Els traumatismes cranioencefàlics (TCE) són la primera causa de mort i discapacitat en la població menor de 40 anys de qualsevol païs industrialitzat. Les xifres de mortalitat són encara elevades, oscil·lant, en la majoria de centres, entre el 30-40%. Els mals resultats neurològics supera en molts casos el 55%. Aquests resultats comporten importants repercusions sanitàries, econòmiques i socials, i expliquen el progressiu interés en la investigació traslacional de les lesions neurotraumàtiques. Malgrat el millor coneixement de la fisiopatologia del TCE i de l'avenç en les tècniques de neuromonitoratge i en el tractament, el pronòstic d'aquests pacients ha assolit una meseta. És conegut que tot i que una part considerable de les lesions es produeixen de forma immediata a l'impacte (lesions primàries), moltes d'elles apareixen en un periode variable de temps després del traumatisme (lesions secondàries). La hipòxia tissular d'origen isquèmic o no isquèmic constitueix la lesió secondària de major prevalència als TCE. A més, genera o potencia l'aparició de processos metabòlics anòmals i pot induïr una resposta inflamatòria a nivell tissular. Tanmateix, les dades obtingudes d'estudis en models experimentals i clínics han demostrat de forma inequívoca que la resposta inflamatòria cerebral juga un paper predominant en la lesió secondària postraumàtica, facilitant l'alteració de la permeabilitat de la barrera hematoencefàlica (BHE), l'edema cerebral i secondàriament la tumefacció cerebral i l'augment de la pressió intracranial. En els darrers anys, la introducció de noves tecnologies en l'àmbit clínic ha permès utilitzar tècniques revolucionàries de neuromonitoratge a la capçalera del pacient. Una d'elles ha estat la microdiàlisi cerebral, que permet el monitoratge neuroquímic quasi on-line dels nivells extracel·lulars de certs metabolits. El principi bàsic d'aquesta tècnica és la introducció al parènquima cerebral d'un catèter que conté una membrana semipermeable al seu extrem distal. La membrana de diàlisi permet la difusió lliure d'aigua i soluts entre l'espai extracel·lular cerebral i una solució salina perfosa mitjançant una microbomba.La possibilitat d'obtenir informació del metabolisme cerebral a la capçalera del pacient ens permet estudiar la resposta metabòlica a determinats procediments terapèutics, així com preveure l'establiment del dany tissular degut a la hipòxia tissular cerebral. A més, la recent aparició al mercat de noves membranes de microdiàlisi, amb porus de filtratge majors, ha obert la possibilitat d'estudiar proteïnes de major tamany, implicades en els processos neuroinflamatoris desencadenats després d'un TCE, com l'estudi del paper de les metal·loproteïnases de matriu (MMPs) a la lesió cerebral traumàtica.La present tesi pretèn aportar noves aplicacions de la microdiàlisi cerebral en l'estudi del metabolisme i de la neuroinflamació del pacient neurotraumàtic. En primer lloc l'aplicació de la microdiàlisi com a eina diagnòstica en la detecció de la hipòxia cerebral isquèmica, ens permet validar per una banda la superioritat d'aquesta tècnica respecte una altra de més convencional, com és el cas del càlcul de les diferencies arterio-jugulars de lactat i l'índex lactat-oxigen. A més, la utilització combinada de la microdiàlisi amb la pressió tisular d'oxigen ens permet determinar l'efecte de la hiperòxia normobàrica en el metabolisme cerebral d'aquests pacients. En segon lloc, la tesi aprofundeix en l'estudi d'unes proteases que es sobreexpressen com a conseqüència dels processos inflamatoris desencadenats a la fase aguda del TCE, les MMPs, que es relacionen amb l'alteració de la BHE. La possibilitat de poder recuperar proteïnes amb un pes mol·lecular superior al dels catèters de primera generació, obre pas a múltiples opcions terapèutiques. Una d'elles seria dissenyar estratègies farmacològiques per bloquejar o modular la sobreexpressió d'aquestes proteases a la fase aguda del TCE, amb la finalitat de limitar l'alteració de la BHE i el dany tissular postraumàtic cerebral. / Traumatic brain injury (TBI) is the leading cause of death and disability worldwide among the population under the age of 40 years. Mortality is still high, and it fluctuates between 30% and 40% in the majority of centers. The poor neurologic outcome exceeds in many cases the 55%. These results lead to important sanitary, economic and social consequences, and explain the progressive interest in the translational research of brain traumatic lesions. In spite of the better understanding of TBI pathophysiology and the progress achieved in neuromonitoring techniques and treatment, the prognosis of these patients has reached a plateau. It is well known that even though a considerable part of injury is produced immediately after impact (primary brain injury), a great part appear in a variable period of time after traumatism (secondary brain injury). Tissular hypoxia, with ischemic or not ischemic origin, is the most prevalent secondary brain injury in TBI patients. Moreover, it generates or boost metabolic alterated processes and can induce an inflammatory tissular response. Data obtained from experimental and clinical models have firmly shown that inflammatory response has a crucial role in the posttraumatic secondary injury, promoting blood-brain barrier (BBB) increased permeability, brain edema and secondly brain tumefaction and increases in intracranial pressure.New clinical technologies have recently permitted to use revolutionary neuromonitoring techniques at the patient bedside. One of them is brain microdialysis, that allows brain neurochemistry monitoring of several metabolites in the extracellular space. The basic principle about this technique is the implantation of one catheter in the brain parenchyma, that contains a semipermeable membrane in the distal part. The dialysis membrane allows free difusion of water and molecules between the extracellular space and a saline solution, which is perfused by using a micropump.Due to the fact that we are able to obtain brain metabolic information at the patient bedside, we can study the metabolic response to some therapeutic procedures, as well as prevent tissular injury due to brain hypoxia. Moreover, the new generation membranes, with larger filtration membrane pores, has opened the possibility to study proteins with higher molecular weight implicated in the neuroinflammatory processes triggered after a TBI, such as the matrix metaloproteinases (MMPs).The present thesis aims to provide new applications of brain microdialysis in the metabolic and neuroinflammation field from the brain trauma patient. First, the microdialysis application as a diagnosis tool to detect brain ischemic hypoxia enables to validate the superiority of this technique in front of another one more conventional, like the arteriojugular venous differences of lactate and lactate-oxygen index. Moreover, the combinated use of brain tissue oxygen pressure and brain microdialysis allows us to analyse the normobaric hyperoxia effects on the brain metabolism of these patients. Second, the thesis explores the role of certain proteases that are overexpressed after a TBI, named MMPs, which are related to BBB disruption. The possibility to recover proteins with higher molecular weight opens multiple therapeutic options. One of them would be to design a pharmacological blockade or modulation of these proteases in the acute phase from TBI, with the goal to reduce BBB permeability and brain tissular damage.

L’activació microglial és un fenomen fisiològic que permet resoldre alteracions a l’homeostasi. Quan l’estímul desencadenant de l’activació microglial és proinflamatori, es desencadena una resposta inflamatòria en la que la micròglia produeix citocines i altres factors proinflamatoris que tenen potencial neurotòxic. Si aquesta activació es dóna de forma exacerbada o es cronifica, pot acabar tenint un efecte perniciós. De fet, diversos autors postulen que l’activació microglial pot agreujar el curs de patologies com l’Alzheimer o el Parkinson. És per això que en aquesta tesi ens vam plantejar la inhibició del fenotip proinflamatori de l’activació microglial com una diana terapèutica en les malalties neurodegeneratives. El primer objectiu va ser establir i caracteritzar un model in vitro de neuroinflamació, en el que estudiar el patró d’activació microglial a cultius tractats amb un estímul proinflamatori (LPS + interferó gamma). Així, vam determinar que la micròglia estimulada amb LPS/IFN-gamma s’activa amb un patró de resposta proinflamatori que es caracteritza per un increment en l’expressió dels enzims iNOS i COX-2 i en la producció de NO, TNF-alfa i IL-6. En una segona fase es va establir i caracteritzar un model de cocultiu de neurones i micròglia on estudiar la neurotoxicitat induïda per activació microglial en el que vam determinar que l’activació de la micròglia en resposta al LPS/IFN-gamma té un efecte neurotòxic principalment mediat per la producció de NO, mentre que el TNF-alfa la IL-6 i la COX-2 tenen un paper secundari. Una vegada establert el model experimental vam abordar la modulació de l’activació microglial inhibint els factors implicats en l’activació proinflamatòria, en concret els C/EBPs, ja que aquests factors regulen l’expressió de molts dels gens implicats en la resposta proinflamatòria microglial. La nostra hipòtesi era que la inhibició dels C/EBPs disminuiria aquesta resposta i tindria un efecte neuroprotector. La inhibició es va abordar des d’una aproximació farmacològica i una aproximació genètica. La inhibició farmacològica es va fer usant el flavonoide crisina que té efectes antiinflamatoris mediats per la inhibició dels C/EBPs en macròfags. Així, vam determinar que la crisina té un efecte antiinflamatori i neuroprotector i que aquest està mediat, si més no en part, per la inhibició de C/EBP-delta. Posteriorment, mitjançant la utilització de micròglia de ratolins deficients en C/EBP-beta o C/EBP-delta, vam determinar que l’absència de C/EBP-beta o C/EBP-delta inhibeix l’activació microglial i la neurotoxicitat associada. Els C/EBPs per tant són una possible diana terapèutica addicional per al tractament de patologies que cursen amb neuroinflamació. Per últim es va plantejar la inhibició de la sobreactivació microglial proinflamatòria potenciant els senyals inhibidors que mantenen a la micròglia en un estat quiescent, en concret la parella lligand-receptor CD200-CD200R. La nostra hipòtesi era que modulant l’activació de CD200R es podria inhibir la sobreactivació microglial i la neurotoxicitat associada. Així el tercer objectiu va ser estudiar, d’una banda quins estímuls poden modular l’expressió de CD200 a les neurones, i de l’altra quin és el paper de CD200 i CD200R en la modulació de l’activació microglial per part de les neurones. Per abordar aquest objectiu es va establir un model de mort neuronal apoptòtica i un model de mort neuronal necròtica per excitotoxicitat. En aquest model vam determinar que l’expressió de CD200 augmenta en neurones que estan morint, ja sigui per apoptosi com per necrosi, el que podria constituir un mecanisme de control de l’activació microglial en presència de mort neuronal (no es pot descartar que l’efecte observat sigui degut a una major estabilitat CD200 en front a altres proteïnes neuronals). Per últim ens vam plantejar estudiar l’efecte de la modulació de la senyalització CD200-CD200R sobre l’activació microglial i la neurotoxicitat associada, demostrant quel’expressió proteica de CD200 a neurones no es modula per estímuls antiinflamatoris com la IL-4 i la IL-10 ni proinflamatoris com el LPS i l’IFN-gamma. En resum, els resultats d’aquesta tesi mostren la utilitat dels models experimentals in vitro per estudiar la resposta inflamatòria de la micròglia i la neurotoxicitat resultant. Amb aquests models hem pogut establir la importància de la família de factors de transcripció C/EBPs en la regulació de la resposta inflamatòria microglial i suggerir la rellevància de CD200 en la comunicació entre la micròglia i les neurones que han entrat en un procés de mort cel•lular. / Microglial activation is a physiologic phenomenon that occurs in response to alterations of homeostasis. When microglia are activated by an pro-inflammatory stimulus there is an inflammatory response where cytokines and other pro-inflammatory factors with neurotoxic potential are released. A chronic or exacerbated response can have harmful effects; in fact many authors connect microglial pro-inflammatory overactivation with degenerative diseases such as Alzheimer’s or Parkinson’s disease. Given that, the main goal of this thesis was develope strategies to inhibit pro-inflammatory microglial activation that could serve as therapeutic target in neurodegenerative diseases. To do so we set up and characterized an in-vitro model of neuroinflammation using LPS + interferon-gamma as a proinflammatory stimulus. Treated microglial cells undergo a proinflammatory response pattern characterized by the release of NO, TNF-alpha and IL-6 and the increase of iNOS and COX-2 expression. When microglial cells are co-cultured with cortical neurons, the pro-inflammatory response results in neurotoxicity, an effect mediated mainly by NO release, whereas TNF-alpha, la IL-6 and COX-2 may have a secondary role in the process. Using this model we tested whether we could modulate microglial activation by inhibiting C/EBPs, a family of transcription factors involved in the regulation of pro-inflammatory genes. We first used a pharmacologic approach treating microglial cells with an anti-inflammatory compound named crisin. We determinated that crisin has anti-inflammatory and neuroprotective effects and that these effects are mediated,at least in part, by C/EBP-delta inhibition. We then used a genetic approach to inhibit C/EBPs, by using microglial cells from KO mice. We showed that the lack of C/EBP-beta or C/EBP-delta inhibits microglial activation and the associated neurotoxicity. Therefore, we suggest that C/EBPs are a potential therapeutic target in the treatment of diseases where neuroinflammation is present. We also modulated microglial activation by potentiating the inhibitory signals that keep microglia in a resting state, such as the neuronal ligand CD200 and its microglial receptor CD200R. We showed that CD200 expression appears to increase in response to neuronal death but not in response to pro-inflammatory stimuli such as IL-4, IL-10 or anti-inflammatory stimuli such as LPS and IFN-gamma. In summary we demonstrated that in-vitro models can be used to study the pro-inflammatory and neurotoxic effect of the microglial response. Using this approach we determinated the relevance of C/EBPs in regulating microglial activation and our studies support an important role of CD200 in the crosstalk between microglia and neurons that undergoing cell death.