Orientador: Helio José Montassier / Banca: Ricardo Luiz Moro de Sousa / Banca: Antonio Carlos Paulillo / Banca: Ricardo de Albuquerque / Banca: Adolorata Aparecida Bianco Carvalho / Resumo: O vírus da doença de Newcastle (VDN) provoca uma das doenças infecciosas mais importantes para as aves domésticas, devido aos elevados impactos negativos para a saúde aviária e a interposição de barreiras comerciais para a indústria avícola. Isso requer a constante evolução de técnicas cada vez mais eficazes de diagnóstico para esse vírus. Neste contexto, a nucleoproteína (NP) de VDN é um dos componentes antigênicos ideais para uso no imunodiagnóstico, porque é mais conservada e tem uma elevada imunogenicidade, de modo que NP pode melhorar o desempenho de sorodiagnóstico do VDN. Assim, este estudo teve como objetivo determinar os perfis de produção de anticorpos (Acs) anti-VDN dos isótipos IgA, IgM e IgG, usando NP recombinante (NPr) do VDN como um antígeno alvo. Amostras de soro e de lágrima foram colhidas de plantéis comerciais de aves de postura e também de aves SPF infectadas experimentalmente com a estirpe vacinal LaSota do VDN. O método de ELISA indireto, usando a NPr do VDN como antígeno de revestimento, foi padronizado e utilizado de forma bem sucedida para a detecção de Acs de galinha anti-VDN dos isótipos IgG e IgM em amostras de soro, e de ambos os isotipos mais IgA para amostras de secreção lacrimal. Ainda, este método de ELISA com NPr foi capaz de diferenciar amostras positivas das negativas para o VDN de soro e de lágrima, e nas aves submetidas à infecção experimental com a estirpe vacinal LaSota, a soroconversão foi detectada mais precocemente para os anticorpos do isótipo IgA (lágrima) e IgM (lágrima e soro), que alcançaram uma concentração máxima no sétimo dia após a infecção (pi), enquanto que os níveis de anticorpos IgG anti-VDN começaram a ser detectados mais tardiamente e atingiram um pico aos 14 dias pi. Além disso, a aplicação do ELISA em amostras de soro e de lágrima colhidas a partir de plantéis comerciais de galinhas de postura, para detecção de dois... / Abstract: Newcastle disease virus (NDV) causes one of the most important infectious diseases for chickens, due to the high negative impacts for health and the demands of trade barriers to poultry industry. This requires the constant development of increasingly more effective diagnostic techniques. In this context, the nucleoprotein (NP) of VDN is one of the ideal antigenic components for immunodiagnostics, because it is more conserved and has a high immunogenicity, so that NP may improve the performance of serodiagnosis of NDV. Thus, this study aimed to determine the production profiles of anti-NDV antibodies of IgA, IgM and IgG isotypes, using recombinant NP (rNP) of VDN as a target antigen. Serum and tear samples were collected from commercial poultry flocks, and from SPF birds experimentally infected with the LaSota vaccine strain of NDV. The indirect ELISA method using the NPr VDN as coating antigen was standardized and used for the detection of anti-NDV chicken antibody isotypes IgG, IgM in serum samples and antibodies of both isotypes added of IgA isotype for lacrimal secretion samples. This ELISA method with NPr was effectively able to differentiate NDV-positive and NDV-negative serum and tear samples, and in the birds subjected to a experimental infection with vaccine strain, the seroconversion was detected earlier for the antibodies of the IgA (tear) and IgM (tear and serum) isotypes, which have reached maximum concentration on the 7th day post-infection (pi), while the IgG anti-NDV antibody levels began to be detected later and peaked at 14 days pi. Moreover, the application of ELISA in serum and lachrymal samples collected from commercial layer chickens,with the detection of two (IgG and IgM for serum samples) or three isotypes (IgG, IgM and IgA for lachrymal samples) of anti-NDV antibodies, resulted in the highest detection frequencies than each antibody isotype was individually detected. By comparing the results of serum samples for ... / Doutor

Orientador: Hélio José Montassier / Banca: Antonio Carlos Paulillo / Banca: Ricardo Luiz Morode Sousa / Resumo: Existem diversos trabalhos publicados sobre métodos de diagnóstico da Doença de Newcastle (DN) em aves comerciais da espécie Gallus gallus. Entretanto, é escassa a literatura sobre o desenvolvimento de técnicas para o diagnóstico laboratorial da infecção pelo vírus da Doença de Newcastle (VDN) em espécies de aves não-galiformes. O presente trabalho foi delineado com o objetivo de desenvolver e aplicar a técnica de bloqueio de fase líquida de ELISA com a concanavalina A (BFL-Con A-ELISA) para a detecção e quantificação de anticorpos contra o VDN em soros de pombos de vida livre e da técnica de Semi-nested-RTPCR para detecção do vírus da DN (VDN) em suabes cloacais das mesmas aves. Na comparação entre o BFL-Con A-ELISA e o HI para a detecção de anticorpos em 107 amostras de soros de pombos, foram obtidos uma correlação significativa com o teste de HI (r = 0,875), bem como valores elevados de sensibilidade (100%), especificidade (95,8%), acurácia (96,3%) e concordância (κ = 0,83). Os resultados obtidos na técnica de semi-nested-RT-PCR mostraram que nove das 101 amostras analisadas foram positivas para o VDN. Na análise comparativa dos resultados da técnica do semi-nested-RT-PCR com os obtidos nas técnicas sorológicas, foram observados índices de especificidade relativa de 93,9% e 96,8% em relação aos métodos de HI e BFL-Con A-ELISA, respectivamente; além de uma máxima sensibilidade relativa (100%), comparativamente a esses testes. Esses dados demonstram que tanto o BFL-Con A-ELISA como o semi-nested-RT-PCR desenvolvidos no presente estudo foram eficientes no diagnóstico da DN, ou detectando anticorpos anti-VDN, ou esse agente viral, respectivamente, e ambas as técnicas apresentaram um grande potencial para serem usadas com vantagens no diagnóstico da infecção pelo VDN em pombos e em outras espécies de aves não-galiformes. / Abstract: A number of studies were done on diagnostic methods of Newcastle disease in commercial poultry (Gallus gallus, species). However the literature is scarce on the development of techniques for the diagnosis of Newcastle disease (ND) infection in non-galiforme and free-living birds. The present study aims to develop and apply a liquid-phase blocking ELISA with Concanavalin A (BFL-Con AELISA) for the detection and quantification of antibodies against ND virus (NDV) in sera of free-living pigeons and a semi-nested-RT-PCR technique for detection of NDV in cloacal swabs collected from these birds. The results of BFL-Con A-ELISA and HI were compared for the detection of antibodies in serum samples from 107 pigeons, and a significant correlation with the HI test was obtained (r = 0.875) as well as high values of relative sensitivity (100 %), specificity (95.8%), accuracy (96.3%) and agreement (k = 0.83). The results of semi-nested-RT-PCR showed that nine of the 101 samples were positive for the presence of NDV. By comparing the seminested- RT-PCR with serological tests, high relative specificity values of 93.9% and 96.8% were obtained with regard to HI and BLF-Con A-ELISA tests, respectively, as well as a maximum relative sensitivity (100%) was observed regarding these serological tests. These data demonstrate that the BFL-Con A-ELISA and seminested- RT-PCR developed in this study were effective in the diagnosis of NDV infection, detecting either specific antibodies, or this virus, respectively, and have a great potential to be used advantageously in the diagnostic of NDV infection in pigeons and other species of non-galliforme birds. / Mestre

Orientador: Helio José Montassier / Banca: Samir Issa Samara / Banca: Alessandro de Mello Varani / Banca: João Pessoa de Araujo Junior / Banca: Ricardo Luiz Moro de Sousa / Resumo: O vírus da doença de Newcastle (VDN) é o agente causador de uma das mais importantes enfermidades em aves e representa uma ameaça para a indústria avícola. O VDN é membro da família Paramyxoviridae, subfamília Paramyxovirinae, gênero Avulavirus. São vírus envelopados, não-segmentados dotados de genoma RNA de fita simples sentido negativo, associado à doença do trato respiratório, digestivo e nervoso das aves. O controle da DN se baseia em biossegurança, uso de vacinas e detecção precoce de lotes infectados. No presente estudo foi feito o sequenciamento do genoma completo da estirpe vacinal lentogênica (LaSota) e de um isolado de campo brasileiro patogênico (APMV-1/Chicken/Brazil/SJM/75) do VDN, seguido de análise filogenética. Os resultados revelaram que o genoma das estirpes LaSota e APMV-1/Chicken/Brazil/SJM/75 estão constituídos respectivamente por um total de 15.186 e 15.192 nucleotídeos, seis genes na ordem 3'-NP-P-M-F-HN-L-5'. Para a estirpe LaSota o local de clivagem da proteína de fusão (F) apresenta a sequência de aminoácidos correspondentes às encontradas em estirpes não virulentas do VDN, oposto ao que acontece com a estirpe APMV-1/Chicken/Brazil/SJM/75, no qual o sítio de clivagem da proteína F apresenta a sequência de aminoácidos correspondente às encontradas nas estirpes virulentas do VDN. O genoma completo da estirpe LaSota não apresentou grandes diferenças genômicas, de forma que na análise filogenética ficou evidenciado que esta estirpe está classificada no genótipo II, já a estirpe APMV-1/Chicken/Brazil/SJM/75 apresentou grandes diferenças genômicas nas sequências deduzidas de aminoácidos de suas principais proteínas estruturais, de forma que na análise filogenética do genoma completo foi demonstrado que esse vírus está classificado no genótipo V. Os dados obtidos a partir do presente estudo podem contribuir consideravelmente para ... / Abstract: Newcastle disease virus (NDV) is the agent that causes one of the most important diseases in birds and represents a threat to industrial aviculture. NDV is a member of the Paramyxoviridae family, Paramyxovirinae subfamily, Avulavirus genus. Viruses consist of single-stranded, non-segmented, negative-sense, RNA, associated with diseases in respiratory tract, digestive and nervous in birds. The ND control is based on biosafety, use of vaccines and early detection of infected batches. Here we present the complete genome sequence and phylogenetic analysis of a lentogenic strain (LaSota) and a velogenic strain (APMV-1/Chicken/Brazil/SJM/75) of NDV. The results revealed that the genome of LaSota and APMV-1/Chicken/Brazil/SJM/75 are constituted respectively by a total of 15,186 and 15,192 nucleotides and six genes in the order 3'-NP-P-M-F-HN-L-5'. The cleavage site of fusion protein (F) in LaSota strain shows the amino acid sequence found in non-virulent NDV strains, as opposed to happen with APMV-1/Chicken/Brazil/SJM/75 strain, the cleavage site of the F protein has the amino acid sequence corresponding to that found in virulent strains of NDV. The complete genome of LaSota strain showed no genomic differences and the phylogenetic analysis evidenced that this strain is classified in genotype II. The APMV-1/Chicken/Brazil/SJM/75 strain there are large differences in the genomic sequences and in the deduced amino acid sequences of its major structural proteins, so the phylogenetic analysis of the complete genome was demonstrated that this virus is classified in genotype V. This study can contribute significantly to understand better the genomic evolution of NDV in Brazil and in Americas, such as these strains with genotypic and phenotypic characteristics were no longer isolated in Brazil after 1975, while continued to be isolated in North America / Mestre

Orientador: Helio Jose Montassier / Banca: Ricardo Luiz Moro de Sousa / Banca: Manoel Victor Franco Lemos / Banca: Camillo Del Cistia Andrade / Banca: Everlon Cid Rigobelo / Resumo: Foi realizada a clonagem e expressão do gene da glicoproteína HN da estirpe La Sota do vírus da doença de Newcastle (VDN), como proteína recombinante de fusão, contendo uma cauda de poli-histidina no sistema hospedeiro constituído por leveduras da espécie Saccharomyces cerevisiae, que apesar de tentativas de otimização, não evidenciou a expressão da proteína recombinante. Após isso, foram produzidas as porções N-terminal e C-terminal da glicoproteína HN como proteínas recombinantes de fusão contendo uma cauda de poli-histidina e o peptídeo SUMO no sistema hospedeiro constituído pela bactéria Escherichia coli. Contatou-se que o sistema procarioto de expressão foi mais eficiente e permitiu a geração de dois peptídeos, que depois de devidamente caracterizados e purificados foram utilizados como antígenos para a realização de testes de imunodiagnóstico em sustituição aos kits comerciais utilizados atualmente. Foram desenvolvidos dois ensaios de ELISA baseados na adsorção de um antígeno formado pela expressão da porção N-terminal da glicoproteína HN (ELISA HN N-terminal) e na porção C-terminal da mesma glicoproteína (ELISA HN C-terminal), recuperados a partir da purificação da fração solúvel de culturas de E. coli. O ELISA C-terminal mostrou os melhores coeficientes de correlação com o teste padrão HI e com o teste S-ELISA-ConA, além de melhores índices de sensibilidade, especificidade e acurácia. Com isso, o ELISA baseado em um antígeno da porção C-terminal da glicoproteína HN e uma única diluição do soro desenvolvido neste estudo pode ser aplicado no diagnóstico e monitoramento pós-vacinal do VDN / Abstract: Was carried out the cloning and expression of the glycoprotein gene of the strain La Sota HN of the Newcastle disease virus (NDV), as a recombinant fusion protein containing a poly-histidine tail at the host system consisting of the yeast species Saccharomyces cerevisiae, which despite attempts at optimizing, showed no expression of recombinant protein. After that, the portions N-terminal and C-terminal from glycoprotein HN were produced as recombinant proteins containing a fusion tail and the poly-histidine peptide SUMO at the host system consisting of Escherichia coli. It was noted that the prokaryotic expression system was more efficient and allowed the generation of two peptides, which once characterized and purified were used as antigens for immunodiagnostic tests replacement in the commercial kits currently used. Were developed two ELISA assays based on the adsorption of the antigen formed by expression of the N-terminal portion of the HN glycoprotein (HN ELISA N-terminal) and the C-terminal portion of the same glycoprotein (HN ELISA C-terminus), recovered from purification of the soluble fraction of cultures of E. coli. The C-terminal ELISA showed the best correlation coefficients with the standard HI test and ELISA test S-ConA-, and higher sensitivity, specificity and accuracy. Therefore, the ELISA of the antigen based on a C-terminal portion of the glycoprotein HN and a single serum dilution developed in this study can be applied in the diagnosis and monitoring of post-vaccination VDN / Doutor

Orientador: Antonio Carlos Paulillo / Banca: Ruben Pablo Schoken-Iturrino / Banca: Laura Satiko Okada Nakaghi / Banca: Luciano Doretto Júnior / Banca: Maria Estela Gaglianone Moro / Resumo: Parâmetros imunológicos, clínicos, epidemiológicos e patológicos da vacinação em marrecos de Pequim foram avaliados por 3 experimentos. Para tanto, foram utilizadas amostras vacinais Ulster 2C, B1 e LaSota do vírus da doença de Newcastle (VDN). No experimento 1, foram utilizados 120 marrecos de Pequim de 1 dia de idade, distribuídos em 4 tratamentos de 30 animais cada, submetidos a diferentes programas imunoprofiláticos. A resposta imune foi avaliada pelo teste de HI, com posterior desafio frente a estirpe patogênica do VDN, aos 60 dias de vida das aves. Após o desafio, em todos os grupos, procedeu-se o reisolamento de vírus patogênico em embriões SPF. Independente do grupo experimental, sinais clínicos da reação vacinal não foram observados. Os resultados dos títulos de anticorpos (HI) mostraram que os programas imunoprofiláticos ensaiados foram igualmente eficientes no estímulo da resposta imune humoral. Os marrecos de Pequim desafiados mostraram-se refratários à enfermidade clínica com o VDN. Entretanto, ficou caracterizado o estado de portador de VDN nesta espécie decorridos até 30 dias da infecção experimental com este patógeno. Nos grupos vacinados, o reisolamento de vírus patogênico foi nulo, evidenciando -se assim a importância da imunoprofilaxia na supressão do estado de portador de VDN dos marrecos de Pequim. No experimento 2, aves SPF foram colocadas em contato íntimo com marrecos de Pequim inoculados com uma estirpe patogênica do VDN, decorridos cinco e 14 dias...(Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: The clinical, epidemiological, immunological and pathological parameters of vaccination in white Pekin ducks were investigated using 3 experiments. Ulster 2C, B1 and LaSota vaccines strains of the Newcastle disease virus (NDV) were used. In experiment 1, 120 one-day-old white Pekin ducks were used, and divided into 4 different groups with 30 birds per group. They were submitted to different vaccination programs. The immunological responses in these birds were measured by HI test. These birds were also challenged with a pathogenic VDN strain at 60 days of age. After challenge, in all the groups, tracheal and cloacal swabs were collected for re-isolation of the virus in SPF embrionated eggs. Independent of the group, clinical signs of reaction to the vaccine were not observed. The antibody titers (HI) results showed that the immune vaccine programs adopted were equally efficient in stimulating protective levels of humoral immune responses. Challenged white Pekin ducks were refractory to the NDV clinical disease. However, a NDV carrier state was shown in this species until 30 days after experimental infection. The vaccinated groups of white Pekin ducks did not present any virus in the re-isolation of the pathogenic virus. Therefore, these results show the relevance of vaccination in suppressing a NDV carrier state in the white Pekin ducks. In experiment 2, SPF chickens housed with white Pekin ducks which were previously inoculated with a pathogenic NDV strain, developed severe and characteristic NDV lesions and died, after five and 14 days...(Complete abstract, acess undermentioned eletronic address) / Doutor