L’activació microglial és un fenomen fisiològic que permet resoldre alteracions a l’homeostasi. Quan l’estímul desencadenant de l’activació microglial és proinflamatori, es desencadena una resposta inflamatòria en la que la micròglia produeix citocines i altres factors proinflamatoris que tenen potencial neurotòxic. Si aquesta activació es dóna de forma exacerbada o es cronifica, pot acabar tenint un efecte perniciós. De fet, diversos autors postulen que l’activació microglial pot agreujar el curs de patologies com l’Alzheimer o el Parkinson. És per això que en aquesta tesi ens vam plantejar la inhibició del fenotip proinflamatori de l’activació microglial com una diana terapèutica en les malalties neurodegeneratives. El primer objectiu va ser establir i caracteritzar un model in vitro de neuroinflamació, en el que estudiar el patró d’activació microglial a cultius tractats amb un estímul proinflamatori (LPS + interferó gamma). Així, vam determinar que la micròglia estimulada amb LPS/IFN-gamma s’activa amb un patró de resposta proinflamatori que es caracteritza per un increment en l’expressió dels enzims iNOS i COX-2 i en la producció de NO, TNF-alfa i IL-6. En una segona fase es va establir i caracteritzar un model de cocultiu de neurones i micròglia on estudiar la neurotoxicitat induïda per activació microglial en el que vam determinar que l’activació de la micròglia en resposta al LPS/IFN-gamma té un efecte neurotòxic principalment mediat per la producció de NO, mentre que el TNF-alfa la IL-6 i la COX-2 tenen un paper secundari. Una vegada establert el model experimental vam abordar la modulació de l’activació microglial inhibint els factors implicats en l’activació proinflamatòria, en concret els C/EBPs, ja que aquests factors regulen l’expressió de molts dels gens implicats en la resposta proinflamatòria microglial. La nostra hipòtesi era que la inhibició dels C/EBPs disminuiria aquesta resposta i tindria un efecte neuroprotector. La inhibició es va abordar des d’una aproximació farmacològica i una aproximació genètica. La inhibició farmacològica es va fer usant el flavonoide crisina que té efectes antiinflamatoris mediats per la inhibició dels C/EBPs en macròfags. Així, vam determinar que la crisina té un efecte antiinflamatori i neuroprotector i que aquest està mediat, si més no en part, per la inhibició de C/EBP-delta. Posteriorment, mitjançant la utilització de micròglia de ratolins deficients en C/EBP-beta o C/EBP-delta, vam determinar que l’absència de C/EBP-beta o C/EBP-delta inhibeix l’activació microglial i la neurotoxicitat associada. Els C/EBPs per tant són una possible diana terapèutica addicional per al tractament de patologies que cursen amb neuroinflamació. Per últim es va plantejar la inhibició de la sobreactivació microglial proinflamatòria potenciant els senyals inhibidors que mantenen a la micròglia en un estat quiescent, en concret la parella lligand-receptor CD200-CD200R. La nostra hipòtesi era que modulant l’activació de CD200R es podria inhibir la sobreactivació microglial i la neurotoxicitat associada. Així el tercer objectiu va ser estudiar, d’una banda quins estímuls poden modular l’expressió de CD200 a les neurones, i de l’altra quin és el paper de CD200 i CD200R en la modulació de l’activació microglial per part de les neurones. Per abordar aquest objectiu es va establir un model de mort neuronal apoptòtica i un model de mort neuronal necròtica per excitotoxicitat. En aquest model vam determinar que l’expressió de CD200 augmenta en neurones que estan morint, ja sigui per apoptosi com per necrosi, el que podria constituir un mecanisme de control de l’activació microglial en presència de mort neuronal (no es pot descartar que l’efecte observat sigui degut a una major estabilitat CD200 en front a altres proteïnes neuronals). Per últim ens vam plantejar estudiar l’efecte de la modulació de la senyalització CD200-CD200R sobre l’activació microglial i la neurotoxicitat associada, demostrant quel’expressió proteica de CD200 a neurones no es modula per estímuls antiinflamatoris com la IL-4 i la IL-10 ni proinflamatoris com el LPS i l’IFN-gamma. En resum, els resultats d’aquesta tesi mostren la utilitat dels models experimentals in vitro per estudiar la resposta inflamatòria de la micròglia i la neurotoxicitat resultant. Amb aquests models hem pogut establir la importància de la família de factors de transcripció C/EBPs en la regulació de la resposta inflamatòria microglial i suggerir la rellevància de CD200 en la comunicació entre la micròglia i les neurones que han entrat en un procés de mort cel•lular. / Microglial activation is a physiologic phenomenon that occurs in response to alterations of homeostasis. When microglia are activated by an pro-inflammatory stimulus there is an inflammatory response where cytokines and other pro-inflammatory factors with neurotoxic potential are released. A chronic or exacerbated response can have harmful effects; in fact many authors connect microglial pro-inflammatory overactivation with degenerative diseases such as Alzheimer’s or Parkinson’s disease. Given that, the main goal of this thesis was develope strategies to inhibit pro-inflammatory microglial activation that could serve as therapeutic target in neurodegenerative diseases. To do so we set up and characterized an in-vitro model of neuroinflammation using LPS + interferon-gamma as a proinflammatory stimulus. Treated microglial cells undergo a proinflammatory response pattern characterized by the release of NO, TNF-alpha and IL-6 and the increase of iNOS and COX-2 expression. When microglial cells are co-cultured with cortical neurons, the pro-inflammatory response results in neurotoxicity, an effect mediated mainly by NO release, whereas TNF-alpha, la IL-6 and COX-2 may have a secondary role in the process. Using this model we tested whether we could modulate microglial activation by inhibiting C/EBPs, a family of transcription factors involved in the regulation of pro-inflammatory genes. We first used a pharmacologic approach treating microglial cells with an anti-inflammatory compound named crisin. We determinated that crisin has anti-inflammatory and neuroprotective effects and that these effects are mediated,at least in part, by C/EBP-delta inhibition. We then used a genetic approach to inhibit C/EBPs, by using microglial cells from KO mice. We showed that the lack of C/EBP-beta or C/EBP-delta inhibits microglial activation and the associated neurotoxicity. Therefore, we suggest that C/EBPs are a potential therapeutic target in the treatment of diseases where neuroinflammation is present. We also modulated microglial activation by potentiating the inhibitory signals that keep microglia in a resting state, such as the neuronal ligand CD200 and its microglial receptor CD200R. We showed that CD200 expression appears to increase in response to neuronal death but not in response to pro-inflammatory stimuli such as IL-4, IL-10 or anti-inflammatory stimuli such as LPS and IFN-gamma. In summary we demonstrated that in-vitro models can be used to study the pro-inflammatory and neurotoxic effect of the microglial response. Using this approach we determinated the relevance of C/EBPs in regulating microglial activation and our studies support an important role of CD200 in the crosstalk between microglia and neurons that undergoing cell death.

Los volcanes son formaciones geológicas que resultan atractivas para los asentamientos humanos debido a la fertilidad de sus suelos y su interés turístico. Pero también son una fuente importante de contaminación natural, debido a los procesos geoquímicos que tienen lugar durante los periodos eruptivos y no eruptivos. Se estima que 44 millones de personas viven a menos de 10 km de un volcán activo y ya se ha demostrado el aumento de incidencia de patologías respiratorias en humanos que habitan estos ambientes. La presente Tesis Doctoral tiene como objetivo valorar los efectos neurotóxicos en el sistema nervioso central de ratones domésticos (Mus musculus) que habitan en ambientes volcánicos activos. La acumulación de mercurio en cerebro y médula espinal de individuos expuestos, la activación de células astrocitarias y microgliales y la producción de citocinas proinflamatorias son los principales resultados de este trabajo de los que se desprende que el sistema nervioso central está afectado por la exposición crónica a estos ambientes.

[ES] El consumo de altas cantidades de etanol durante en un corto período de tiempo, conocido también como consumo en atracón, causa importantes alteraciones en el sistema nervioso central del adolescente, activando la respuesta innata inflamatoria, que puede causar muerte neuronal y alteraciones a nivel estructural y de la conducta. Esta respuesta se produce mediante la activación de los receptores de membrana Toll-like, y específicamente por los receptores TLR4, localizados en células gliales. Cuando dicho receptor se une a su ligando y dimeriza, desencadena una cascada de señalización que finaliza con la translocación al núcleo del factor de transcripción NF-κB, donde se promueve la síntesis y liberación de citoquinas y quimioquinas pro-inflamatorias al medio extracelular. Entre los mecanismos que podrían participar en la amplificación de la respuesta neuroinflamatoria se encontrarían un tipo de vesículas extracelulares (VEs), denominadas exosomas. Los exosomas son micropartículas de 30-150 nm de tamaño con un contenido de carácter bioactivo, formado por proteínas, lípidos y ácidos nucleicos, y que cumplen un papel importante en la comunicación intercelular. Por tanto, la hipótesis que planteamos en esta tesis doctoral es que las VEs ejercen un papel en el mantenimiento y propagación de la neuroinflamación causada por el consumo de alcohol en forma de atracón. Utilizando VEs de cultivos primarios de astrocitos demostramos que el etanol induce una mayor secreción de VEs y altera los niveles de determinadas proteínas y microARNs (miARNs) asociados con la neuroinflamacion. Además, demostramos que cuando las neuronas corticales en cultivo se incuban con VEs procedentes de los astrocitos WT tratados con etanol, se inducen marcadores inflamatorios en las neuronas y presentan mayores niveles de apoptosis. Durante el proceso de biogénesis exosomal, se ha demostrado la participación de una familia de enzimas, llamadas esfingomielinasas, que estarían relacionadas con la biogénesis y secreción de las VEs. Estudios previos de este laboratorio han demostrado que el etanol es capaz de activar las esfingomielinasas, aunque el mecanismo por el cual esto ocurre se desconoce. En este proyecto de tesis proponemos a las membranas asociadas a mitocondrias (MAM) como mecanismo regulador de la secreción de VEs mediada por esfingomielinasas. Mediante el análisis de la actividad de transferencia de fosfolípidos, marcador de actividad de MAM, observamos que el etanol, tanto a nivel tisular como en cultivo, es capaz de activar MAM. Además, demostramos que, inhibiendo la actividad tanto de MAM como de las esfingomielinasas, se revierte el aumento en secreción de VEs causado por el tratamiento con etanol. Estos resultados sugieren que el etanol promueve una mayor liberación de VEs mediante la activación de las enzimas esfingomielinasas a través de MAM. Además, puesto que las VEs tienen la capacidad de cruzar la barrera hematoencefálica (BBB) y tener estabilidad en la circulación, se han considerado como posibles candidatos a biomarcadores de situaciones patológicas. Uno de los elementos presentes en las VEs, que se ha utilizado recientemente como biomarcador en diversos estudios, son los miARNs, moléculas de ARN no codificante de cadena corta implicados en la regulación génica. Se ha descrito que, en pacientes con enfermedades neurodegenerativas como el Alzheimer, Parkinson u otras, se detectan patrones de expresión diferencial de miARNs en las VEs circulantes, en comparación con pacientes control. En este estudio demostramos que el etanol es capaz de alterar los perfiles de miARNs relacionados con la inflamación presentes en VEs circulantes de jóvenes con intoxicación etílica aguda (IEA). Estos efectos presentan diferencias de género, siendo las mujeres/hembras más vulnerables a los efectos del alcohol, ya que la expresión de marcadores inflamatorios en cerebro y en VEs circulantes son más elevadas en mujeres/hembras que en hombres/machos. Estos resultados ponen de manifiesto que las VEs circulantes y sus perfiles de miARNs son posibles candidatos a biomarcadores de la neuroinflamación asociadas con el abuso de alcohol. / [CA] El consum d'elevades quantitats d'alcohol durant un curt període de temps, conegut també com a consum en afartament, causa importants alteracions en el sistema nerviós central de l'adolescent, activant la resposta innata inflamatòria, que pot causar mort neuronal i alteracions a nivell estructural i de conducta. Aquesta resposta es produeix mitjançant l'activació dels receptors de membrana Toll-like, i específicament pels receptors TLR4, localitzats en cèl·lules glials. Quan aquest receptor s'uneix al seu lligant i dimeritza, desencadena una cascada de senyalització que finalitza amb la translocació al nucli del factor de transcripció NF-κB, on es promou la síntesi i alliberament de citoquines i quimioquines pro-inflamatòries al medi extracel·lular. Dins dels mecanismes que podrien participar en l'amplificació de la resposta neuroinflamatòria es trobarien un tipus de vesícules extracel·lulars (VEs), denominades exosomes. Els exosomes són micropartícules de 30-150 nm de grandària amb un contingut de caràcter bioactiu, format per proteïnes, lípids i àcids nucleics, i que compleixen un paper important en la comunicació intercel·lular. Per tant, la hipòtesi que plantegem en aquesta tesi doctoral és que les VEs exerceixen un paper en el manteniment i propagació de la neuroinflamació causada pel consum d'alcohol en forma d'afartament. Utilitzant VEs de cultius primaris d'astròcits demostràrem que l'etanol indueix una major secreció de VEs i una alteració dels nivells de determinades proteïnes i microARNs (miARNs) associats amb la neuroinflamació. A més a més, també observàrem que quan les neurones corticals en cultiu s'incubaben amb VEs procedents dels astròcits WT tractats amb etanol, s'induïen marcadors inflamatoris en les neurones i aquestes presentaven majors nivells d'apoptosi. Durant el procés de biogènesi exosomal, s'ha demostrat la participació d'una família d'enzims, anomenats esfingomielinases, que estarien relacionats amb la biogènesi i secreció de les VEs. Estudis previs d'aquest laboratori han demostrat que l'etanol és capaç d'activar les esfingomielinases, encara que el mecanisme pel qual això passa es desconeix. En aquest projecte de tesi proposem a les membranes associades a mitocòndries (MAM), juntament amb les esfingomielinases com el mecanisme regulador de la secreció de VEs induïda pel consum d'alcohol. Mitjançant l'anàlisi de l'activitat de transferència de fosfolípids, marcador d'activitat de MAM, observàrem que l'etanol, tant a nivell tissular com en cultiu, era capaç d'activar MAM. A més, demostràrem que inhibint l'activitat tant de MAM com de les esfingomielinases, revertiem l'augment en la secreció de VEs causat pel tractament amb etanol. Aquests resultats suggereixen, que l'etanol promou una major alliberament de VEs mitjançant l'activació dels enzims esfingomielinases a través de MAM. A més, ja que les VEs tenen la capacitat de creuar la barrera hematoencefàlica (BBB) i ser estables en circulació, s'han considerat bons candidats a biomarcadors de situacions patològiques. Un dels elements presents en les VEs que s'ha utilitzat recentment com a biomarcador en diversos estudis, són els miARNs, molècules d'ARN no codificant de cadena curta implicats en la regulació gènica. S'ha descrit que, en pacients amb malalties neurodegeneratives, com l'Alzheimer o Parkinson, es detecten patrons d'expressió diferencial de miARNs a les VEs circulants, en comparació amb pacients control. A aquest estudi demostrem que l'etanol és capaç d'alterar els perfils de miARNs relacionats amb la inflamació presents en VEs circulants de joves amb intoxicació etílica aguda (IEA). Aquests efectes presenten diferències de gènere, sent les dones / noies més vulnerables als efectes de l'alcohol, ja que l'expressió de marcadors inflamatoris en cervell i en VEs circulants són més elevades en noies que en nois. / [EN] Heavy alcohol intake during a short period of time, also known as binge drinking, has been proved to produce negative effects on the individual's central nervous system by activating an inflammatory response that can lead to neuronal death and structural and behavioral alterations. This response is produced by glial cells, the main component of the neuroimmune system, through the activation of TLR4, a transmembrane receptor of the TLR family. When TLR4 binds to its ligand and dimerizes, it triggers a signaling cascade that ends up with the translocation of NF-κB to the nucleus, acting as a transcription factor, where it promotes the synthesis and release of pro-inflammatory cytokines and chemokines to the extracellular milieu. Among the mechanisms responsible for the transmission and amplification of this neuroinflammatory response, one candidate could be a kind of extracellular vesicles (VEs) called exosomes. Exosomes are microparticles of 30-150 nm in size, with a bioactive content, composed mostly by proteins, lipids and nucleic acids, which play an important role in intercellular communication. Therefore, the hypothesis of this thesis is that VEs play an important role in the transmission of the neuroinflammatory response caused by ethanol binge drinking. Using VEs from primary cultures of astrocytes, we show that ethanol is able to induce a higher secretion of VEs and alters their composition of inflammatory related protein and microRNAs (miARNs). Furthermore, incubation of these VEs in primary cultures of neurons lead to the development of inflammatory protein and gene markers, and higher apoptosis levels. Exosomal release has been shown to be partly regulated by a family of enzymes called sphingomyelinases, since inhibition of these enzymes resulted in a reduction of secreted VEs. Previous studies from this laboratory have shown that ethanol is able to activate sphingomyelinases, but the mechanism involved in the process is currently unknown. We propose membrane-associated mitochondria (MAM), along with sphingomyelinases, as the responsible for the increased VEs release after ethanol intake. We show that ethanol is capable of increasing phospholipid transfer activity, a marker of MAM activity. Moreover, MAM and sphingomyelinase inhibition resulted in depleted VEs secretion. These results suggest that ethanol promotes increased release of VEs by activating sphingomyelinase enzymes through MAM. VEs display certain biological characteristics, like the ability to cross the blood-brain barrier (BBB) or their high stability in serum, which make them good candidates for biomarkers of pathological situations. One of the elements present in VEs that has recently been used as a biomarker in various studies are miARNs, which are short-chain non-coding RNA molecules involved in gene regulation. It has been described that differential expression patterns of miARNs in circulating VEs can be detected in patients with neurodegenerative diseases, such as Alzheimer's, Parkinson's or others, when compared to healthy patients. In this study we demonstrate that ethanol is able to alter the inflammatory-related miARNs expression patterns in circulating VEs of young people with acute alcohol intoxication (IEA). Notably, the alterations in miARNs are dependent on the patient's gender, being women/females more affected by alcohol than men/males, since women/females showed lower presence of anti-inflammatory miARNs and a higher expression of inflammatory markers in brain tissue than men/males. / Ibáñez Cabanes, F. (2021). Papel de las vesículas extracelulares en la propagación y mantenimiento de la neuroinflamación inducida por el consumo de alcohol en la adolescencia [Tesis doctoral]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/174214

[ES] Los receptores tipo Toll, TLR, son receptores clave en la defensa contra los patógenos capaces de iniciar la respuesta inmunitaria innata para proteger al huésped. Su papel no solo se relega a responder a estímulos foráneos, sino que también pueden detectar daños en los tejidos o células lesionadas induciendo su respuesta a lo que se conoce como "inflamación estéril". Las células del sistema inmunitario no son las únicas que presentan TLR; también se encuentran en células de la glía, neuronas y precursores neurales (NPC). Concretamente, TLR2 y TLR4 en NPC en cerebro contribuyen a la determinación del destino celular y plasticidad neuronal durante el desarrollo. Sin embargo, sus funciones en la fisiología y patología de la médula espinal no están bien definidas, así como en procesos críticos como la neurogénesis, autorrenovación o proliferación. Esta tesis doctoral, distribuida entre tres capítulos, se ha centrado 1) en el estudio del papel de TLR2 y TLR4 en precursores derivados de medula espinal neonatal (Capítulo 1); 2) en evaluar el papel de ambos, TLR2 y TLR4 en el proceso de regeneración espontánea o tras trasplante ectópico de NPC, en un modelo de lesión medular inducida (Capítulo 2); 3) en el estudio del papel de TLR4 en la modulación del fenotipo inflamatorio en respuesta al proteoglicano condroitín sulfato (CSPG) secretado tras la lesión medular con actividad inhibitoria del recrecimiento axonal tras lesión medular (Capítulo 3). / [CA] Els receptors tipus Toll, TLR, són receptors clau en la defensa contra els patògens capaços d'iniciar la resposta immunitària innata per a protegir l'hoste. El seu paper no sols es relega a respondre a estímuls forans, sinó que també poden detectar danys en els teixits o cèl·lules lesionades induint la seua resposta al que es coneix com a "inflamació estèril". Les cèl·lules del sistema immunitari no són les úniques que presenten TLR; també es troben en cèl·lules de la glia, neurones i precursors neurals (NPC). TLR2 i TLR4 en NPC en cervell contribueixen a la determinació del destí cel·lular i plasticitat neuronal. No obstant això, les seues funcions en la fisiopatologia de la medul·la espinal no estan ben definides, així com en processos crítics com la neurogènesi, autorenovació o proliferació. Aquesta tesi doctoral, distribuïda entre tres capítols, s'ha centrat: 1) En l'estudi del paper de TLR2 i TLR4 en precursors derivats de medul·la espinal neonatal (Capítol 1); 2) A avaluar el paper de tots dos, TLR2 i TLR4, en el procés de regeneració espontània o després de trasplantament ectòpic de NPC, en un model de lesió medul·lar induïda (Capítol 2); 3) En l'estudi del paper de TLR4 en la modulació del fenotip inflamatori en resposta al proteoglicà condroití sulfat (CSPG) secretat després de la lesió medul·lar amb activitat inhibitòria del recreixement axonal després de lesió medul·lar (Capítol 3). / [EN] Toll-like receptors, TLRs, are key receptors in the defence against pathogens capable of initiating the innate immune response to protect the host. Their role is not only limited to responding to foreign stimuli, but they can also detect damage to injured tissues or cells, inducing their response to what is known as 'sterile inflammation'. Immune system cells are not the only cells that display TLRs; they are also found in glial cells, neurons and neural precursors cells (NPCs). TLR2 and TLR4 NPCs from brain contribute to cell fate determination and neuronal plasticity. However, their roles in spinal cord pathophysiology and in critical processes such as neurogenesis, self-renewal or proliferation are not well defined. This doctoral thesis, distributed among three chapters, has focused: 1) on the study of the role of TLR2 and TLR4 in neonatal spinal cord-derived precursors (Chapter 1); 2) on evaluating the role of both TLR2 and TLR4 in the process of spontaneous regeneration or after ectopic transplantation of NPC, in a model of induced spinal cord injury (Chapter 2); 3) to study the role of TLR4 in modulating the inflammatory phenotype in response to chondroitin sulphate proteoglycan (CSPG) secreted after spinal cord injury with inhibitory activity on axonal regrowth after spinal cord injury (Chapter 3). / The student has been granted with a PhD fellowship from a predoctoral program at the CIPF and with International Research and Training Exchange Programme at the CIPF. This work has been supported by the Spanish Ministry of Economy and Competitiveness (projects RTI2018-095872-B-C21; MAT2015-66666-C3-R; SAF2015-69187R) and Spanish Ministry of Heath, PNSD2018 I003. / Sánchez Petidier, M. (2022). Toll-like receptors in spinal cord derived neural precursor cells: implications on spinal cord injury and cell transplantation [Tesis doctoral]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/180753

[ES] El alcohol es una de las drogas más aceptadas y consumidas a nivel mundial, y su ingesta crónica causa alteraciones en el sistema nervioso central, desde desmielinización hasta muerte neural. Se ha demostrado que gran parte de estos efectos estarían mediados por la activación del sistema inmune innato, principalmente a través del receptor TLR4, que desemboca en un estado inflamatorio. Para ahondar en estos mecanismos, en esta tesis se pretende analizar si el consumo crónico de etanol puede causar modificaciones en los miARNs de la corteza cerebral, regulando la expresión de genes proinflamatorios asociados a la ruta de señalización del TLR4 y si el uso de la curcumina como terapia es capaz de disminuir estos efectos. Además, analizaremos si el consumo de alcohol a largo plazo es capaz de alterar la microbiota intestinal, y la implicación del TLR4 en estos procesos. Nuestros resultados demuestran que el etanol es capaz de alterar la expresión de diferentes microARNs que regulan la expresión de genes proinflamatorios y asociados a la vía del TLR4. La ausencia del receptor causa un perfil de expresión distinto tanto en los controles como en los animales alcohólicos crónicos. Puesto que en los últimos años nos hemos interesado en la búsqueda de una posible terapia para paliar la neuroinflamación producida por el etanol, hemos usado el BDMC, un curcuminoide con capacidad antiinflamatoria y antioxidante, para revertir los daños causados por el abuso del alcohol. Para su administración proponemos su conjugación con un polipéptido que elimina los tradicionales problemas asociados al uso de estos compuestos naturales como son su vida media corta y su baja biodisponibilidad, sin que hayamos registrado toxicidad. El uso de este polímero en animales con un consumo crónico de etanol produce una disminución de la inflamación, tanto a nivel proteico como de expresión génica. Considerando que otra de las regiones del organismo más afectadas por el alcohol es el tracto gastrointestinal, y que la población bacteriana puede ser modificada en determinadas enfermedades o por el uso de sustancias nocivas, produciendo una disbiosis, hemos comparado el efecto del alcohol sobre la población bacteriana y la participación del receptor TLR4 en estos efectos. Mediante análisis de expresión génica, confirmamos que el tejido intestinal ausente del receptor TLR4 es menos susceptible de sufrir cambios debidos al consumo de alcohol. Sin embargo, no hemos encontrado en estos animales la expresión aumentada de genes proinflamatorios característica de los tratamientos alcohólicos. Además, los ratones carentes de este receptor presentan una microbiota intestinal única y diferente a la encontrada en animales de genotipo normal, con sus propios cambios en el equilibrio bacteriano en respuesta a la ingesta de alcohol. Esta microbiota presenta menor cantidad de especies Gram - y mayor resistencia al desequilibrio ocasionado por el alcohol, que su contraparte en los ratones WT. En general, los resultados científicos que aparecen en esta tesis resaltan el papel del TLR4 en las alteraciones causadas por el consumo crónico de alcohol. Mostramos como cambios causados por el etanol a niveles tan distintos como la regulación mediante miARNs o la microbiota intestinal dependen en gran medida de la respuesta inicial que causa el alcohol en el TLR4. Dado que es un receptor necesario para el correcto funcionamiento de muchos órganos, planteamos un posible tratamiento mediante la inhibición de esta cascada inflamatoria. / [CA] L'alcohol és una de les drogues més acceptades i consumides a nivell mundial, i la seva ingesta crònica causa alteracions al sistema nerviós central, des de desmielinització fins a mort neural. S'ha demostrat que gran part d'aquests efectes estarien intervinguts per l'activació del sistema immune innat, principalment a través del receptor TLR4, que desemboca en un estat inflamatori. Per aprofundir en aquests mecanismes, en aquesta tesi es pretén analitzar si el consum crònic d'etanol pot causar modificacions als miARNs de l'escorça cerebral, regulant l'expressió de gens proinflamatoris associats a la ruta de senyalització del TLR4 i si l'ús de la curcumina com a teràpia és capaç de disminuir aquests efectes. A més, analitzarem si el consum d'alcohol a llarg termini és capaç d'alterar la microbiota intestinal i la implicació del TLR4 en aquests processos. Els nostres resultats demostren que l'etanol pot alterar l'expressió de diferents microARNs que regulen l'expressió de gens proinflamatoris i associats a la via del TLR4. L'absència del receptor causa un perfil d'expressió diferent tant als controls com als animals alcohòlics crònics. Com que els darrers anys ens hem interessat en trobar una possible teràpia per pal·liar la neuroinflamació produïda per l'etanol, hem utilizat el BDMC, un curcuminoide amb capacitat antiinflamatòria i antioxidant, per revertir els danys causats per l'abús de l'alcohol. Per a la seva administració proposem la seva conjugació amb un polipèptid que elimina els problemes tradicionals associats a l'ús d'aquests compostos naturals com són la seva vida mitjana curta i la seva baixa biodisponibilitat, sense que haguem registrat toxicitat. L¿ús d¿aquest polímer en animals amb un consum crònic d¿etanol produeix una disminució de la inflamació, tant a nivell proteic com d¿expressió gènica. Considerant que una altra de les regions de l'organisme més afectades per l'alcohol és el tracte gastrointestinal, i que la població bacteriana pot ser modificada en determinades malalties o per l'ús de substàncies nocives, produint una disbiosi, hem comparat l'efecte de l'alcohol sobre la població bacteriana i la participació del receptor TLR4 en aquests efectes. Mitjançant una anàlisi d'expressió gènica, confirmem que el teixit intestinal absent del receptor TLR4 és menys susceptible de patir canvis deguts al consum d'alcohol. Tot i això, no hem trobat en aquests animals l'expressió augmentada de gens proinflamatoris característica dels tractaments alcohòlics. A més, els ratolins sense aquest receptor presenten una microbiota intestinal única i diferent de la trobada en animals de genotip normal, amb els seus propis canvis en l'equilibri bacterià en resposta a la ingesta d'alcohol. Aquesta microbiota presenta menor quantitat d'espècies Gram - i més resistència al desequilibri ocasionat per l'alcohol, que la contrapart en els ratolins WT. En general, els resultats científics que apareixen en aquesta tesi ressalten el paper del TLR4 a les alteracions causades pel consum crònic d'alcohol. Mostrem com a canvis causats per l'etanol a nivells tan diferents com la regulació mitjançant miARNs o la microbiota intestinal depenen en gran mesura de la resposta inicial que causa l'alcohol al TLR4. Atès que és un receptor necessari per al funcionament correcte de molts òrgans, plantegem un possible tractament mitjançant la inhibició d'aquesta cascada inflamatòria. / [EN] Alcohol is one of the most accepted and consumed drugs worldwide, and its chronic consumption causes alterations in the central nervous system, such as demyelination and neural death. It has been shown that these effects would be mediated by the activation of the innate immune system, mainly through the TLR4 receptor, which leads to an inflammatory response. To inquire into these mechanisms, this thesis aims to analyse whether chronic ethanol consumption can cause changes in miRNAs in the cerebral cortex, regulating the expression of proinflammatory genes associated with the TLR4 signalling pathway, and whether the use of curcumin as a therapy it is able to reduce these effects. In addition, we will analyse if long-term alcohol consumption can alter the intestinal microbiota, and the involvement of TLR4 in these processes. Our results show that ethanol can alter the expression of different microRNAs that regulate the expression of proinflammatory genes associated with the TLR4 pathway. The absence of this receptor causes a different expression profile in both controls and chronic alcoholic animals. Taking into account our interest in seeking a possible therapy to alleviate the neuroinflammation caused by ethanol, we have used BDMC, a curcuminoid with anti-inflammatory and antioxidant activity, to ameliorate the damage caused by alcohol abuse. For its administration, we propose its conjugation with a polypeptide that eliminates the traditional problems associated with the use of these natural compounds, such as their short half-life and low bioavailability, with no toxicity recorded. The use of this polymer in animals with chronic ethanol consumption produces a decrease in inflammation, at both protein level and gene expression. Considering that another of the regions of the body most affected by alcohol is the gastrointestinal tract, and that bacterial population can be modified in certain diseases or due to harmful substances, producing dysbiosis, we have compared the effect of alcohol on the bacterial population and the participation of the TLR4 receptor in these effects. Using gene expression analysis, we confirm that intestinal tissue without TLR4 receptor show less changes induced by the alcohol consumption. However, we have not found in these animals an increased expression of proinflammatory genes which are observed in alcoholic treatments. In addition, mice lacking this receptor have a unique intestinal microbiota, which is different from the normal genotype animals, with their own changes in bacterial balance in response to alcohol intake. This microbiota has less Gram - species and greater resistance to imbalance caused by alcohol than its counterpart in WT mice. In general, the results of this thesis highlight the role of TLR4 in the alterations caused by chronic alcohol consumption. We show that ethanol can cause changes at different levels, such as regulation of miRNAs or intestinal microbiota, which largely depend on the TLR4 activation induced by ethanol. Therefore, herein we demonstrate the importance of the TLR4 to the correct activity of several body organs, and we propose a possible treatment by inhibiting its inflammatory cascade. / Cuesta Díaz, CM. (2022). Papel de los receptores TLR4 y de la microbiota intestinal en los procesos inflamatorios y neuroinflamatorios causados por el consumo crónico de alcohol, y posibles terapias con curcuminoides [Tesis doctoral]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/183832

[ES] El daño cerebral es la mayor causa de discapacidad en la etapa adulta, particularmente afectando a la población anciana. Independientemente de la causa, los diferentes tipos de daño cerebral comparten eventos fisiopatológicos similares. Hasta ahora, la mayoría de los estudios se enfocaron en estudiar las respuestas inmediatas tras la lesión, mientras que los mecanismos que subyacen bajo los procesos de plasticidad y regeneración cortical aún son desconocidos. Neuregulina 1 (Nrg1) es una proteína esencial en el desarrollo de los circuitos corticales que se ha asociado a diferentes trastornos psiquiátricos, como la esquizofrenia. En las últimas décadas, varios trabajos proponen a Nrg1 como un factor neuroprotector emergente en el ámbito de lesión. No obstante, la mayoría de las investigaciones se centran en estudiar la respuesta temprana de la forma soluble de Nrg1 tras el daño, mediada por la activación de los receptores ErbB, la cual no recapitula totalmente la compleja señalización de Nrg1. De este modo, nuestro laboratorio ha demostrado previamente que la señalización intracelular de Nrg1 se activa en situaciones de hipoxia, promoviendo la supervivencia neuronal tras ictus. El principal objetivo de esta tesis es estudiar el papel de la señalización de Nrg1 en la regeneración y plasticidad cortical tras daño cerebral. Para ello, hemos desarrollado nuevos modelos para 1) ofrecer una metodología que permita estudiar la regeneración axonal in vitro e in vivo y 2) específicamente estudiar el papel de la señalización intracelular de Nrg1 en el ámbito de daño cortical. Primero, desarrollamos un nuevo modelo in vitro de lesión axonal en cultivos de neuronas corticales, utilizando técnicas de electroporación para marcar un número limitado de neuronas, combinado con una posterior lesión física basada en una transección mecánica de los axones. En este modelo, también se realizaron estudios de ganancia y pérdida de función para comprender el papel de Nrg1 en el crecimiento axonal. Nuestros resultados mostraron que Nrg1, y específicamente la activación de su vía intracelular, potencia el crecimiento axonal tras daño. Posteriormente, diseñamos una metodología novedosa en ratones para estudiar la regeneración cortical, combinando técnicas de trazado de conexiones cortico-corticales con una lesión focal y mecánica en la corteza primaria motora. Se realizó una extensa caracterización funcional empleando diversas pruebas comportamentales específicas para detectar déficits motores en lesiones unilaterales como la ofrecida en este modelo. Gracias al procesamiento del tejido cerebral en series flotantes, se combinaron diferentes tinciones para realizar reconstrucciones 3D del cerebro y, así, ofrecer un estudio completo incluyendo medidas volumétricas y un análisis de diferentes poblaciones celulares y estructuras subcelulares. Como ejemplo, se investigó la correlación entre la eliminación de redes perineuronales y la activación de células microgliales en la zona adyacente a la lesión. Esta metodología de lesión cortical in vivo se utilizó en innovadores modelos genéticos de ratón en esta tesis para entender el papel de Nrg1 tras daño cortical. Así, se eliminó la expresión del gen de Nrg1 en ratonas jóvenes y maduras previamente a la lesión, observando que la ausencia de Nrg1 promueve la respuesta neuroinflamatoria y una preservación axonal limitada, conllevando una menor recuperación motora espontánea tras la lesión. Finalmente, para ofrecer una visión mecanicista del papel de la señalización intracelular de Nrg1, su dominio intracelular se expresó específicamente en neuronas corticales, observando que la activación de esta vía de señalización reduce la respuesta inflamatoria tras lesión cortical. En conclusión, estos resultados señalan que Nrg1, y específicamente la activación de su vía intracelular, podría ser una diana molecular prometedora en el contexto de neuroprotección, regeneración y recuperación cortical tras daño cerebral. / [CA] El dany cerebral és la major causa de discapacitat en l'etapa adulta, particularment en la població anciana. Independentment de la causa, els diferents tipus de dany cerebral comparteixen esdeveniments fisiopatològics similars. Fins ara, la majoria dels estudis es van enfocar a estudiar les respostes immediates després de la lesió, mentre que els mecanismes que subjauen sota els processos de plasticitat i regeneració cortical encara són desconeguts. Neuregulina 1 (Nrg1) és una proteïna essencial en el desenvolupament dels circuits corticals que s'ha associat a diferents trastorns psiquiàtrics, com l'esquizofrènia. En les últimes dècades, diversos treballs proposen a Nrg1 com un factor neuroprotector emergent en l'àmbit de lesió. No obstant això, la majoria de les investigacions se centren en estudiar la resposta primerenca de la forma soluble de Nrg1 després del mal, mediada per l'activació dels receptors ErbB, la qual no recapitula totalment la complexa senyalització de Nrg1. D'aquesta manera, el nostre laboratori ha demostrat prèviament que la senyalització intracel·lular de Nrg1 s'activa en situacions d'hipòxia, promovent la supervivència neuronal després de l'ictus. El principal objectiu d'aquesta tesi és estudiar el paper de la senyalització de Nrg1 en la regeneració i plasticitat cortical després de dany cerebral. Per a això, hem desenvolupat nous models per a 1) oferir una metodologia que permeta estudiar la regeneració axonal in vitro i in vivo i 2) específicament estudiar el paper de la senyalització intracel·lular de *Nrg1 en l'àmbit de mal cortical. Primer, desenvolupem un nou model in vitro de lesió axonal en cultius de neurones corticals, utilitzant tècniques de electroporació per a marcar un nombre limitat de neurones, combinat amb una posterior lesió física basada en una secció mecànica dels axons. En aquest model, també es van realitzar estudis de guany i pèrdua de funció per a comprendre el paper de Nrg1 en el creixement axonal. Aquests resultats van mostrar que Nrg1, i específicament l'activació de la seua via intracel·lular, potència el creixement axonal després de mal. Posteriorment, dissenyem una metodologia nova en ratolins per a estudiar la regeneració cortical, combinant tècniques de traçat de connexions cortico-corticals amb una lesió focal i mecànica en l'escorça primària motora. Es va realitzar una extensa caracterització funcional emprant diverses proves comportamentals específiques per a detectar dèficits motors en lesions unilaterals com l'oferida en aquest model. Gràcies al processament del teixit cerebral en sèries flotants, es van combinar diferents tincions per a realitzar reconstruccions 3D del cervell i, així, oferir un estudi complet incloent mesures volumètriques i una anàlisi de diferents poblacions cel·lulars i estructures subcel·lulars. Com a exemple, es va investigar la correlació entre l'eliminació de xarxes perineuronals i l'activació de cèl·lules microglials en la zona adjacent a la lesió. Aquesta metodologia de lesió cortical in vivo es va utilitzar en innovadors models genètics de ratolí per a entendre el paper de Nrg1 després de mal cortical. Es va eliminar l'expressió del gen de Nrg1 en ratolins joves i madurs prèviament a la lesió, observant que l'absència de Nrg1 promou la resposta neuroinflamatoria i una preservació axonal limitada, el que comporta una menor recuperació motora espontània després de la lesió. Finalment, per a oferir una visió mecanicista del paper de la senyalització intracel·lular de Nrg1, el seu domini intracel·lular es va expressar específicament en neurones corticals, observant que l'activació d'aquesta via de senyalització redueix la resposta inflamatòria després de lesió cortical. En conclusió, aquests resultats assenyalen que la senyalització de Nrg1, i específicament l'activació de la seua via intracel·lular, podria ser una diana molecular prometedora en el context de neuroprotecció, regeneració i recuperació cortical després de dany cerebral. / [EN] Brain damage is the leading cause of disability in adults, particularly in the elderly population. Regardless of the cause, different types of brain injury share similar physiopathological events. Most studies to date have focused on the immediate post-injury response, whereas less is known about cortical regeneration and plasticity after brain injury. Neuregulin 1 (Nrg1) is essential for the development of cortical circuits and has been implicated in several psychiatric disorders, such as schizophrenia. In the last decades, several works proposed Nrg1 signaling as an emergent modulator of neuroprotection upon damage. However, most research has focused on the early response of Nrg1 diffusible isoforms mediated by ErbB receptor activation after injury, which does not fully recapitulate the complexity of Nrg1 signaling. In this context, we have previously shown that Nrg1 intracellular signaling is activated under hypoxic conditions and promotes neuronal survival after cortical stroke. The overall goal of this dissertation is to investigate the role of Nrg1 signaling in cortical regeneration and plasticity after cortical damage. To achieve this goal, we developed novel, refined models to 1) provide new methodological approaches to study axonal regeneration in vitro and in vivo and 2) specifically target Nrg1 signaling and particularly investigate the role of Nrg1 intracellular pathway upon cortical injury. First, we developed a novel in vitro model of axonal injury in cortical neuron cultures. Specifically, we performed sparse labeling of the cultures by electroporation techniques and induced physical injury by mechanical transection of the axons. In this model, we also performed gain- and loss-of-function approaches to investigate the role of Nrg1 in axonal outgrowth. Our results showed that Nrg1, and specifically the activation of its intracellular signaling, potentiates axonal outgrowth upon injury. Second, we developed a novel methodology in mice that combines cortico-cortical projection tracing with focal mechanically controlled cortical damage (CCD) to study cortical regeneration. We performed extensive functional characterization of the model and provided meaningful behavioral tasks to detect motor impairment in unilateral focal injuries. Since tissue processing is performed in serial floating sections, we combined different immunolabeling and 3D brain reconstruction to evaluate stereological measurements and analysis of axonal projections and different cell populations. As a biological result, we showed a correlation between perineuronal nets (PNNs) disruption and microglial activation in the perilesional region. Later, we applied the CCD methodology in novel genetic mouse models to better understand the role of Nrg1 signaling in vivo after cortical injury. We induced acute Nrg1 deletion prior to injury in young and aged mice and observed that Nrg1 deletion promoted neuroinflammatory response and limited axonal preservation and spontaneous motor recovery after cortical injury. Finally, we specifically expressed Nrg1-ICD to provide a mechanistic perspective and observed that activation of this intracellular pathway decreased the neuroinflammatory response. Collectively, our results shed light on Nrg1 signaling, and specifically the activation of its intracellular pathway, as a promising molecular target in neuroprotection, cortical regeneration, and recovery after brain injury. / González Manteiga, A. (2023). Understanding the Role of Nrg1 Signaling Upon Brain Damage: Novel Models of Cortical Regeneration [Tesis doctoral]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/200224