRPK3 null mutant. It became obvious that the phenotypes were not enhanced by complete loss of SRPK3 expression (also see Bloch, 2007). Regarding the Bruchpilot aggregates in larval motoneuron axons, no significant differences between hypomorphic mutant and null mutant were observed, however behavioral deficits seem to be more severe in the hypomorph (Bloch, 2007)…..

Die Spinale Muskelatrophie (SMA) ist eine häufige autosomal-rezessiv vererbte Erkrankung des motorischen Nervensystems bei Kindern. Ursache der Degeneration von spinalen Motoneuronen ist der homozygote Verlust des SMN- (survival of motoneuron) Gens und ein dadurch bedingter Mangel an SMN-Protein. Untersuchungen an Motoneuronen von Smn-defizienten Mäusen ergaben Störungen des axonalen Längenwachstums aufgrund einer Fehlverteilung des Zytoskelettproteins beta-Aktin und seiner mRNA in den Axonterminalen. Das Axonwachstum wird durch Aktin-Polymerisierung im Wachstumskegel gesteuert. beta-Aktin-mRNA findet sich auch in Axonen, und die lokale Proteinsynthese kann durch neuronale Aktivierung gesteigert werden. Das SMN-Protein ist am axonalen Transport von beta-Aktin beteiligt. In der vorliegenden Arbeit ergaben Western Blot-Analysen in neuralen Stammzellen (NSC) sowie spinalen Motoneuronen in vitro eine Steigerung der SMN-Proteinexpression durch 8-CPT-cAMP. Zur Untersuchung der Auswirkungen der erhöhten SMN-Proteinmenge auf die Pathologie der Motoneurone wurde ein in-vitro-Assay entwickelt, mit dessen Hilfe gezeigt werden konnte, dass eine Behandlung mit 100 µM 8-CPT-cAMP die axonalen Veränderungen isolierter embryonaler Smn-defizienter Motoneurone kompensieren kann. Motoneurone von 14 Tage alten Smn-defizienten und Kontroll-Mausembryonen wurden über sieben Tage hinweg auf einer Matrix aus Poly-Ornithin und Laminin-111 bzw. Laminin-121/221 kultiviert und mit 100µM cAMP und neurotrophen Faktoren behandelt. Nach Fixierung wurden die Zellen mit Antikörpern gegen Islet-1/2, tau und beta-Aktin gefärbt, mit Hilfe eines konfokalen Mikroskops fotografiert und digital vermessen. 8-CPT-cAMP erhöht den beta-Aktin-Gehalt in den axonalen Wachstumskegeln von Smn-defizienten Motoneuronen. Die Größe der Wachstumskegel nimmt durch die Behandlung um das 2-3fache zu und erreicht normale Werte. Auf Laminin-111 bleibt das Längenwachstum der Axone durch 100µM 8-CPT-cAMP unbeeinflusst, auf Laminin-121/221 wird das Längenwachstum normalisiert. Die beta-Aktin-Verteilung innerhalb der Axone und Wachstumskegel von Smn-defizienten Motoneuronen erscheint durch die cAMP-Behandlung nahezu normalisiert. Die Wiederherstellung der beta-Aktin-Verteilung in Wachstumskegeln durch cAMP kann große Auswirkungen auf die Funktionalität der Motoneurone haben. Die Ergebnisse sind möglicherweise ein erster Schritt auf dem Weg zu einer Therapie für die Spinale Muskelatrophie. / Spinal muscular atrophy (SMA) is an autosomal recessive disorder characterized by loss of alpha-motoneurons in the spinal chord due to low levels of the survival motor neuron (SMN) protein. The genetic cause is the homozygous loss or mutation of the telomeric SMN1 gene and retention of the centromeric SMN2 gene, whose transcripts consist of about 90% truncated and unstable and only 10% functional protein. Motoneurons of Smn-deficient SMN2 transgenic mouse embryos cultured on laminin-1 show abnormalities compared to wildtype controls such as shorter axons, smaller growth cones and a ß-actin protein and mRNA deficit in the distal part of the axon. ß-actin plays a major role in growth cone motility and transmitter release at the presynapse. In addition, SMN works in a complex to transport ß-actin mRNA, which is known to be localized and locally translated in axons and growth cones, along the axon. Local ß-actin protein synthesis can be stimulated by increased neuronal activation. We determined the effects of cAMP on ß-actin localisation in axons as well as on axonal growth parameters in Smn-deficient primary motoneurons. Motoneurons of 14 days old Smn-/-, SMN2 transgenic and wildtype mouse embryos were cultured on laminin for 7 days with 100µM 8-CPT-cAMP and neurotrophic factors BDNF and CNTF. Fluorescence staining and digital measurements revealed a major effect of cAMP treatment on ß-actin distribution and growth cone size, which were restored to normal. Neurite lengths on laminin-111 remained unaffected but were normalized on substrate containing a synapse-specific ß2-laminin isoform. Western blots with neural stem cells (NSC) and heterozygous Smn+/-; SMN2 transgenic motoneurons treated with 100µM cAMP showed a marked upregulation of Smn protein expression. These data point to an important role for cAMP as a possible target of SMA drug therapy.

Le suivi des interactions entre protéines, localisées à la membrane plasmique ou à l'intérieur de cellules, a été réalisé au cours de cette thèse par imagerie de fluorescence et par l'analyse de processus dits de FRET (Forster Resonance Energy Transfer). Pour quantifier le FRET entre nos protéines d'intérêt, nous avons choisi le contraste de durée de vie de fluorescence car cette méthode est indépendante de la concentration et de l'intensité de fluorescence. Afin d'obtenir une résolution suffisante pour des problématiques neurobiologiques, un microscope TIRFLIM (Total Internal Reflection Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy) avait préalablement été développé. Celui-ci nous permet de faire de l'imagerie en plein champ avec une résolution axiale sub-longueur d'onde. Ce dispositif a été calibré et optimisé au cours de cette thèse pour répondre au mieux à des problématiques biologiques. Différentes approches ont ainsi été testées dans le but de calibrer la profondeur de pénétration de l'onde évanescente. Des surfaces plasmoniques ont entre autres été utilisées pour augmenter la sélectivité axiale du montage. Notre microscope a été dédié à l'étude de l'effet du cholestérol sur l'interaction entre la protéine précurseur de l'amyloïde APP, protéine transmembranaire impliquée dans la maladie d'Alzheimer et une de ses enzymes de clivage BACE1. Nous avons ainsi effectué un suivi dynamique de l'effet du cholestérol sur l'interaction entre APP et BACE1 dans des cellules HEK-293 et dans des cultures primaires de neurones d'hippocampe d'embryons de rat, de la membrane plasmique à l'intérieur des cellules grâce à notre dispositif TIRFLIM. La mesure d'anisotropie de fluorescence résolue en temps a également été implémentée sur notre montage. Ces mesures résolues en temps et en polarisation ont permis de mesurer le temps de corrélation rotationnelle de fluorophores et de mettre en évidence de manière qualitative différents niveaux d'homodimérisation de protéines impliquées dans la maladie d'Alzheimer.

Thèse de doctorat : Neurosciences : Strasbourg 1 : 2007. Thesis : Neurosciences : Morehouse school of medicine (Atlanta) : 2007. / Thèse soutenue en co-tutelle. Titre provenant de l'écran-titre. Bibliogr. p. 203-228.