Les phlébotomes sont les vecteurs reconnus de plusieurs arbovirus, en particulier du genre Phlebovirus, ainsi que de parasites du genre Leishmania. Les infections par les phlébovirus sont responsables chez l’homme de maladies décrites depuis longtemps, pourtant ils demeurent méconnus, avec en particulier un manque de données épidémiologiques et d’outils de diagnostic.Dans une première partie, des études de séroprévalence nous ont permis d’aborder l’impact en santé publique, dans le sud-est de la France, de deux phlébovirus connus pour leur pouvoir pathogène chez l’homme, Toscana virus (TOSV) et Sandfly fever Sicilian virus (SFSV). Pour ce dernier, des anticorps spécifiques (IgG) ont été détectés dans moins de 1% des sérums testés, ce qui suggère que SFSV joue un rôle mineur dans les pathologies humaines de cette région ; ces résultats sont corroborés par l’absence, durant ces dernières décennies, de cas documentés d’infection aigüe due à SFSV en Europe occidentale. Nous avons donc pu concentrer notre travail sur le deuxième groupe de phlébovirus d’intérêt chez l’homme, le groupe des Sandfly fever Naples virus, qui inclut notamment TOSV. Nous avons démontré l’existence d’un lien épidémiologique entre les infections à Leishmania infantum et celles à TOSV, certainement dû au fait que ces pathogènes sont transmis par un vecteur commun (Phlebotomus perniciosus). Les analyses statistiques ont montré que les personnes exposées aux infections à TOSV ont plus de chance d’être aussi infectées par les parasites leishmanies (et vice versa). En admettant que ce lien épidémiologique entre leishmanioses et infections à TOSV est représenté par l’exposition à la piqûre d’un vecteur commun, cette étude confirme l’implication de Phlebotomus perniciosus en tant que vecteur principal de TOSV dans le sud de la France. Cette étude suggère également que certaines données épidémiologiques disponibles pour la leishmaniose pourraient être utilisées pour décrypter l’épidémiologie des infections à TOSV.La deuxième partie de cette thèse est consacrée à la détection, l’isolement et la caractérisation de virus, déjà connus ou inconnus, dans les populations de phlébotomes en France et en Afrique du Nord. Pour atteindre cet objectif, nous avons dû développer une plateforme d’analyse à au débit, adaptée pour la découverte de virus dans les phlébotomes, qui permette de traiter un grand nombre d’échantillons à faible coût. Cette plateforme a récemment été complétée par un outil de Next Generation Sequencing, afin de réaliser la caractérisation génétique complète des virus isolés et découverts. Au total, 12 576 phlébotomes ont été capturés au cours de 12 campagnes de capture menées en France, en Tunisie et en Algérie. Au sein d’une même zone géographique, la découverte de plusieurs nouveaux phlébovirus, ainsi que leur taux d’infection observé dans les populations de phlébotomes, ont démontré que la diversité de phlebovirus est bien plus importante qu’attendue.Dans la troisième partie de cette thèse, une étude de séroprévalence a été menée sur des sérums humains en utilisant des tests comparatifs de neutralisation de virus. Cette étude nous a permis d’exclure le virus Punique, récemment découvert, de la liste des principales menaces en santé publique au nord de la Tunisie, et de confirmer que TOSV est le principal phlebovirus pathogène ayant un impact en santé publique dans cette région du pays. Cette méthode de neutralisation est capable d’identifier précisément, parmi des virus génétiquement proches, le virus contre lequel les anticorps présents dans le sang ont été produits, ce qui permet de déterminer la capacité de chacun de ces virus à jouer un rôle en santé publique. / Sandflies are vectors of various arthropod-borne viruses, in particular viruses within the genus Phlebovirus, family Bunyaviridae, and of parasites in the genus Leishmania. Human diseases caused by infection with sandfly-borne phleboviruses are known for a long time, but they remain neglected due to the lack of epidemiological knowledge and of diagnostic tools.The first part consisted of seroprevalence studies in human sera to address the public health impact in south-eastern France of two recognized sandfly-borne phleboviruses, namely Toscana virus (TOSV) and Sandfly fever Sicilian virus (SFSV). Concerning the latter, specific IgG were detected in less than 1% of tested sera, suggesting that SFSV play a minor role in human disease in the region; this finding was corroborated with the lack of documented case of acute infection due to SFSV in Western Europe during the last decade. This pleaded for focusing on the other group of sandfly fever viruses known for their human interest, namely the group of Sandfly fever Naples virus that includes TOSV. We demonstrated an existing epidemiological relationship between Leishmania infantum and TOSV infections, presumably through the transmission by the common arthropod vector (Phlebotomus perniciosus). Statistical analysis showed that persons exposed to TOSV infection are at greater risk of being infected with Leishmania parasite (and vice versa). Assuming that epidemiological link between leishmaniasis and TOSV infection may be represented by the exposure to the bite of a common vector, this study confirms the involvement of Phlebotomus perniciosus as the major vector of TOSV in the South of France. This study also suggests that some of the epidemiological data available on Leishmaniasis may be used to decipher the epidemiology of TOSV infections..The second part of this thesis was dedicated to detection, isolation and characterization of existing and/or new phleboviruses in sandfly populations in France and in North Africa. To achieve this aim, we had to set up a high-throughput cost-effective platform amenable to virus discovery in sandflies; this sandfly-processing platform has been recently docked to a Next Generation Sequencing platform for full genetic characterization of newly isolated and discovered viruses. A total of 12,576 sandflies were trapped during 12 campaigns conducted in France, Tunisia and Algeria. The discovery of several new phleboviruses and their observed frequency in sandfly populations has clearly demonstrated that within a given geographic area, virus diversity is much higher than previously believed.In the third part of this thesis, a seroprevalence study based on comparative virus neutralization tests was performed on human sera and allowed to exclude the newly described Punique virus from the list of major public health threats in northern Tunisia, and to confirm that TOSV is the dominant phleboviral pathogen with an impact on public health in this part of the country. This neutralization method is suitable to identify precisely the virus against which antibodues were elicited, allowing to discriminate among closely related phleboviruses, and to determine their propensity to play a role in public health.

Parmi les phlébovirus (famille des Bunyaviridae, genre Phlebovirus), ceux qui sont transmis par les phlébotomes de l'Ancien Monde sont largement distribués dans le bassin méditerranéen. Les infections humaines causées certains de ces phlébovirus sont connues depuis longtemps, mais elles restent tout de même négligées en médecine en raison de l'absence de données épidémiologiques solides (problème des réactions croisées) et d'outils de diagnostic rapides et fiables.La première partie de cette thèse a été consacrée à l'optimisation d'un test de neutralisation du virus pour étudier la séroprévalence de 5 virus, et leur capacité respective à infecter les humains et les animaux.La deuxième partie visait à mesurer la séroprévalence de phlébovirus appartenant aux 3 complexes antigéniques transmis par les phlébotomes dans le bassin méditerranéen (Sandfly fever Naples, Sandfly fever Sicilian et Salehabad). Ces études ont été menées sur des sérums de chiens et de chats en Tunisie, Portugal, Grèce/Chypre.La troisième partie a montré la capacité de virus récemment découverts dans le serocomplexe Salehabad (Adana et Medjerda valley virus) à infecter l'homme et les animaux traduisant un potentiel pathogène à explorer par des études spécifiques.La dernière partie a démontré la présence du virus Toscana en Kabylie (Algérie du Nord), et l'exposition extrêmement élevée des populations humaines vivant dans la région, avec des prévalence 10 fois plus élevées que dans les régions les plus à risque du sud-est de la France. / Sandfly-borne phleboviruses, transmitted by phlebotomine sandflies and belonging to the genus Phlebovirus within the Bunyaviridae family are widely distributed in Mediterranean basin. Human diseases caused by infection with phleboviruses are known for a long time, but they are still neglected due to the lack of epidemiological knowledge and of diagnostic tools.The first part of this thesis was dedicated to optimize a comparative virus neutralisation test to study the seroprevalence of selected phleboviruses and to assess the capacity of each virus to infect humans and animals. The second part aimed to estimate the epidemiology of phlebovirus serocomplexes (Naples, Sicilian and Salehabad) in Mediterranean basin. In order to update the presence of these viruses and their capacity to infect animals, several serologic studies were carried out on animal blood samples in Tunisia, Portugal, Greece and Cyprus. The results demonstrated that the phleboviruses belonging to 3 distinct groups are widely circulating and capable to infect non human vertebrate at different rates in studied countries.The third part showed the capacity of newly discovered viruses (Adana and Medjerda valley viruses) belonging to Salehabad serocomplex to infect human and animal at low and high rates, respectively. These findings suggest the medical and veterinary importance of these viruses. The last part of this thesis, confirm the circulation of Toscana virus by seroprevelance study which was carried out in local population in north Algeria where Toscana virus was isolated recently. The high rate of circulate suggests that Toscana virus is heavily affecting sandfly-exposed people in Algeria.

Le virus Epstein-Barr (VEB) est fortement associé au développement de syndromes lymphoprolifératifs (SLP) en greffe pédiatrique. Ce virus a la capacité d’immortaliser les lymphocytes B et de provoquer leur prolifération incontrôlée chez l’hôte immunodéprimé. Plusieurs études démontrent que le cycle lytique du virus jouerait un rôle primordial dans la genèse des SLP en produisant des particules virales pouvant infecter les cellules B adjacentes. Chez un individu immunodéprimé, ces cellules B nouvellement infectées peuvent donner naissance à une expansion lymphocytaire. Le projet présenté dans ce mémoire fait partie d’un programme de recherche visant à élucider le rôle de l’infection productive par le VEB dans le développement des SLP. L’objectif précis de ce projet est de développer un anticorps monoclonal chimère contre la glycoprotéine gp350 du VEB dans le but de neutraliser le virus et d’ainsi prévenir son entrée dans les cellules B. Notre laboratoire a construit une version chimère de l’anticorps monoclonal murin 72A1, lequel se lie à la gp350 et bloque l’infection. Les premiers essais ont révélé la présence de chaînes non fonctionnelles (aberrantes) dans l’hybridome produisant l’anticorps 72A1. La construction de la chaîne légère authentique est maintenant complète alors que celle de la chaîne lourde est toujours en cours. Le processus de caractérisation de l’anticorps chimère inclura des essais de cytotoxicité à médiation cellulaire dépendante des anticorps (ADCC). Dans cette optique, une lignée cellulaire exprimant de façon stable la gp350 a été établie. Notre anticorps chimère anti-gp350 pourrait éventuellement être utilisé comme thérapie préventive chez les greffés présentant un risque élevé de SLP en empêchant l’infection des cellules B adjacentes. / The Epstein-Barr virus (EBV) is associated with B-cell post-transplant lymphoproliferative disease (PTLD). EBV has the unique property of immortalizing B lymphocytes, thereby causing their uncontrolled proliferation in an immunocompromised host. Certain evidence suggests that EBV productive infection may play a primary role in the genesis of PTLD by generating virus particles which can infect bystander B cells. In an immunocompromised individual, these infected B cells may then give rise to expanding B-cell clones. The project presented in this thesis is part of a research program seeking to elucidate the role of EBV productive infection in the genesis of PTLD. The specific aim of this work was to design a chimeric monoclonal antibody against the EBV envelope glycoprotein gp350 in order to neutralize the virus, thereby preventing entry into B cells. Our laboratory constructed a chimeric version of the murine monoclonal antibody, 72A1, which binds to gp350 and blocks infection. The initial cloning attempts revealed the presence of nonfunctional (aberrant) transcripts in the hybridoma line producing the 72A1 antibody. The chimeric version of the authentic light chain is now completed while the chimeric heavy chain construction is ongoing. As part of the characterisation process for the chimeric antibody, a cell line stably expressing surface gp350 was generated. This gp350-expressing cell line will be used for antibody dependent cellular cytotoxicity assays (ADCC). This anti-gp350 chimeric antibody could be useful as a preventive therapy in transplant patients at high risk for PTLD by blocking the infection of bystander B cells.

Le virus Epstein-Barr (VEB) est un pathogène opportuniste qui a la capacité d’immortaliser les lymphocytes B et de provoquer une prolifération maligne, appelée syndrome lymphoprolifératif post-transplantation (SLP), chez les individus immunodéprimés. A l’intérieur de ce groupe, les personnes à plus haut risque sont les enfants, puisqu’ils sont à risque de développer une infection primaire par le VEB pendant leur régime d’immunosuppression post-greffe. Dans le but de développer un anticorps préventif, notre laboratoire s’est attardé au rôle du cycle lytique du VEB dans le développement du SLP. À cette fin, le premier objectif du présent projet vise à fournir la preuve expérimentale de l’existence ou non d’une phase réplicative productive pendant l’infection aiguë des lymphocytes B sanguins. Un examen des événements qui se déroulent au tout début de l’infection par le VEB tant au niveau de la réplication virale qu’au niveau de l’expression des gènes lytiques précoces et tardifs a révélé l’existence d’une phase réplicative productive pendant l’infection aiguë. Ceci a permis de justifier l’élaboration, dans notre laboratoire, d’un anticorps chimère (murin-humain) neutralisant, dirigé contre la protéine gp350 située sur l’enveloppe virale. Le deuxième objectif, quant à lui, vise à fournir la preuve expérimentale de la capacité neutralisante de cet anticorps chimère. Des essais de caractérisation in vitro ont démontré une capacité de reconnaissance de la protéine cible, notamment la gp350, et une capacité de neutralisation du virus par l’anticorps chimère. L’anticorps chimère anti-gp350 pourra faire l’objet d’essais précliniques in vivo en vue d’évaluer sa capacité à reconnaître le virus et à prévenir l’apparition de tumeurs de type SLP chez les souris SCID. Il pourrait être éventuellement utilisé, par la suite, comme traitement préemptif contre les tumeurs dans l’espoir de mieux gérer les patients à risque de développer un SLP. / Epstein-Barr virus (EBV) is an opportunistic pathogen in immunocompromised transplant patients. In these patients EBV infection can lead to malignant B-cell lymphoproliferation, called post-transplant lymphoproliferative disease (PTLD). This thesis project aimed to investigate the role of lytic EBV infection in the genesis of PTLD. The first experimental objective was to provide in vitro proof that EBV could induce productive replication upon acute in vitro infection of B cells. Data obtained through study of viral DNA replication and transcription during the first 96 hours post-infection indicate that lytic infection does occur. These results provided justification for proceeding to the second experimental objective which involved the characterization of an anti-gp350 human-mouse chimeric antibody for its capacity to recognize and neutralize EBV. Results showed that this antibody did possess neutralization activity. Further study of this anti-gp350 chimeric antibody in SCID mice is necessary in order to evaluate its in vivo efficacy against PTLD.

Le virus Epstein-Barr (VEB) est fortement associé au développement de syndromes lymphoprolifératifs (SLP) en greffe pédiatrique. Ce virus a la capacité d’immortaliser les lymphocytes B et de provoquer leur prolifération incontrôlée chez l’hôte immunodéprimé. Plusieurs études démontrent que le cycle lytique du virus jouerait un rôle primordial dans la genèse des SLP en produisant des particules virales pouvant infecter les cellules B adjacentes. Chez un individu immunodéprimé, ces cellules B nouvellement infectées peuvent donner naissance à une expansion lymphocytaire. Le projet présenté dans ce mémoire fait partie d’un programme de recherche visant à élucider le rôle de l’infection productive par le VEB dans le développement des SLP. L’objectif précis de ce projet est de développer un anticorps monoclonal chimère contre la glycoprotéine gp350 du VEB dans le but de neutraliser le virus et d’ainsi prévenir son entrée dans les cellules B. Notre laboratoire a construit une version chimère de l’anticorps monoclonal murin 72A1, lequel se lie à la gp350 et bloque l’infection. Les premiers essais ont révélé la présence de chaînes non fonctionnelles (aberrantes) dans l’hybridome produisant l’anticorps 72A1. La construction de la chaîne légère authentique est maintenant complète alors que celle de la chaîne lourde est toujours en cours. Le processus de caractérisation de l’anticorps chimère inclura des essais de cytotoxicité à médiation cellulaire dépendante des anticorps (ADCC). Dans cette optique, une lignée cellulaire exprimant de façon stable la gp350 a été établie. Notre anticorps chimère anti-gp350 pourrait éventuellement être utilisé comme thérapie préventive chez les greffés présentant un risque élevé de SLP en empêchant l’infection des cellules B adjacentes. / The Epstein-Barr virus (EBV) is associated with B-cell post-transplant lymphoproliferative disease (PTLD). EBV has the unique property of immortalizing B lymphocytes, thereby causing their uncontrolled proliferation in an immunocompromised host. Certain evidence suggests that EBV productive infection may play a primary role in the genesis of PTLD by generating virus particles which can infect bystander B cells. In an immunocompromised individual, these infected B cells may then give rise to expanding B-cell clones. The project presented in this thesis is part of a research program seeking to elucidate the role of EBV productive infection in the genesis of PTLD. The specific aim of this work was to design a chimeric monoclonal antibody against the EBV envelope glycoprotein gp350 in order to neutralize the virus, thereby preventing entry into B cells. Our laboratory constructed a chimeric version of the murine monoclonal antibody, 72A1, which binds to gp350 and blocks infection. The initial cloning attempts revealed the presence of nonfunctional (aberrant) transcripts in the hybridoma line producing the 72A1 antibody. The chimeric version of the authentic light chain is now completed while the chimeric heavy chain construction is ongoing. As part of the characterisation process for the chimeric antibody, a cell line stably expressing surface gp350 was generated. This gp350-expressing cell line will be used for antibody dependent cellular cytotoxicity assays (ADCC). This anti-gp350 chimeric antibody could be useful as a preventive therapy in transplant patients at high risk for PTLD by blocking the infection of bystander B cells.

Le virus Epstein-Barr (VEB) est un pathogène opportuniste qui a la capacité d’immortaliser les lymphocytes B et de provoquer une prolifération maligne, appelée syndrome lymphoprolifératif post-transplantation (SLP), chez les individus immunodéprimés. A l’intérieur de ce groupe, les personnes à plus haut risque sont les enfants, puisqu’ils sont à risque de développer une infection primaire par le VEB pendant leur régime d’immunosuppression post-greffe. Dans le but de développer un anticorps préventif, notre laboratoire s’est attardé au rôle du cycle lytique du VEB dans le développement du SLP. À cette fin, le premier objectif du présent projet vise à fournir la preuve expérimentale de l’existence ou non d’une phase réplicative productive pendant l’infection aiguë des lymphocytes B sanguins. Un examen des événements qui se déroulent au tout début de l’infection par le VEB tant au niveau de la réplication virale qu’au niveau de l’expression des gènes lytiques précoces et tardifs a révélé l’existence d’une phase réplicative productive pendant l’infection aiguë. Ceci a permis de justifier l’élaboration, dans notre laboratoire, d’un anticorps chimère (murin-humain) neutralisant, dirigé contre la protéine gp350 située sur l’enveloppe virale. Le deuxième objectif, quant à lui, vise à fournir la preuve expérimentale de la capacité neutralisante de cet anticorps chimère. Des essais de caractérisation in vitro ont démontré une capacité de reconnaissance de la protéine cible, notamment la gp350, et une capacité de neutralisation du virus par l’anticorps chimère. L’anticorps chimère anti-gp350 pourra faire l’objet d’essais précliniques in vivo en vue d’évaluer sa capacité à reconnaître le virus et à prévenir l’apparition de tumeurs de type SLP chez les souris SCID. Il pourrait être éventuellement utilisé, par la suite, comme traitement préemptif contre les tumeurs dans l’espoir de mieux gérer les patients à risque de développer un SLP. / Epstein-Barr virus (EBV) is an opportunistic pathogen in immunocompromised transplant patients. In these patients EBV infection can lead to malignant B-cell lymphoproliferation, called post-transplant lymphoproliferative disease (PTLD). This thesis project aimed to investigate the role of lytic EBV infection in the genesis of PTLD. The first experimental objective was to provide in vitro proof that EBV could induce productive replication upon acute in vitro infection of B cells. Data obtained through study of viral DNA replication and transcription during the first 96 hours post-infection indicate that lytic infection does occur. These results provided justification for proceeding to the second experimental objective which involved the characterization of an anti-gp350 human-mouse chimeric antibody for its capacity to recognize and neutralize EBV. Results showed that this antibody did possess neutralization activity. Further study of this anti-gp350 chimeric antibody in SCID mice is necessary in order to evaluate its in vivo efficacy against PTLD.