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Expressão dos genes EGFR, PTEN, MGMT e IDH1/2 e dos microRNAs miR-181b, miR-145, miR-149 e miR128a em neuroesferas em linhagens de glioblastoma submetidos ao tratamento com radiação ionizante e temozolomida / Expression of EGFR, PTEN, MGMT and IDH1 / 2 Genes and the MicroRNAs miR-181b, miR-145, miR-149 and miR-128a in Neurospheres In Glioblastoma Lineages Undergoing Treatment with Ionizing Radiation and TemozolomideAlmeida, Thiago Lins da Costa 17 June 2016 (has links)
Introdução: O glioblastoma multiforme é a neoplasia maligna primária mais prevalente do sistema nervoso central. Enquanto apresenta aumento em sua incidência, mantém a perspectiva de sobrevida global aproximada de 14 meses. Objetivos: O presente estudo objetiva avaliar a expressão dos genes EGFR, PTEN, MGMT e IDH1/2 e dos microRNAs miR-181b, miR-145, miR-149 e miR-128a em neuroesferas (NE) e células aderidas (CA), a partir das linhagens celulares (T98G e U343) submetidas ao tratamento com temozolomida (TMZ) e com radiação ionizante (RI) isolados e em associação (TMZ+RI). Material e métodos: As linhagens celulares T98G e U343 foram tratadas com TMZ, RI e TMZ+RI. A verificação da expressão dos genes e miRNAs foi realizada utilizando o método de PCR em tempo real. Resultados: Observamos: a) o aumento na expressão do IDH1 após RI (4-fold) e TMZ+RI (5-fold) nas NE (T98G); o aumento na expressão do IDH2 (20-fold) nas NE (T98G), após TMZ, e do IDH2 (3-fold) nas CA (U343) submetidas à TMZ+RI; b) a redução na expressão do EGFR após TMZ; o aumento dessa expressão nas NE (T98G), após RI (2-fold) e TMZ+RI (3-fold), e a sua diminuição nas CA (U343) submetidas à TMZ e TMZ+RI; c) a redução na expressão PTEN nas NE (T98G), após TMZ e RI, e sua expressão nas NE (3-fold) frente à TMZ+RI; d) aumento na expressão de MGMT nas NE (T98G) nos grupos RI (10-fold) e TMZ+RI (25-fold). Quanto a expressão de miRNAs, foram identificados os seguintes resultados: a) as CA (U343) expressaram: miR-181b após TMZ (60-fold), RI (20-fold) e TMZ+RI (40- fold); e miR-128a após TMZ (500-fold), RI (200-fold) e TMZ+RI (600-fold); b) as NE (T98G) após TMZ+RI expressaram: miR-181b (30-fold), miR-149 (40-fold), miR-145 (300-fold) e miR-128a (40-fold); c) as NE (U343) após RI hiperexpressaram miR-149 e miR-145 (ambos em 4000-fold). Conclusão: A RI apresentou-se como fator independente e determinante para a radiorresistência das NE, entretanto não observamos ação de complementariedade de regulação dos oncomiRs observados sobre a expressão dos genes estudados. Esta é a primeira análise na literatura que correlaciona a expressão de genes e de miRNAs através das intervenções TMZ, RI e TMZ+RI sobre células aderidas e neurosferas. / Introduction: Glioblastoma multiforme is the most prevalent primary malignant neoplasm of the central nervous system. It has increased its incidence, while the overall survival remains over 14 months. Objectives: This study aims to evaluate the expression of the following genes EGFR, PTEN, MGMT and IDH1/2 and microRNAs miR-181b, miR-145, miR-149 and miR-128a in adhered cells (AC) and neurospheres (NS) from cell lines (T98G and U343) which were submitted to temozolomide (TMZ) and ionizing radiation (IR), isolated and associated (TMZ + IR). Methods: The cell lines T98G and U343 were treated with TMZ, IR and TMZ+IR. The analysis of gene expression and miRNAs was performed using the PCR in real time. Results: This study demonstrated: a) an improvement in the expression of IDH1 after IR (4-fold) and TMZ + IR (5-fold) in the NS (T98G); increased expression of IDH2 (20-fold) in the NS (T98G) after TMZ and IDH2 (3-fold) in AC (U343) submitted to TMZ + IR; b) reduction in EGFR expression after TMZ; increase this expression in NS (T98G) after IR (2-fold) and TMZ + IR (3-fold), and a decrease in AC (U343) submitted to TMZ and TMZ + IR; c) reduction in PTEN expression in NS (T98G) after TMZ and IR, and its improvement in NS (3-fold) when compared to TMZ + IR; d) increase in the expression of MGMT in NS (T98G) in IR groups (10-fold) and TMZ + IR (25-fold). It was also identified the expression of miRNAs results as: a) AC (U343) expressed more miR-181b after TMZ (60-fold), IR (20-fold) and TMZ + IR (40-fold); and miR- 128a improved after TMZ (500-fold), IR (200-fold) and TMZ + IR (600-fold); b) NS (T98G) after TMZ + IR expressed: miR-181b (30-fold); miR-149 (40-fold); miR-145 (300-fold) and miR-128a (40-fold); c) NS (U343) after IR huge expressed miR-149 and miR-145 (both in 4000-fold). Conclusion: IR was an independent and determining radio resistance factor in NS. However, we observed no complementarity action of oncomiRs regulation. This is the first study in the literature correlating gene expression, and miRNAs through TMZ, IR and IR + TMZ interventions in AC and NS.
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Expressão dos genes EGFR, PTEN, MGMT e IDH1/2 e dos microRNAs miR-181b, miR-145, miR-149 e miR128a em neuroesferas em linhagens de glioblastoma submetidos ao tratamento com radiação ionizante e temozolomida / Expression of EGFR, PTEN, MGMT and IDH1 / 2 Genes and the MicroRNAs miR-181b, miR-145, miR-149 and miR-128a in Neurospheres In Glioblastoma Lineages Undergoing Treatment with Ionizing Radiation and TemozolomideThiago Lins da Costa Almeida 17 June 2016 (has links)
Introdução: O glioblastoma multiforme é a neoplasia maligna primária mais prevalente do sistema nervoso central. Enquanto apresenta aumento em sua incidência, mantém a perspectiva de sobrevida global aproximada de 14 meses. Objetivos: O presente estudo objetiva avaliar a expressão dos genes EGFR, PTEN, MGMT e IDH1/2 e dos microRNAs miR-181b, miR-145, miR-149 e miR-128a em neuroesferas (NE) e células aderidas (CA), a partir das linhagens celulares (T98G e U343) submetidas ao tratamento com temozolomida (TMZ) e com radiação ionizante (RI) isolados e em associação (TMZ+RI). Material e métodos: As linhagens celulares T98G e U343 foram tratadas com TMZ, RI e TMZ+RI. A verificação da expressão dos genes e miRNAs foi realizada utilizando o método de PCR em tempo real. Resultados: Observamos: a) o aumento na expressão do IDH1 após RI (4-fold) e TMZ+RI (5-fold) nas NE (T98G); o aumento na expressão do IDH2 (20-fold) nas NE (T98G), após TMZ, e do IDH2 (3-fold) nas CA (U343) submetidas à TMZ+RI; b) a redução na expressão do EGFR após TMZ; o aumento dessa expressão nas NE (T98G), após RI (2-fold) e TMZ+RI (3-fold), e a sua diminuição nas CA (U343) submetidas à TMZ e TMZ+RI; c) a redução na expressão PTEN nas NE (T98G), após TMZ e RI, e sua expressão nas NE (3-fold) frente à TMZ+RI; d) aumento na expressão de MGMT nas NE (T98G) nos grupos RI (10-fold) e TMZ+RI (25-fold). Quanto a expressão de miRNAs, foram identificados os seguintes resultados: a) as CA (U343) expressaram: miR-181b após TMZ (60-fold), RI (20-fold) e TMZ+RI (40- fold); e miR-128a após TMZ (500-fold), RI (200-fold) e TMZ+RI (600-fold); b) as NE (T98G) após TMZ+RI expressaram: miR-181b (30-fold), miR-149 (40-fold), miR-145 (300-fold) e miR-128a (40-fold); c) as NE (U343) após RI hiperexpressaram miR-149 e miR-145 (ambos em 4000-fold). Conclusão: A RI apresentou-se como fator independente e determinante para a radiorresistência das NE, entretanto não observamos ação de complementariedade de regulação dos oncomiRs observados sobre a expressão dos genes estudados. Esta é a primeira análise na literatura que correlaciona a expressão de genes e de miRNAs através das intervenções TMZ, RI e TMZ+RI sobre células aderidas e neurosferas. / Introduction: Glioblastoma multiforme is the most prevalent primary malignant neoplasm of the central nervous system. It has increased its incidence, while the overall survival remains over 14 months. Objectives: This study aims to evaluate the expression of the following genes EGFR, PTEN, MGMT and IDH1/2 and microRNAs miR-181b, miR-145, miR-149 and miR-128a in adhered cells (AC) and neurospheres (NS) from cell lines (T98G and U343) which were submitted to temozolomide (TMZ) and ionizing radiation (IR), isolated and associated (TMZ + IR). Methods: The cell lines T98G and U343 were treated with TMZ, IR and TMZ+IR. The analysis of gene expression and miRNAs was performed using the PCR in real time. Results: This study demonstrated: a) an improvement in the expression of IDH1 after IR (4-fold) and TMZ + IR (5-fold) in the NS (T98G); increased expression of IDH2 (20-fold) in the NS (T98G) after TMZ and IDH2 (3-fold) in AC (U343) submitted to TMZ + IR; b) reduction in EGFR expression after TMZ; increase this expression in NS (T98G) after IR (2-fold) and TMZ + IR (3-fold), and a decrease in AC (U343) submitted to TMZ and TMZ + IR; c) reduction in PTEN expression in NS (T98G) after TMZ and IR, and its improvement in NS (3-fold) when compared to TMZ + IR; d) increase in the expression of MGMT in NS (T98G) in IR groups (10-fold) and TMZ + IR (25-fold). It was also identified the expression of miRNAs results as: a) AC (U343) expressed more miR-181b after TMZ (60-fold), IR (20-fold) and TMZ + IR (40-fold); and miR- 128a improved after TMZ (500-fold), IR (200-fold) and TMZ + IR (600-fold); b) NS (T98G) after TMZ + IR expressed: miR-181b (30-fold); miR-149 (40-fold); miR-145 (300-fold) and miR-128a (40-fold); c) NS (U343) after IR huge expressed miR-149 and miR-145 (both in 4000-fold). Conclusion: IR was an independent and determining radio resistance factor in NS. However, we observed no complementarity action of oncomiRs regulation. This is the first study in the literature correlating gene expression, and miRNAs through TMZ, IR and IR + TMZ interventions in AC and NS.
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Efeitos do Silenciamento de E2F1 e HEB, Fatores de Transcrição Preditos In Silico, em Células de Glioblastoma Irradiadas com Raios Gama. / Effects of E2F1 and HEB (Transcription Factors Predicted by In Silico Analysis) Silencing in Glioblastoma Cells Irradiated with Gamma-Rays.Godoy, Paulo Roberto D'Auria Vieira de 12 April 2013 (has links)
O glioblastoma multiforme (GBM) é um dos tumores mais letais e a radioterapia permanece como um dos principais tratamentos. Novas estratégias são necessárias para coibir a resistência ao tratamento, como o silenciamento de fatores de transcrição (FTs). Nossa hipótese é a de que FTs associados a listas de genes diferencialmente expressos, os quais foram selecionados para linhagens de GBM irradiadas, ou comparando amostras de GBM à amostras de tecido cerebral, possam fornecer alvos moleculares que aumentariam a morte das células tumorais, quando silenciados. Foram analisadas a proliferação, morte e ciclo celular, além da formação e diferenciação de neuroesferas, utilizando, em quase todas as etapas, a citometria de fluxo. Os FTs HEB e E2F1, cujas funções principais estão relacionadas à neurogênese e proliferação celular, foram selecionados a partir das análises in silico de GBM irradiados ou não, ou de GBMs comparados a amostras de cérebro normal, respectivamente. Esses FTs encontram-se expressos em linhagens U87, astrócitos primários e neuroesferas provenientes das mesmas, analisadas por Western blot. O silenciamento de HEB e E2F1 na linhagem U87, de forma geral, reduziu a proliferação, induziu morte celular e diminuiu a porcentagem de células em G0/ G1, em pelo menos um dos tempos analisados (24, 48 e 72h) em relação ao grupo transfectado com a sequência scrambled. O silenciamento de HEB e E2F1 reduziu o número de neuroesferas quando comparadas às células transfectadas com a sequência scrambled. Possivelmente, a capacidade anti-proliferativa do silenciamento dos FTs HEB e E2F1 observada no cultivo em monocamada da U87, possam atuar na capacidade de formação de neuroesferas e, consequentemente, podem ter um papel na manutenção das células tronco do GBM. O silenciamento não alterou a radiorresistência da U87 cultivada em monocamada, com exceção dos efeitos do silenciamento de E2F1 em 24 h, em que houve radioproteção. A irradiação não reduziu o número de neuroesferas silenciadas para HEB em comparação ao grupo não irradiado, mas reduziu o número de células presentes nas neuroesferas, indicando uma possível atuação de HEB na resposta à irradiação em neuroesferas, fato este nunca antes descrito. O silenciamento de E2F1 não interferiu na resposta das neuroesferas à radiação. A expressão de CD133 avaliada oito dias após a dissociação das células silenciadas para E2F1 e HEB, cultivadas em meio de diferenciação, foram superiores ao do grupo scrambled, indicando uma possível diminuição na diferenciação celular. O silenciamento dos dois FTs não atuou na seleção positiva de CD133+ após a irradiação, como observado no grupo das neuroesferas transfectadas com a sequência scrambled e irradiadas, comparado às não irradiadas. Assim, E2F1 e HEB mostraram-se alvos interessantes no sentido de reduzir a proliferação, tanto em células U87 cultivadas em monocamada quanto em neuroesferas. / Glioblastoma multiforme (GBM) is one of the most lethal tumors, and radiation therapy remains one of the main treatments. New strategies are needed to suppress typical GBM treatment resistance and transcription factors (TFs) silencing seems to be a promising strategy. Our hypothesis is that TFs associated with lists of differentially expressed genes which were selected for irradiated compared to shamirradiated GBM cell lines, or GBM samples compared to brain tissue samples, could provide molecular targets that are supposed to increase tumor cell death when they are silenced. We analyzed proliferation, cell death and cell cycle progression, besides the formation and differentiation of neurospheres, using several analyses by flow cytometry. The TFs HEB and E2F1, whose primary functions are related to neurogenesis and cell proliferation, were selected from in silico analysis of GBM irradiated or sham-irradiated GBMs and GBM samples compared with normal brain samples, respectively. These TFs were found expressed in U87 GBM cell line, and primary astrocytes, as well as in neurospheres derivated from both, as analyzed by Western blot. Silencing of E2F1 and HEB in U87 cells, reduced proliferation, induced cell death and decreased the percentage of cells at G0/G1 (24, 48 or 72h) compared to the scrambled sequence transfected group. HEB and E2F1 silencing reduced the number of neurospheres when compared to cells transfected with scrambled sequence. Possibly, the anti-proliferative ability of silencing of HEB and E2F1 TFs observed in monolayer culture of U87, may act in neurospheres forming capacity and therefore may play a role in the maintenance of GBM stem cells. In our experiments, gene silencing did not alter the radio-resistance of U87 grown in monolayer. Irradiation did not reduce the number of neurospheres silenced for HEB compared to non-irradiated group, but reduced the number of cells present in neurospheres, indicating a possible role of HEB in response to ionizing irradiation in neurospheres, a fact that was not described yet. The silencing of E2F1 in neurospheres did not affect the response to irradiation. The expression of CD133, as assessed at eight days after the dissociation of cells silenced for E2F1 and HEB (cultured in differentiation culture media), was superior compared with the scrambled group, indicating a possible decrease in cell differentiation. The silencing of both TFs did not influence the positive selection of CD133 after irradiation, as observed in the group of neurospheres transfected with scrambled sequence, and irradiated compared to nonirradiated. Thus, E2F1 and HEB proved to be interesting targets for decreasing proliferation in both U87 cells grown as monolayer or neurospheres.
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Efeitos do Silenciamento de E2F1 e HEB, Fatores de Transcrição Preditos In Silico, em Células de Glioblastoma Irradiadas com Raios Gama. / Effects of E2F1 and HEB (Transcription Factors Predicted by In Silico Analysis) Silencing in Glioblastoma Cells Irradiated with Gamma-Rays.Paulo Roberto D'Auria Vieira de Godoy 12 April 2013 (has links)
O glioblastoma multiforme (GBM) é um dos tumores mais letais e a radioterapia permanece como um dos principais tratamentos. Novas estratégias são necessárias para coibir a resistência ao tratamento, como o silenciamento de fatores de transcrição (FTs). Nossa hipótese é a de que FTs associados a listas de genes diferencialmente expressos, os quais foram selecionados para linhagens de GBM irradiadas, ou comparando amostras de GBM à amostras de tecido cerebral, possam fornecer alvos moleculares que aumentariam a morte das células tumorais, quando silenciados. Foram analisadas a proliferação, morte e ciclo celular, além da formação e diferenciação de neuroesferas, utilizando, em quase todas as etapas, a citometria de fluxo. Os FTs HEB e E2F1, cujas funções principais estão relacionadas à neurogênese e proliferação celular, foram selecionados a partir das análises in silico de GBM irradiados ou não, ou de GBMs comparados a amostras de cérebro normal, respectivamente. Esses FTs encontram-se expressos em linhagens U87, astrócitos primários e neuroesferas provenientes das mesmas, analisadas por Western blot. O silenciamento de HEB e E2F1 na linhagem U87, de forma geral, reduziu a proliferação, induziu morte celular e diminuiu a porcentagem de células em G0/ G1, em pelo menos um dos tempos analisados (24, 48 e 72h) em relação ao grupo transfectado com a sequência scrambled. O silenciamento de HEB e E2F1 reduziu o número de neuroesferas quando comparadas às células transfectadas com a sequência scrambled. Possivelmente, a capacidade anti-proliferativa do silenciamento dos FTs HEB e E2F1 observada no cultivo em monocamada da U87, possam atuar na capacidade de formação de neuroesferas e, consequentemente, podem ter um papel na manutenção das células tronco do GBM. O silenciamento não alterou a radiorresistência da U87 cultivada em monocamada, com exceção dos efeitos do silenciamento de E2F1 em 24 h, em que houve radioproteção. A irradiação não reduziu o número de neuroesferas silenciadas para HEB em comparação ao grupo não irradiado, mas reduziu o número de células presentes nas neuroesferas, indicando uma possível atuação de HEB na resposta à irradiação em neuroesferas, fato este nunca antes descrito. O silenciamento de E2F1 não interferiu na resposta das neuroesferas à radiação. A expressão de CD133 avaliada oito dias após a dissociação das células silenciadas para E2F1 e HEB, cultivadas em meio de diferenciação, foram superiores ao do grupo scrambled, indicando uma possível diminuição na diferenciação celular. O silenciamento dos dois FTs não atuou na seleção positiva de CD133+ após a irradiação, como observado no grupo das neuroesferas transfectadas com a sequência scrambled e irradiadas, comparado às não irradiadas. Assim, E2F1 e HEB mostraram-se alvos interessantes no sentido de reduzir a proliferação, tanto em células U87 cultivadas em monocamada quanto em neuroesferas. / Glioblastoma multiforme (GBM) is one of the most lethal tumors, and radiation therapy remains one of the main treatments. New strategies are needed to suppress typical GBM treatment resistance and transcription factors (TFs) silencing seems to be a promising strategy. Our hypothesis is that TFs associated with lists of differentially expressed genes which were selected for irradiated compared to shamirradiated GBM cell lines, or GBM samples compared to brain tissue samples, could provide molecular targets that are supposed to increase tumor cell death when they are silenced. We analyzed proliferation, cell death and cell cycle progression, besides the formation and differentiation of neurospheres, using several analyses by flow cytometry. The TFs HEB and E2F1, whose primary functions are related to neurogenesis and cell proliferation, were selected from in silico analysis of GBM irradiated or sham-irradiated GBMs and GBM samples compared with normal brain samples, respectively. These TFs were found expressed in U87 GBM cell line, and primary astrocytes, as well as in neurospheres derivated from both, as analyzed by Western blot. Silencing of E2F1 and HEB in U87 cells, reduced proliferation, induced cell death and decreased the percentage of cells at G0/G1 (24, 48 or 72h) compared to the scrambled sequence transfected group. HEB and E2F1 silencing reduced the number of neurospheres when compared to cells transfected with scrambled sequence. Possibly, the anti-proliferative ability of silencing of HEB and E2F1 TFs observed in monolayer culture of U87, may act in neurospheres forming capacity and therefore may play a role in the maintenance of GBM stem cells. In our experiments, gene silencing did not alter the radio-resistance of U87 grown in monolayer. Irradiation did not reduce the number of neurospheres silenced for HEB compared to non-irradiated group, but reduced the number of cells present in neurospheres, indicating a possible role of HEB in response to ionizing irradiation in neurospheres, a fact that was not described yet. The silencing of E2F1 in neurospheres did not affect the response to irradiation. The expression of CD133, as assessed at eight days after the dissociation of cells silenced for E2F1 and HEB (cultured in differentiation culture media), was superior compared with the scrambled group, indicating a possible decrease in cell differentiation. The silencing of both TFs did not influence the positive selection of CD133 after irradiation, as observed in the group of neurospheres transfected with scrambled sequence, and irradiated compared to nonirradiated. Thus, E2F1 and HEB proved to be interesting targets for decreasing proliferation in both U87 cells grown as monolayer or neurospheres.
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