Objetivos: Etapa 1 - avaliar características organolépticas e físico-químicas de formulações tópicas contendo nanopartículas lipídicas sólidas encapsulando curcuminoides; Etapa 2 - avaliar a citotoxicidade das nanopartículas lipídicas sólidas e dos curcuminoides encapsulados em nanopartículas lipídicas sólidas ou não em cultura de células de fibroblastos e queratinócitos com ou sem serem submetidos a RI; avaliar a atividade alergênica dos curcuminoides encapsulados em nanopartículas lipídicas sólidas ou não encapsulados; Etapa 3 - avaliar a toxicidade aguda de uma formulação contendo curcuminoides encapsulados em nanopartículas lipídicas sólidas na pele e em órgãos-alvo de camundongos BALB após 21 dias de aplicação tópica; induzir radiodermite em camundongos BALB; avaliar o efeito de formulações tópicas contendo curcuminoides encapsulados em nanopartículas lipídicas sólidas na prevenção e no tratamento de radiodermite, em camundongos BALB. Método: Etapa 1 - inspeção visual, cor, sensibilidade ao tato e odor, quantificação do pH, análise do comportamento reológico e quantificação de ativo (curcuminoides) das formulações; Etapa 2 - avaliação da viabilidade celular de queratinócitos, fibroblastos e mastócitos, quantificação da % de liberação da enzima ?-hexosaminidade em mastócitos; Etapa 3 - avaliação do peso, consumo alimentar e comportamento dos animais; quantificação de marcadores sanguíneos de toxicidade renal (ureia e creatinina) e hepática (TGP, FA e proteínas totais); análises histológicas qualitativas do coração, fígado, rim, pulmão e pele; quantificação de colágeno na pele; analisar a probabilidade de desenvolvimento de radiodermite, em grupos independentes, após crescentes doses de radiação ionizante; quantificação de citocinas (IL-1?, IL-6, IL-10, KC e FNT-?) avaliação do grau de radiodermite. Resultados: Etapa 1 - as formulações permaneceram estáveis por três meses, sem alteração de características organolépticas e físico-químicas; aos seis meses a formulação mais concentrada ficou mais opaca e observou-se aumento do pH e da perda de curcumina e curcuminoides totais; Etapa 2 - os resultados mostraram que as nanopartículas lipídicas sólidas são mais citotóxicas para os queratinócitos do que para os fibroblastos nas doses avaliadas, apesar de serem menos citotóxicas que os curcuminoides não encapsulados; não se observou diferença na viabilidade destas células sem ou após radiação ionizante (2 Gy); as nanopartículas lipídicas sólidas contendo curcuminoides e os curcuminoides não encapsulados não estimularam a liberação de ?-hexosaminidase em mastócitos, sugerindo que a formulação com nanopartículas não possui propriedades alergênicas. Etapa 3 - a formulação tópica contendo nanopartículas lipídicas sólidas com 30 mg de curcuminoides não conferiu toxicidade local e nem aos órgãos-alvo; os animais não apresentaram perda ponderal, alterações comportamentais ou mudanças na ingestão alimentar ou hídrica; foi possível a indução de radiodermite a partir de 25 Gy, sendo 30 Gy a que apresentou maior probabilidade de desenvolvimento; os animais não apresentaram perda ponderal, redução do consumo alimentar e hídrico significativos; o painel de citocinas avaliado evidenciou que a pele responde ao tratamento de forma diferente do controle da radiação; não foi observado infiltrado inflamatório; a quantificação do colágeno mostrou grande variabilidade. Conclusões: Devido a uma toxicidade mínima do sistema nanocarreador desenvolvido, somos encorajados a realizar testes futuros para aplicações clínicas em dermocosmética e na prevenção e tratamento de lesões cutâneas ou osteoarticulares / Aims: Step 1 - to evaluate organoleptic and physicochemical characteristics of topical formulations containing solid lipid nanoparticles encapsulating curcuminoids; Step 2 - to evaluate the cytotoxicity of solid lipid nanoparticles and curcuminoids encapsulated in solid lipid nanoparticles or not in culture of fibroblast and keratinocytes cells without and after being submitted to IR; to evaluate the allergenic activity of encapsulated curcuminoids in solid or non-encapsulated lipid nanoparticles; Step 3 - to evaluate the acute toxicity of a formulation containing encapsulated curcuminoids in solid lipid nanoparticles on the skin and target organs of BALB mice after 21 days of topical application; to induce radiodermatitis in BALB mice; to evaluate the effect of topical formulations containing encapsulated curcuminoids in solid lipid nanoparticles in the prevention and treatment of radiodermatitis in BALB mice. Method: Step 1 - visual inspection, color, sensitivity to touch and odor, pH quantification, rheological behavior analysis and quantification of active (curcuminoids) of the formulations; Step 2 - evaluation of the cellular viability of keratinocytes, fibroblasts and mast cells, quantification of the release % of ?-hexosaminase enzyme in mast cells; Step 3 - evaluation of weight, food consumption and behavior of the animals, quantification of markers of renal toxicity (urea and creatinine) and hepatic (TGP, FA and total proteins), qualitative histological analysis of the skin, heart, liver, kidney and lung and quantitative analysis of collagen in the skin; analysis of the probability to developing radiodermatitis in independent groups after increasing doses of ionizing radiation; quantification of the cytokines (IL-1?, IL-6, IL-10, KC and TNF-?) and collagen, qualitative histological analyzis of the skin, and the degree of radiodermatitis. Results: Step 1 - the formulations remained stable for three months, without alteration of organoleptic and physicochemical characteristics; at six months the more concentrated formulation became more opaque and there was an increase in pH and loss of curcumin and total curcuminoids; Step 2 - the results showed that solid lipid nanoparticles are more cytotoxic for keratinocytes than for fibroblasts at the doses evaluated, although they were less cytotoxic than non-encapsulated curcuminoids; no significant difference was observed in the viability of these cells without or after ionizing radiation (2 Gy); the solid lipid nanoparticles containing curcuminoids and non-encapsulated curcuminoids did not estimulated ?-hexosaminidase release in mast cells, suggesting that the nanoparticle formulation does not have allergenic properties. Stage 3 - the topical formulation containing solid lipid nanoparticles with 30 mg curcuminoids did not confer local toxicity and nor to the target organs the animals did not showed any weight loss, behavioral changes or changes in food or water ingestion; the radiodermatitis induction was possible from 25 Gy, with the dose of 30 Gy being the most likely to develop; the animals had no significant weight loss, nor reduction in food and water ingestion, the cytokine panel evaluated showed that skin responds to treatment differently from radiation control, no inflammatory infiltrate was evident and the quantification of collagen showed great variability. Conclusions: Due to the minimal toxicity of the developed nanocarrier system, we are encouraged to perform future tests for clinical applications in dermocosmetic and in the prevention and treatment of cutaneous or osteoarticular lesions

Ce travail de thèse consacré à la chimie de Zingiberaceae est divisé en deux parties distinctes.Dans la première partie, une étude phytochimique des rhizomes d'une plante africaine, Aframomum sceptrum K. Schum., couramment employée en Côte d'Ivoire, a été réalisée. Deux nouveaux composés, nommés sceptrumlabdalactone A et sceptrumlabdalactone B ont été isolés. Ce sont des composés terpéniques type labdane. Le sceptrumlabdalactone B est fortement actif contre L. donovani, avec une CI50 proche de celle de la pentamidine.L'extraction de l'huile essentielle des rhizomes a également été réalisée par hydrodistillation. L'analyse de l'huile par GC-MS a montré la présence de mono- et de sesquiterpènes avec une quasi-absence de monoterpènes aromatiques. L'évaluation des activités biologiques de l'huile a montré une activité contre les bactéries à Gram positif, et dans une moindre mesure, contre les bactéries à Gram négatif. Une forte activité trichomonicide a aussi été constatée.La deuxième partie, est consacrée à la curcumine. Ce diarylheptanoïde, est fréquent dans plusieurs Curcumas, Des analogues originaux, par exemple prénylés ont été préparés. Plusieurs activités biologiques (activités antiparasitaires, antibactériennes, anti-inflammatoires, anti-agrégation de la protéine β-amyloïde) ont été évaluées in vitro. L'activité anti-inflammatoire apparait différente de celle du produit de départ pour un des analogues.De même, la désaromatisation oxydante de la curcumine et ses analogues a permis l'accès en une ou deux étapes à des composés originaux à pharmacophore largement modifié.Des nanoparticules à base de "curcumine-squalénisée" ont également été préparées afin de surmonter le problème de la faible biodisponibilité de la curcumine. L'activité leishmanicide in vitro semble prometteuse.

Orientador: Luis Octavio Regasini / Resumo: As micoses superficiais e cutâneas são infecções fúngicas que acometem a camada mais externa do estrato córneo da pele e seus anexos. São as micoses mais frequentes dentre todas as infecções fúngicas e estão distribuídas por todo o mundo, afetando todas as faixas etárias. O impacto primário destas micoses é seu aspecto visual com estética negativa. Contudo, não se restringem apenas ao aspecto estético, vindo a ser um grave problema de saúde na população neonatal, senescente e de imunocomprometidos. Além disso, muitos fármacos exibem toxicidade alta, interações medicamentosas e alto custo econômico. As recidivas por meio do tratamento convencional costumam ser frequentes, as quais podem ser ocasionadas por cepas resistentes. Esse cenário torna premente a busca por antifúngicos inovadores. No presente estudo avaliou-se atividade antifúngica de 19 curcuminoides, provenientes da composteca do Laboratório de Antibióticos e Quimioterápicos (LAQ), contra fungos filamentosos dermatofíticos dos gêneros Trichophyton, Epidermophyton e Microsporum e leveduriformes (Candida spp.), de cepas de referência ATCC e de isolados clínicos, provenientes da coleção do Laboratório de Microbiologia da Faculdade de Medicina de São José do Rio Preto (FAMERP), bem como avaliou-se toxicidade dos curcuminoides mais potentes contra células de queratinócitos humanos (HaCat) e larva G. mellonella. Afim de verificar a atividade antifúngica dos compostos, foram determinados os valores: Concentração Inibitória ... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Superficial and cutaneous mycoses are fungal infections that affect the outermost layer of the stratum corneum of the skin and its attachments. They are the most frequent mycoses among all fungal infections and are distributed all over the world. The first impact of these mycoses is their visual appearance with a negative aesthetic. However, they are not restricted to the aesthetic aspect, becoming a serious health problem in the neonatal, senescent and immunocompromised population. In addition, many drugs exhibit high toxicity, drug interactions and high economic cost. Relapses through conventional treatment are often frequent, which can be caused by resistant strains. This scenario demands the development of potent but safer compounds. Herein, we described the antifungal activity of a novel curcuminoid against dermatophyte and Candida species. A series of nineteen curcuminoid analogs was submitted to antifungal assay to assess MIC (minimum inhibitory concentration) and MFC (minimum fungicidal concentration) determined by the broth microdilution method. First, all compound were tested at 31.2 µg mL-1 in order to select the most active compound. The compound 3, 3'-Dimethoxycurcumin (DMC) showed the highest growth-inhibitory activity the largest spectrum of action against dermatophyte clinical isolates and reference strains of Candida tropicalis ATCC and Trichophyton rubrum CBS, with MIC values range of 1.9±31.2 µg mL-1. DMC exhibited fungistatic activity. Inverted microscope ... (Complete abstract click electronic access below) / Mestre

Neste trabalho, uma série de curcuminoides monocetônicos foram sintetizados por meio da condensação entre acetona e 11 diferentes aldeídos aromáticos. Esses curcuminoides foram posteriormente convertidos em seus álcoois e cetonas saturados correspondentes por meio de reações de hidrogenação catalítica. Os compostos obtidos foram avaliados quanto às suas atividades antimicrobianas frente a um painel representativo de bactérias cariogênicas empregando o método de microdiluição em microplacas. Além disso, as vias de fragmentação em fase gasosa dos curcuminoides monocetônicos protonados foram investigadas por espectrometria de massas sequencial com ionização por eletrospray (ESI-MS/MS) em combinação com dados de massas acuradas, dados de experimentos de espectrometria de massas de estágios múltiplos (MSn) e de troca de deutério, bem como em dados termoquímicos estimados por Química Computacional. Dentre os 31 curcuminoides avaliados, a curcumina A (10), 1E,4E)-1,5-bis(4-hidroxifenil)penta-1,4-dien-3-ona, e o (1E,4E)-1,5-bis(4-hidroxifenil)penta-1,4-dien-3-ona (11), apresentaram a atividade antimicrobiana mais efetiva, com valores de concentração inibitória mínima (CIM) de 50 g/mL contra Streptococcus mutans e de 50 g/mL contra Streptococcus mitis. Os valores de CIM obtidos foram menores que os valores de CIM previamente relatados para a curcumina, que é o análogo -dicetônico do composto 10. As relações estrutura-atividade inferidas sugerem que o grupo hidroxila ligado aos aneis aromáticos e a ligação dupla entre C2-C3 e C2-C3 e o grupo carbonila e C1 são as características responsáveis pela atividade antimicrobiana. Os resultados mostraram que o íon H e o íon acílio D, resultantes de dois rearranjos de hidrogênio competitivos, são os mais intensos no espectro de íons produtos dos curcuminoides protonados. Além da identificação de alguns íons diagnósticos, este trabalho comprovou que a formação de alguns íons produtos ocorreu a partir de um íon intermediário resultante de uma ciclização de Nazarov da molécula protonada, cuja ocorrência foi reportada previamente na literatura. Os dados termoquímicos suportaram as estruturas dos íons propostos e mostraram que a posição da hidroxila fenólica no anel aromático desempenha um papel fundamental sobre a ciclização de Nazarov. Os resultados deste trabalho poderão contribuir futuramente na identificação dos produtos resultante do metabolismo dos estudos in vitro e in vivo sem a necessidade de padrões ou isolamento desses metabolitos / In this work, a series of monoketone curcuminoids were synthesized by condensation between acetone, and 11 (eleven) different aromatic aldehydes. These curcuminoids were subsequently converted to their corresponding saturated alcohols and ketones by means of catalytic hydrogenation reactions. The obtained compounds were evaluated for their antimicrobial activities against a representative panel of cariogenic bacteria using microdilution plating method. In addition, the gas-phase fragmentation pathways of the protonated monoketone curcuminoids were investigated by ionization tandem mass spectrometry (ESI-MS/MS) in combination with accurate mass data, multi-stage mass spectrometry (MSn), and deuterium exchange experiments, as well as in thermochemical data estimated by Computational Chemistry. Among the 31 curcuminoids evaluated, curcumin A (10), (1E,4E)-1,5-bis(4-hydroxyphenyl)penta-1,4-dien-3-one, and (1E,4E)5-bis(4-hydroxyphenyl)penta-1,4-dien-3-one (11) showed the most effective antimicrobial activity, with minimum inhibitory concentration (MIC) values of 50 g/mL against Streptococcus mutans and 50 g/mL against Streptococcus mitis. MIC values of curcumin A (10) were lower than the previously reported MIC values for its -diketone analog of compound 10. The inferred structure-activity relationships indicated that the hydroxyl group attached to the aromatic rings and the double bond between C2-C3 and C2\'-C3 \'and the carbonyl group and C1 are the characteristics responsible for the antimicrobial activity. The results showed that the ion H and the acylium ion D, resulting from two competitive hydrogen rearrangements, are the most intense in the spectrum of proton curcuminoids product ions. Besides the identification of some diagnostic ions, this work proved that the formation of some product ions occured from an intermediate ion resulting from a Nazarov cyclization of the protonated molecule, whose occurrence has been previously reported in the literature. The thermochemical data supported the structures of the proposed ions and showed that the position of the phenolic hydroxyl in the aromatic ring plays a key role in the Nazarov cyclization. The results of this work may contribute in future to the identification of products from the in vitro and in vivo metabolism studies without the need for standards or isolation of these metabolites

Tesis por compendio / [ES] La biotecnología de plantas actual, y la llamada agricultura molecular aspiran a convertir las plantas en "biofábricas" sostenibles para producir compuestos de valor como proteínas, metabolitos o nanopartículas de interés farmacéutico o industrial. Los virus de plantas constituyen una de las principales causas de enfermedades vegetales. Son capaces de secuestrar la maquinaria celular del huésped, y de ahí surgió la idea de reconvertir los virus de plantas en herramientas para la biotecnología de plantas como vectores de expresión transitoria y andamios para nanomateriales. Los carotenoides son metabolitos relevantes debido a sus propiedades nutricionales y beneficiosas para la salud. El primer objetivo fue manipular la ruta de biosíntesis de carotenoides para producir los muy apreciados apocarotenoides de azafrán, siendo estos los productos de la escisión de carotenoides. Para ello, se diseñó un vector derivado del virus del grabado del tabaco (TEV; género Potyvirus) manipulado para expresar unas enzimas específicas, dioxigenasas de escisión de carotenoides (CCD) de Crocus sativus y Buddleja davidii. Los análisis metabólicos de los tejidos infectados demostraron que, tras sólo dos semanas, se alcanzaron cantidades notables de crocinas y picrocrocina en plantas adultas de Nicotiana benthamiana. Sólo la expresión de CsCCD2L de C. sativus dio una acumulación en hoja de 0.2% de crocinas y 0.8% de picrocrocina en peso seco. La coexpresión de CsCCD2L con otra enzima carotenogénica, como la fitoeno sintasa de Pantoea ananatis (PaCrtB), usando el mismo vector aumentó la acumulación de crocinas al 0.35%. Pese a ser cantidades inferiores a las encontradas en fuentes naturales, este sistema mediado por virus representa el primer sistema heterólogo capaz de producir crocinas. Los compuestos fenólicos son otro amplio grupo de metabolitos secundarios en plantas muy apreciados también. Los curcuminoides son polifenoles con alta actividad antioxidante que se encuentran naturalmente en el rizoma de la cúrcuma (Curcuma longa). El segundo objetivo fue establecer un sistema para la producción heteróloga de curcuminoides utilizando vectores virales. Para ello, se desarrolló un sistema viral doble, basado en TEV y en el virus X de la patata (PVX; género Potexvirus), capaz de coexpresar diferentes enzimas biosintéticas en las mismas células. Este sistema se usó para expresar la dicétido-CoA sintasa 1 (DCS1) y la curcumina sintasa 3 (CURS3) de C. longa en plantas de N. benthamiana. El análisis metabólico confirmó la producción exitosa de curcuminoides usando dos vectores virales. Posteriormente se analizó la coexpresión de DCS1 y CURS3 usando un solo vector viral derivado de TEV, obteniendo una producción más eficiente, aumentando al doble la acumulación de curcumina. Tras un análisis temporal usando el vector TEVΔN-DCS1-CURS3, se vio que a los 11 días se lograba una acumulación máxima de 22 ± 4 µg/g peso seco. Las nanopartículas virales (VNP) también han atraído la atención en biotecnología por su uso potencial como componentes básicos para nuevos materiales en nanotecnología y medicina. Los nanoanticuerpos son los dominios variables de los anticuerpos de camélidos de sólo cadena pesada (VHH) que han ganado interés como moléculas terapéuticas por su estructura simple, tamaño pequeño y alta especificidad. El último objetivo de este trabajo fue producir VNPs decoradas con un nanoanticuerpo codificadas genéticamente. El virus del mosaico amarillo del calabacín (ZYMV; género Potyvirus) y TEV se utilizaron como andamios para producir VNPs decoradas con un nanoanticuerpo contra la proteína verde fluorescente en plantas de calabacín y N. benthamiana, respectivamente. Confirmándose el ensamblaje y unión de ambas VNPs contra GFP. En conjunto, el trabajo presentado en esta tesis contribuye al concepto de que los virus de plantas, convenientemente manipulados, pueden convertirse en poderosas herramientas en biotecnología vegetal y agricultura molecular. / [CA] La biotecnologia de plantes actual i la anomenada agricultura molecular aspiren a convertir les plantes en "biofàbriques" sostenibles per a produir compostos de valor com a proteïnes, metabòlits o nanopartícules d'interès farmacèutic o industrial. Els virus de plantes constitueixen una de les principals causes de malalties vegetals. Son capaços de segrestar la maquinària cel·lular de l'hoste, i d'ací va sorgir la idea de reconvertir els virus en eines per la biotecnologia de plantes com a vectors d'expressió transitòria i bastides per a nanomaterials. Els carotenoides són metabòlits rellevants a causa de les seues propietats nutricionals i beneficioses per a la salut. El primer objectiu va ser manipular la ruta de biosíntesi de carotenoides per a produir els valuosos apocarotenoides de safrà, sent aquests els productes de l'escissió de carotenoides. Per a això, es va dissenyar un vector derivat del virus del gravat del tabac (TEV; gènere Potyvirus) manipulat per a expressar uns enzims específics, dioxigenases d'escissió de carotenoides (CCD) de Crocus sativus i Buddleja davidii. Les anàlisis metabòliques dels teixits infectats van demostrar que, després de només dues setmanes, es van aconseguir quantitats notables de crocines i picrocrocina en plantes adultes de Nicotiana benthamiana. Només l'expressió de CsCCD2L de C. sativus va donar com a resultat una acumulació en fulla de 0.2% de crocines i 0.8% de picrocrocina en pes sec. La coexpressió de CsCCD2L amb un altre enzim carotenogènic, com la fitoé sintasa de Pantoea ananatis (PaCrtB), usant el mateix vector viral va augmentar l'acumulació de crocines al 0.35%. Malgrat ser quantitats inferiors a les trobades en fonts naturals, aquest sistema mediat per virus representa el primer sistema heteròleg capaç de produir crocines. Els compostos fenòlics són un altre ampli grup de metabòlits secundaris en plantes, també molt valuosos. Els curcuminoides són polifenols amb alta activitat antioxidant que es troben naturalment en el rizoma de la cúrcuma (Curcuma longa). El segon objectiu va ser establir un sistema per a la producció heteròloga de curcuminoides utilitzant vectors virals. Per a això, es va desenvolupar un sistema viral doble, basat en TEV i en el virus X de la creïlla (PVX; gènere Potexvirus, família Alphaflexiviridae), capaç de coexpressar diferents enzims biosintètics en les mateixes cèl·lules. Aquest sistema es va usar per a expressar la dicétid-CoA sintasa 1 (DCS1) i la curcumina sintasa 3 (CURS3) de C. longa en plantes de N. benthamiana. L'anàlisi metabòlica va confirmar la producció reeixida de curcuminoides. Posteriorment es va analitzar la coexpresió de DCS1 i CURS3 usant un sol vector viral derivat de TEV, obtenint una producció més eficient, augmentant al doble l'acumulació de curcumina. Una anàlisi temporal usant el vector TEVΔN-DCS1-CURS3 va mostrar que als 11 dies s'aconseguia una acumulació màxima de 22 ± 4 µg/g pes sec. Les nanopartícules virals (VNP) també han atret l'atenció en biotecnologia pel seu ús potencial com a components bàsics per a nous materials en nanotecnologia i medicina. Els nanoanticossos són els dominis variables dels anticossos de camèlids de només cadena pesada (VHH) que han guanyat interès com a molècules terapèutiques per la seua estructura simple, grandària xicoteta i alta especificitat. L'últim objectiu d'aquest treball va ser produir VNPs decorades amb un nanoanticos codificades genèticament. El virus del mosaic groc de la carabasseta (ZYMV; gènere Potyvirus) i TEV es van utilitzar com a bastides per a produir VNPs decorades amb un nanocos contra la proteïna verda fluorescent en plantes de carabasseta i N. benthamiana, respectivamente. Confirmant-se l'assemblatge i unió de les VNPs contra GFP. En conjunt, el treball presentat en aquesta tesi contribueix al concepte que els virus de plantes, convenientment manipulats, poden convertir-se en poderoses eines en biotecnologia vegetal i agricultura molecular. / [EN] Modern plant biotechnology and molecular farming aim to convert plants into sustainable 'biofactories' to produce valuable compounds as proteins, metabolites or nanoparticles of pharmaceutical or industrial interest. Plant viruses, constitute a major cause of plant diseases inducing devastating crop losses. Based on their ability to hijack the host cell machinery, it arose the idea of repurposing plant viruses from foes to friends into tools for plant biotechnology as transient expression vectors and scaffolds for nanomaterials. Carotenoids are relevant metabolites based on their nutritional and health-promoting properties. The first goal of this work was to manipulate the carotenoid biosynthesis pathway to produce highly appreciated saffron apocarotenoids. For this purpose, a vector derived from Tobacco etch virus (TEV; genus Potyvirus, family Potyviridae) was engineered to express specific carotenoid cleavage dioxygenase (CCD) enzymes from Crocus sativus and Buddleja davidii. Metabolic analyses of infected tissues demonstrated that, after only two weeks, remarkable amounts of crocins and picrocrocin in adult Nicotiana benthamiana plants were reached. The sole virus-driven expression of C. sativus CsCCD2L resulted in an accumulation of 0.2% of crocins and 0.8% of picrocrocin in leaf dry weight (DW). Co-expression of CsCCD2L with another carotenogenic enzyme, such as Pantoea ananatis phytoene synthase (PaCrtB), using the same viral vector increased crocin accumulation to 0.35%. Although these amounts are still far from those accumulating in natural sources, such as saffron stigma, this virus-driven system represents the first heterologous system able to produce crocins. Phenolic compounds represent another broad group of plant secondary metabolites highly appreciated for their health promoting properties. Curcuminoids are polyphenols with high antioxidant activity that are naturally found in turmeric (Curcuma longa) rhizome. The second goal of this work was to establish a system for the heterologous production of curcuminoids using viral vectors. To this aim, a double-virus vector system, based on TEV and Potato virus X (PVX; genus Potexvirus, family Alphaflexiviridae), able to co-express different biosynthetic enzymes in the same cells was developed. This system was used to express C. longa diketide-CoA synthase 1 (DCS1) and curcumin synthase 3 (CURS3) in N. benthamiana plants. Metabolic analysis confirmed the successful production of curcuminoids. Curcumin quantification indicated that sequential inoculation of both viral vectors was more efficient than co-inoculation. Co-expression of DCS1 and CURS3 was next analysed using a single viral vector derived from TEV (TEVΔN-DCS1-CURS3). This resulted in a more efficient approach as it led to a 2-fold increase in curcumin accumulation (11.7 ± 1.5 µg/g DW). A time-course analysis using the TEVΔN-DCS1-CURS3 vector showed that a maximum accumulation of 22 ± 4 µg/g DW was achieved at 11 days post-inoculation. Viral nanoparticles (VNPs) have also attracted attention in biotechnology for their potential use as building blocks for novel materials in nanotechnology and medicine. Nanobodies are the variable domains of heavy-chain (VHH) camelid antibodies that have sparked interest as therapeutic molecules due to their simple structure, small size and high specificity. The last goal of this work was to produce genetically encoded VNPs decorated with a nanobody. Zucchini yellow mosaic virus (ZYMV; genus Potyvirus, family Potyviridae) and TEV were used as scaffolds to produce VNPs decorated with a nanobody against the green fluorescent protein in zucchini (Cucurbita pepo) and N. benthamiana plants, respectively. Assembly and binding functionality of both VNPs against GFP was confirmed. Altogether, the work presented in this thesis contribute to the concept that plant viruses, conveniently manipulated, can turn into powerful tools in plant biotechnology and molecular farming. / This work was supported by grants BIO2016-77000-R, PID2020-114691RB-I00 and BIO2017-83184-R from the Spanish Ministerio de Ciencia, Innovación y Universidades (co-financed European Union FEDER funds). M.M. was the recipient of a predoctoral fellowship from the Spanish Ministerio de Educación, Cultura y Deporte (FPU16/05294). / Martí Botella, MC. (2022). Plant-Based Production of Metabolites and Nanoparticles Using Potyvirus Vectors [Tesis doctoral]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/187155 / TESIS / Compendio

Ce travail de thèse consacré à la chimie de Zingiberaceae est divisé en deux parties distinctes.Dans la première partie, une étude phytochimique des rhizomes d’une plante africaine, Aframomum sceptrum K. Schum., couramment employée en Côte d’Ivoire, a été réalisée. Deux nouveaux composés, nommés sceptrumlabdalactone A et sceptrumlabdalactone B ont été isolés. Ce sont des composés terpéniques type labdane. Le sceptrumlabdalactone B est fortement actif contre L. donovani, avec une CI50 proche de celle de la pentamidine.L’extraction de l’huile essentielle des rhizomes a également été réalisée par hydrodistillation. L’analyse de l’huile par GC-MS a montré la présence de mono- et de sesquiterpènes avec une quasi-absence de monoterpènes aromatiques. L’évaluation des activités biologiques de l’huile a montré une activité contre les bactéries à Gram positif, et dans une moindre mesure, contre les bactéries à Gram négatif. Une forte activité trichomonicide a aussi été constatée.La deuxième partie, est consacrée à la curcumine. Ce diarylheptanoïde, est fréquent dans plusieurs Curcumas, Des analogues originaux, par exemple prénylés ont été préparés. Plusieurs activités biologiques (activités antiparasitaires, antibactériennes, anti-inflammatoires, anti-agrégation de la protéine β-amyloïde) ont été évaluées in vitro. L’activité anti-inflammatoire apparait différente de celle du produit de départ pour un des analogues.De même, la désaromatisation oxydante de la curcumine et ses analogues a permis l’accès en une ou deux étapes à des composés originaux à pharmacophore largement modifié.Des nanoparticules à base de "curcumine-squalénisée" ont également été préparées afin de surmonter le problème de la faible biodisponibilité de la curcumine. L’activité leishmanicide in vitro semble prometteuse. / During our research for fighting human African trypanosomiasis (sleeping sickness), two approaches were employed; firstly the traditional use of plants, secondly the synthesis of original derivatives of curcumin.In the first part, a bioguided fractionation of a methanolic extract of the rhizomes of Aframomum sceptrum K. Schum (Zingiberaceae) allowed the isolation of five compounds, including new labdanes, named sceptrumlabdalactone A and sceptrumlabdalactone B successively. Sceptrumlabdalactone B was reasonably active against T. brucei brucei, and strongly active against L. donovani, with IC50 close to that of pentamidine.The essential oil from the rhizomes of the species might also contribute to its biological activity. It was obtained by hydrodistillation and analyzed by GC–MS. Its major constituents were β-pinene, caryophyllene oxide and cyperene. It exhibited strong bactericidal activity against Gram-positive bacteria. It only showed moderate bacteriostatic activity against Gram-negative bacteria. Remarkable activities against T. b. brucei and Trichomonas vaginalis were also observed.The second part is devoted to curcumin. This diarylheptanoid, is common in several Curcuma spp.Structural modifications and preparation of nanoparticles of curcumin were carried out to increase its activities and/or overcome the problem of the low bioavailability of this compound.Original analogs, e.g. prenylated curcumins were prepared. Several biological activities (antiparasitic, anti-inflammation, Inhibition of β–amyloid aggregation, etc) were evaluated in vitro.Similarly, the oxidative dearomatization of curcumin and its analogues allowed the access to novel original compounds.Finally, the coupling of curcumin and squalene was achieved. The resulting molecules were able to form spherical nanoassemblies that may overcome bioavailability issues. Antiparasitic, antibacterial, and cytotoxic activities were also evaluated. The in vitro leishmanicidal activity seems promising.

[ES] El alcohol es una de las drogas más aceptadas y consumidas a nivel mundial, y su ingesta crónica causa alteraciones en el sistema nervioso central, desde desmielinización hasta muerte neural. Se ha demostrado que gran parte de estos efectos estarían mediados por la activación del sistema inmune innato, principalmente a través del receptor TLR4, que desemboca en un estado inflamatorio. Para ahondar en estos mecanismos, en esta tesis se pretende analizar si el consumo crónico de etanol puede causar modificaciones en los miARNs de la corteza cerebral, regulando la expresión de genes proinflamatorios asociados a la ruta de señalización del TLR4 y si el uso de la curcumina como terapia es capaz de disminuir estos efectos. Además, analizaremos si el consumo de alcohol a largo plazo es capaz de alterar la microbiota intestinal, y la implicación del TLR4 en estos procesos. Nuestros resultados demuestran que el etanol es capaz de alterar la expresión de diferentes microARNs que regulan la expresión de genes proinflamatorios y asociados a la vía del TLR4. La ausencia del receptor causa un perfil de expresión distinto tanto en los controles como en los animales alcohólicos crónicos. Puesto que en los últimos años nos hemos interesado en la búsqueda de una posible terapia para paliar la neuroinflamación producida por el etanol, hemos usado el BDMC, un curcuminoide con capacidad antiinflamatoria y antioxidante, para revertir los daños causados por el abuso del alcohol. Para su administración proponemos su conjugación con un polipéptido que elimina los tradicionales problemas asociados al uso de estos compuestos naturales como son su vida media corta y su baja biodisponibilidad, sin que hayamos registrado toxicidad. El uso de este polímero en animales con un consumo crónico de etanol produce una disminución de la inflamación, tanto a nivel proteico como de expresión génica. Considerando que otra de las regiones del organismo más afectadas por el alcohol es el tracto gastrointestinal, y que la población bacteriana puede ser modificada en determinadas enfermedades o por el uso de sustancias nocivas, produciendo una disbiosis, hemos comparado el efecto del alcohol sobre la población bacteriana y la participación del receptor TLR4 en estos efectos. Mediante análisis de expresión génica, confirmamos que el tejido intestinal ausente del receptor TLR4 es menos susceptible de sufrir cambios debidos al consumo de alcohol. Sin embargo, no hemos encontrado en estos animales la expresión aumentada de genes proinflamatorios característica de los tratamientos alcohólicos. Además, los ratones carentes de este receptor presentan una microbiota intestinal única y diferente a la encontrada en animales de genotipo normal, con sus propios cambios en el equilibrio bacteriano en respuesta a la ingesta de alcohol. Esta microbiota presenta menor cantidad de especies Gram - y mayor resistencia al desequilibrio ocasionado por el alcohol, que su contraparte en los ratones WT. En general, los resultados científicos que aparecen en esta tesis resaltan el papel del TLR4 en las alteraciones causadas por el consumo crónico de alcohol. Mostramos como cambios causados por el etanol a niveles tan distintos como la regulación mediante miARNs o la microbiota intestinal dependen en gran medida de la respuesta inicial que causa el alcohol en el TLR4. Dado que es un receptor necesario para el correcto funcionamiento de muchos órganos, planteamos un posible tratamiento mediante la inhibición de esta cascada inflamatoria. / [CA] L'alcohol és una de les drogues més acceptades i consumides a nivell mundial, i la seva ingesta crònica causa alteracions al sistema nerviós central, des de desmielinització fins a mort neural. S'ha demostrat que gran part d'aquests efectes estarien intervinguts per l'activació del sistema immune innat, principalment a través del receptor TLR4, que desemboca en un estat inflamatori. Per aprofundir en aquests mecanismes, en aquesta tesi es pretén analitzar si el consum crònic d'etanol pot causar modificacions als miARNs de l'escorça cerebral, regulant l'expressió de gens proinflamatoris associats a la ruta de senyalització del TLR4 i si l'ús de la curcumina com a teràpia és capaç de disminuir aquests efectes. A més, analitzarem si el consum d'alcohol a llarg termini és capaç d'alterar la microbiota intestinal i la implicació del TLR4 en aquests processos. Els nostres resultats demostren que l'etanol pot alterar l'expressió de diferents microARNs que regulen l'expressió de gens proinflamatoris i associats a la via del TLR4. L'absència del receptor causa un perfil d'expressió diferent tant als controls com als animals alcohòlics crònics. Com que els darrers anys ens hem interessat en trobar una possible teràpia per pal·liar la neuroinflamació produïda per l'etanol, hem utilizat el BDMC, un curcuminoide amb capacitat antiinflamatòria i antioxidant, per revertir els danys causats per l'abús de l'alcohol. Per a la seva administració proposem la seva conjugació amb un polipèptid que elimina els problemes tradicionals associats a l'ús d'aquests compostos naturals com són la seva vida mitjana curta i la seva baixa biodisponibilitat, sense que haguem registrat toxicitat. L¿ús d¿aquest polímer en animals amb un consum crònic d¿etanol produeix una disminució de la inflamació, tant a nivell proteic com d¿expressió gènica. Considerant que una altra de les regions de l'organisme més afectades per l'alcohol és el tracte gastrointestinal, i que la població bacteriana pot ser modificada en determinades malalties o per l'ús de substàncies nocives, produint una disbiosi, hem comparat l'efecte de l'alcohol sobre la població bacteriana i la participació del receptor TLR4 en aquests efectes. Mitjançant una anàlisi d'expressió gènica, confirmem que el teixit intestinal absent del receptor TLR4 és menys susceptible de patir canvis deguts al consum d'alcohol. Tot i això, no hem trobat en aquests animals l'expressió augmentada de gens proinflamatoris característica dels tractaments alcohòlics. A més, els ratolins sense aquest receptor presenten una microbiota intestinal única i diferent de la trobada en animals de genotip normal, amb els seus propis canvis en l'equilibri bacterià en resposta a la ingesta d'alcohol. Aquesta microbiota presenta menor quantitat d'espècies Gram - i més resistència al desequilibri ocasionat per l'alcohol, que la contrapart en els ratolins WT. En general, els resultats científics que apareixen en aquesta tesi ressalten el paper del TLR4 a les alteracions causades pel consum crònic d'alcohol. Mostrem com a canvis causats per l'etanol a nivells tan diferents com la regulació mitjançant miARNs o la microbiota intestinal depenen en gran mesura de la resposta inicial que causa l'alcohol al TLR4. Atès que és un receptor necessari per al funcionament correcte de molts òrgans, plantegem un possible tractament mitjançant la inhibició d'aquesta cascada inflamatòria. / [EN] Alcohol is one of the most accepted and consumed drugs worldwide, and its chronic consumption causes alterations in the central nervous system, such as demyelination and neural death. It has been shown that these effects would be mediated by the activation of the innate immune system, mainly through the TLR4 receptor, which leads to an inflammatory response. To inquire into these mechanisms, this thesis aims to analyse whether chronic ethanol consumption can cause changes in miRNAs in the cerebral cortex, regulating the expression of proinflammatory genes associated with the TLR4 signalling pathway, and whether the use of curcumin as a therapy it is able to reduce these effects. In addition, we will analyse if long-term alcohol consumption can alter the intestinal microbiota, and the involvement of TLR4 in these processes. Our results show that ethanol can alter the expression of different microRNAs that regulate the expression of proinflammatory genes associated with the TLR4 pathway. The absence of this receptor causes a different expression profile in both controls and chronic alcoholic animals. Taking into account our interest in seeking a possible therapy to alleviate the neuroinflammation caused by ethanol, we have used BDMC, a curcuminoid with anti-inflammatory and antioxidant activity, to ameliorate the damage caused by alcohol abuse. For its administration, we propose its conjugation with a polypeptide that eliminates the traditional problems associated with the use of these natural compounds, such as their short half-life and low bioavailability, with no toxicity recorded. The use of this polymer in animals with chronic ethanol consumption produces a decrease in inflammation, at both protein level and gene expression. Considering that another of the regions of the body most affected by alcohol is the gastrointestinal tract, and that bacterial population can be modified in certain diseases or due to harmful substances, producing dysbiosis, we have compared the effect of alcohol on the bacterial population and the participation of the TLR4 receptor in these effects. Using gene expression analysis, we confirm that intestinal tissue without TLR4 receptor show less changes induced by the alcohol consumption. However, we have not found in these animals an increased expression of proinflammatory genes which are observed in alcoholic treatments. In addition, mice lacking this receptor have a unique intestinal microbiota, which is different from the normal genotype animals, with their own changes in bacterial balance in response to alcohol intake. This microbiota has less Gram - species and greater resistance to imbalance caused by alcohol than its counterpart in WT mice. In general, the results of this thesis highlight the role of TLR4 in the alterations caused by chronic alcohol consumption. We show that ethanol can cause changes at different levels, such as regulation of miRNAs or intestinal microbiota, which largely depend on the TLR4 activation induced by ethanol. Therefore, herein we demonstrate the importance of the TLR4 to the correct activity of several body organs, and we propose a possible treatment by inhibiting its inflammatory cascade. / Cuesta Díaz, CM. (2022). Papel de los receptores TLR4 y de la microbiota intestinal en los procesos inflamatorios y neuroinflamatorios causados por el consumo crónico de alcohol, y posibles terapias con curcuminoides [Tesis doctoral]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/183832 / TESIS