Orientador: Clarice Weis Arns / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-23T15:29:47Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Rosa_GislaineNonino_M.pdf: 911936 bytes, checksum: 7194af83e7f30e4bcab42d6488202031 (MD5) Previous issue date: 2007 / Resumo: A cinomose canina tem sido relatada como uma das mais importantes doenças infecto contagiosas dos canídeos selvagens e domésticos. É causada por um agente viral denominado vírus da cinomose canina (CDV). Os vírus pertencem à família Paramyxoviridae , gênero Morbillivirus. São vírus envelopados, com genoma composto por uma fita simples de RNA, polaridade negativa, não segmentado. Alto grau de variabilidade genética no gene da hemaglutinina ( H) tem sido encontrada entre estirpes virais recentes e vacinais, e estas variações podem estar relacionadas ao aumento da ocorrência global da cinomose. No presente estudo, amostras biológicas de cães com sintomatologia sugestiva da cinomose foram analisadas geneticamente. Para a detecção de um fragmento de 882 pb do gene H do CDV padronizou-se uma RT-PCR que mostrou-se capaz de amplificar o material genético viral em amostras de urina, líquido céfalo-raquidiano, sistema nervoso central (SNC), baço , pulmão , fígado , rins, linfonodos, bexiga e timo. As amostras positivas de acordo com a RT-PCR foram encaminhadas para o sequenciamento e análise filogenética. Os resultados encontrados sugerem que estas amostras assemelham-se geneticamente aos vírus agrupados nas linhagens Européia e Ásia-1. A estirpe vacinal Lederle, utilizada como padrão, foi agrupada junto a linhagem América-1 onde encontram-se todas as estirpes vacinais , também conhecidas como "Old CDVs" . Os achados deste trabalho apontam para a ocorrência de estirpes geneticamente distintas daquelas utilizadas na produção de vacinas e mais estudos são necessários para a avaliação da eficácia das vacinas disponíveis, propiciando um melhor controle da doença / Abstract: Canine distemper has been reported as one of the most important infectious diseases of wild and domestic canids. It is caused by a viral agent called canine distemper virus (CDV). Viruses belonging to the family Paramyxoviridae, genus Morbillivirus. They are enveloped viruses with genome composed of a single strand of RNA, negative polarity, not segmented. High degree of genetic variability in the gene for hemagglutinin (H) has been found between recent viral strains and vaccination strains, and these variations may be related to increased overall occurrence distemper. In this study, biological samples from dogs with symptoms suggestive of distemper were analyzed genetically. For the detection of a 882 base pairs (bp) fragment of the gene of CDV H was standardized a RT-PCR wich proved to be capable of amplifying the viral genetic material in urine, cerebrospinal fluid, central nervous system (CNS), spleen , lungs, liver, kidneys, lymph nodes, bladder and thymus. Positive samples according to RT-PCR were sent for sequencing and phylogenetic analysis. The results suggest that these samples are similar to viruses genetically clustered lineages in European and Asia-1. The Lederle vaccine strain, used as standard, was grouped with Latin-1 lineages which are all vaccine strains, also known as "old CDVs." The findings of this study point to the occurrence of genetically distinct strains from those used in vaccine production and more studies are needed to assess the efficacy of vaccines available, providing better control of the disease / Mestrado / Microbiologia / Mestra em Genética e Biologia Molecular

Orientador: Valdemiro Carlos Sgarbieri / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia Agricola e de Alimentos / Made available in DSpace on 2018-07-17T05:11:04Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Junqueira_RobertoGoncalves_M.pdf: 5051016 bytes, checksum: b32d877ce7ee71afa402a015ea108c53 (MD5) Previous issue date: 1979 / Resumo: Foi realizado um estudo inicial de extração, fracionamento e recuperação das proteínas e da atividade hemaglutinante de sementes de feijão Rosinha G2 (Phaseolus vulgaris). O extrato bruto foi obtido em NaCl O,5M, e as proteínas foram fracionadas por diferença de solubilidade em meios de baixa força iônica, após diálise por 36 horas contra água destilada. A atividade mostrou maior tendência em concentrar-se na fração solúvel (ALB), contudo, uma atividade específica hemaglutinante quatro vezes menor foi detectada na fração insolúvel (GLB). Eletroforeticamente, estas frações não se mostraram completamente distintas e quando foram fracionadas pelo tamanho molecular de seus constituintes, por cromatografia em SephadexG-200, a atividade hemaglutinante apresentou-se, aproximadamente, em uma mesma faixa de peso molecular.A hemaglutinina do feijão Rosinha G2 foi purificada por uma sequência de etapas envolvendo cromatografia de afinidade em ConA-Sepharose e cromatografia em gel de Sephadex G-200. A análise eletroforética, em géis de poliacrilamida, a pH 8,4, da preparação obtida na primeira etapa da purificação, componente CII-Af, indicou que a atividade hemaglutinante é devida à presença de, pelo menos três grupos de glicoproteínas. A preparação obtida na última etapa de purificação, componente CII-S, apresentou-se corno urna banda larga e densa, sendo o perfil interpretado corno um fenômeno de agregação entre os constituintes da preparação hemaglutinante final. Quando este material foi analisado por eletrofocalização em gel de polia crilamida revelou que a atividade hemaglutinante é devida ao componente de ponto isoelétrico na faixa de pH de 5,5 - 5,7, sendo contaminado, principalmente, por um componente de ponto isoelétrico em pH = 4,7, que não apresentou atividade hemaglutinante. Foi observado que os eritr5citos bovinos, tripsinizados, quando tratados com soluções de hemaglutinina, mostravam afinidade por superfícies de acetato de celulose. Esta afinidade foi interpretada como interações inespecíficas, devidas a forças de natureza polar, que foram também responsabilizadas pela agregação observada no componente CII-S. A hemaglutinina purificada, CII-S, teve sua composição de aminoácidos determinada, revelando-se deficiente em aminoácidos sulfurados (traços) mas rica em ácido aspártico (11,64%) e serina (7,66%). Revelou-se uma glicoproteína, contendo 8,30% de açúcares neutros e 2,21% de glicosamina. Por cromatografia em gel, a hemaglutinina apresentou um raio molecular de Stokes de 43 A e um peso molecular de 136.000, O raio molecular foi utilizado para o cálculo de sua constante de difusão, 5,0 cm2.s-1. Por ultracentrifugação em gradiente de densidade, foi determinado seu coeficiente de sedimentação, 6,9S e calculou-se seu volume específico parcial, 0,75 ml.g-l, pela equação de Svedberg, para uma diluição infinita. Estes dados foram utilizados para estimar-se o comportamento hidrodinâmico da hemaglutinina, pela determinação de seu quociente friccional, f/f= 1,3. Este valor indica que a proteína pode assumir combinações de hidratação e as simetria dentro dos seguintes limites: 0,9g de água por grama de proteína e a/b = 6, se o modelo de um elips5ide prolato for escolhido. As propriedades químicas e físico-químicas, determinadas para a hemaglutinina do feijão Rosinha G2, mostraram que é semelhante em muitos aspectos fundamentais a outras hemaglutininas purificadas, de diferentes variedades de Phaseolus vulgaris / Abstract: The present is a preliminary study on some physicochemical properties of the bean (Phaseolus vulgaris, variety "Rosinha G2")proteins such as solubility, electrophoretic mobility,molecular weight distributions and hemagglutinating activity. The crude extract was prepared by extracting the flour with a O.5M NaCl solution. The proteins were fractionated using their differences in solubility as the ionic strength was lowered by means of dialysis against distilled water for 36 hours. Most of the hemagglutinating activity was found in the soluble fraction (albumins). Some activity was detected in the insoluble fraction (globulins), which was four times lower than that found in the albumins. However, it was shown electrophoretically that the hemagglutinating components were similar in both fractions. When the protein constituents were separated on the bases of their molecular size, the hemagglutinating activity was found approximately on the same range of molecular weights. The hemagglutinin prepared from this bean was obtained by a sequence of steps involving affinity chromatography on ConA-Sepharose and gel chromatography on Sephadex G-200. The agglutinating preparation obtained by affinity chromatography, component CII-Af, was shown by polyacrylamied-gel electrophoresis to be composed of, at least, three groups of active glycoproteins. Under the same conditions, the preparation obtained at the last step of purification, component CII-B, gave a broad band, which was interpreted to be the result of aggregation. The gel-electrofocusing pattern of this material showed that the hemagglutinating activity was associated with the component separated in the pH range of 5.5-5.7. Other in active components were also present, particularly at pH4.7. It was noted during the hemagglutinating activity tests that the erythrocytes after treatment with hemagglutinin solutions adhered to the cellulose acetate surfaces. This affinity was probably due to nonspecific interactions occuring between groups of polar nature, which could be responsible for the aggregation of the constituents of CII-S.The purified hemagglutinin was characterized as a glycoprotein, containing 8.30% of neutral sugars (as mannose) and 2.12% of hexosamine (asglucosamine). It was shown to be deficient in sulfur ¿ containing amino acids (traces) but rich in aspartic acid(11.64%) and serine (7.66%). The hemagglutinin revealed a Stokes radius of 43R and a molecular weight of 136,000, as obtained by gel chromatography. The molecular radius was used to calculate the approximate value of the diffusion constant, D20,w = 5.0 x 10-7cm2.s-1. The sedimentation coefficient which was determined in a linear sucrose density was 6.9S. These parameters were substituted in the Svedberg equation to determine its partial specific volume, v = 0.75 ml.g-l. The hydrodynamic behavior of the hemagglutinin was estimated by the calculation of its frictional ratio, f/fo = 1.3. This value indicated that the protein had a maximum hydration of 0.9 g of water per gram of protein and a maximum axial ratio, a/b = 6 if a prolate ellipsoid of revolution was chosen as the model. The chemical and physicochemical properties of the hemagglutinin' prepared from the bean "Rosinha G2" were similar in many fundamental aspects to other hemagglutinins obtained from the seeds of different varieties of PhaseoZus vuZgaris / Mestrado / Mestre em Ciência de Alimentos

Submitted by Alessandra Portugal (alessandradf@ioc.fiocruz.br) on 2013-09-24T15:06:55Z No. of bitstreams: 1 Dissertação de Mestrado Paola Cristina Resende Silva.pdf: 1538372 bytes, checksum: 8c68a244d3e53f424ddb574f985bcad8 (MD5) / Made available in DSpace on 2013-09-24T15:06:55Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Dissertação de Mestrado Paola Cristina Resende Silva.pdf: 1538372 bytes, checksum: 8c68a244d3e53f424ddb574f985bcad8 (MD5) Previous issue date: 2010 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, RJ, Brasil / Globalmente, as infecções causadas pelos vírus Influenza constituem um importante desafio para a Saúde Pública. Os vírus Influenza B pertencem à família Orthomyxoviridae, seu genoma viral é constituído por um RNA de fita simples e polaridade negativa. O processo de drift antigênico favorece o contínuo aparecimento de novas variantes virais, o que demanda a reformulação anual da vacina. No início década de 80, foi observada a divergência do vírus Influenza B em duas linhagens antigênica e filogeneticamente distintas: B/Victoria/2/87-like (Vic87) e B/Yamagata/16/88-like (Yam88), que tem co-circulado em diferentes países na última década. O objetivo deste estudo consiste na identificação e caracterização molecular das linhagens de Influenza B circulantes em diferentes regiões brasileiras durante as epidemias de 2004 a 2008, com base no sequenciamento dos genes Hemaglutinina (HA) e Neuraminidase (NA). Ainda, padronizamos a metodologia de Eletroforese em Gel com Gradientes Desnaturantes (DGGE), visando à rápida tipagem dos vírus B. Diferentes substituições nos genes da HA e NA foram encontradas. Evidenciamos a co-circulação de ambas as linhagens no período estudado, contudo, não observamos a ocorrência de rearranjo gênico e nem a emergência de cepas resistentes aos inibidores de neuraminidase, com base nos genes investigados. No período 2006-2008, observamos a adequada concordância entre as cepas circulantes e as cepas vacinais preconizadas para uso no Hemisfério Sul. Entretanto, o mesmo não foi verdadeiro para o período 2004-2005. Finalmente, o protocolo de DGGE desenvolvido pode ser eficientemente utilizado para fins de rápida tipagem das linhagens de Influenza B. Os achados deste estudo contribuem para a melhor compreensão sobre a variabilidade dos vírus Influenza B e os mecanismos envolvidos na sua evolução molecular, bem como o padrão de circulação das linhagens virais no Brasil e sua correspondência com as vacinas para Influenza, anualmente administradas no Hemisfério Sul. Este conjunto de informações são de grande relevância para a contínua adequação e implementação das políticas e estratégias voltadas ao controle e prevenção de infecções por Influenza na nossa população. / Worldwide, Influenza infections are a major Public Health issue. Influenza B virus is classified into the Orthomyxoviridae family, the viral genome consists of a single strand RNA and negative polarity. Because of antigenic drift, novel viral variants are continuously rising, what demands the annual review of vaccine formulation. In the early 80´s, was observed the divergence of Influenza B into two distinct antigenic and phylogenetic lineages – B/Victoria/2/87-like (Vic87) and B/Yamagata/16/88-like (Yam88), was observed. In some countries, these strains have been co-circulating in the last 10 years. The aim of this study was to investigate the circulation patterns of Vic87 and Yam88 among different Brazilian regions during the 2004-2008 epidemics, based on haemagglutinin (HA) and neuraminidase (NA) sequencing. Moreover, a Denaturing Gradient Gel Electrophoresis (DGGE) protocol was standardized for rapid typing of Flu B typing into Yam88-like and Vic87-like strains. Different Aminoacid substitutions in the HA and NA were encountered. Along the studied period, our findings showed that both viral lineages have been co-circulating in Brazil. Moreover, no evidence of reassortant nor NA inhibitor-resistant viruses was found. From 2006 to 2008, an adequate match between vaccine and circulating strains was met. However, it was not true for 2004-2005 years. Finally, our DGGE protocol can be successfully used as a rapid Flu B strain typing test. Our findings contribute for a better figure of Flu B genetic variability and its molecular evolution mechanisms, in addition to the circulation patterns of Flu B lineages in Brazil, and their respective association with the vaccine strains used in the Southern Hemisphere. Altogether, these are pivotal information to continuously tailor and implement Public Health policies on behalf of the control and prevention of Influenza infections.

TEIXEIRA, C. S. Determinação da estrutura tridimensional de uma lectina da semente de Camptosema pedicellatum Benth por cristalografia de raios X. 2012. 87 f. Dissertação (Mestrado em Bioquímica) - Centro de Ciências, Universidade Federal do Ceará, Fortaleza, 2012. / Submitted by Francisco Lacerda (lacerda@ufc.br) on 2014-11-10T19:13:39Z No. of bitstreams: 1 2012_dis_csteixeira.pdf: 2144291 bytes, checksum: 51a622ff983208ea3d670a7e5df47779 (MD5) / Approved for entry into archive by José Jairo Viana de Sousa(jairo@ufc.br) on 2015-01-16T20:52:11Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2012_dis_csteixeira.pdf: 2144291 bytes, checksum: 51a622ff983208ea3d670a7e5df47779 (MD5) / Made available in DSpace on 2015-01-16T20:52:11Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2012_dis_csteixeira.pdf: 2144291 bytes, checksum: 51a622ff983208ea3d670a7e5df47779 (MD5) Previous issue date: 2012 / Letinas tem sido usadas como modelo de bases moleculares em estudo da interação e especificidade de proteína-carboidrato por serem capazes de decifrar o glicódigo de estruturas celulares. O objetivo do presente estudo foi purificar e resolver a estrutura primária completa usando espectrometria de massas tandem e a estrutura tridimensional da lectina de Camptosema pedicellatum (CPL) complexada com 5-bromo-4-cloro-3-indol-α-D-manose (X-Man) por cristalografia de raios X. CPL foi purificada em um único passo por cromatografia de afinidade. Os resultados de espectrometria de massas revelou que CPL apresenta uma combinação de cadeias com pesos de 25.298 ± 2 Da (cadeia-α), 12.835 ± 2 Da (cadeia-β) e 12.481 ± 2 Da (cadeia-γ). A estrutura cristalina resolvida da CPL apresenta uma mutação conservativa no subsítio hidrofóbico, um componente do domínio de reconhecimento a carboidrato (CDR), indicando a relevância da interação hidrofóbica no estabelecimento de interações com os carboidratos. A substituição e análise da interação da CPL com o X-Man também revelou que o efeito hidrofóbico causado por uma pequena mudança no subsítio hidrofóbico interfere na formação de pontes de hidrogênio devido a orientação espacial do grupo indol no CDR.

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:32:41Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2012-07-19Bitstream added on 2014-06-13T20:04:03Z : No. of bitstreams: 1 goncalves_mcm_dr_jabo.pdf: 761601 bytes, checksum: 6236742e70d7cbec76cc87afe87574a1 (MD5) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Foi realizada a clonagem e expressão do gene da glicoproteína HN da estirpe La Sota do vírus da doença de Newcastle (VDN), como proteína recombinante de fusão, contendo uma cauda de poli-histidina no sistema hospedeiro constituído por leveduras da espécie Saccharomyces cerevisiae, que apesar de tentativas de otimização, não evidenciou a expressão da proteína recombinante. Após isso, foram produzidas as porções N-terminal e C-terminal da glicoproteína HN como proteínas recombinantes de fusão contendo uma cauda de poli-histidina e o peptídeo SUMO no sistema hospedeiro constituído pela bactéria Escherichia coli. Contatou-se que o sistema procarioto de expressão foi mais eficiente e permitiu a geração de dois peptídeos, que depois de devidamente caracterizados e purificados foram utilizados como antígenos para a realização de testes de imunodiagnóstico em sustituição aos kits comerciais utilizados atualmente. Foram desenvolvidos dois ensaios de ELISA baseados na adsorção de um antígeno formado pela expressão da porção N-terminal da glicoproteína HN (ELISA HN N-terminal) e na porção C-terminal da mesma glicoproteína (ELISA HN C-terminal), recuperados a partir da purificação da fração solúvel de culturas de E. coli. O ELISA C-terminal mostrou os melhores coeficientes de correlação com o teste padrão HI e com o teste S-ELISA-ConA, além de melhores índices de sensibilidade, especificidade e acurácia. Com isso, o ELISA baseado em um antígeno da porção C-terminal da glicoproteína HN e uma única diluição do soro desenvolvido neste estudo pode ser aplicado no diagnóstico e monitoramento pós-vacinal do VDN / Was carried out the cloning and expression of the glycoprotein gene of the strain La Sota HN of the Newcastle disease virus (NDV), as a recombinant fusion protein containing a poly-histidine tail at the host system consisting of the yeast species Saccharomyces cerevisiae, which despite attempts at optimizing, showed no expression of recombinant protein. After that, the portions N-terminal and C-terminal from glycoprotein HN were produced as recombinant proteins containing a fusion tail and the poly-histidine peptide SUMO at the host system consisting of Escherichia coli. It was noted that the prokaryotic expression system was more efficient and allowed the generation of two peptides, which once characterized and purified were used as antigens for immunodiagnostic tests replacement in the commercial kits currently used. Were developed two ELISA assays based on the adsorption of the antigen formed by expression of the N-terminal portion of the HN glycoprotein (HN ELISA N-terminal) and the C-terminal portion of the same glycoprotein (HN ELISA C-terminus), recovered from purification of the soluble fraction of cultures of E. coli. The C-terminal ELISA showed the best correlation coefficients with the standard HI test and ELISA test S-ConA-, and higher sensitivity, specificity and accuracy. Therefore, the ELISA of the antigen based on a C-terminal portion of the glycoprotein HN and a single serum dilution developed in this study can be applied in the diagnosis and monitoring of post-vaccination VDN

Submitted by Heitor Rapela Medeiros (heitor.rapela@ufpe.br) on 2015-03-06T13:45:50Z No. of bitstreams: 2 TESE MARIA JOSE COUTO OLIVEIRA.pdf: 3444115 bytes, checksum: 23f3f8857155eb1b13b9abe031e11e3b (MD5) license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) / Made available in DSpace on 2015-03-06T13:45:50Z (GMT). No. of bitstreams: 2 TESE MARIA JOSE COUTO OLIVEIRA.pdf: 3444115 bytes, checksum: 23f3f8857155eb1b13b9abe031e11e3b (MD5) license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) Previous issue date: 2012-02-29 / Durante a pandemia (2009-2010) com o vírus influenza A(H1N1)pdm09 foi recomendado o tratamento com o oseltamivir ou zanamivir. Com o aumento da detecção de vírus de Influenza A (H1N1) sazonal resistente ao oseltamivir houve a preocupação de que o mesmo ocorresse com o novo vírus pandêmico. Nesta pandemia, muitos pacientes com suspeita de infecção pelo vírus A(H1N1)pdm09 tiveram o teste negativo para influenza A, ficando sem uma definição do agente etiológico. Testes moleculares podem detectar a presença de mutações relacionadas à resistência ao oseltamivir, à virulência e antigenicidade do vírus, assim como podem definir o diagnóstico etiológico por vírus respiratórios. Para esclarecer essas questões dois estudos foram realizados. O primeiro foi a “Caracterização genética dos vírus influenza A (H1N1)pdm09 detectados no Estado de Pernambuco, Brasil, no período de maio de 2009 a maio de 2010”, com o objetivo de verificar a resistência desse vírus ao oseltamivir e também avaliar a diversidade genética dos vírus circulantes. Foram analisadas 118 amostras do vírus A(H1N1)pdm09 através de pirosequenciamento, precedida da transcrição reversa e reação em cadeia da polimerase em tempo real (rRT-PCR) para amplificação do H1N1pdm-N1 fragmento C e posterior detecção da mutação H274Y, utilizando o equipamento PyroMark Q-96 ID no modo SNP (single nucleotide polymorphism). Foram sequenciados os genes da hemaglutinina de 31 amostras, pela técnica de Sanger, de acordo com o Protocolo do CDC para Influenza. Foi utilizado o kit “Big Dye® terminator Cycle Sequencing” (Applied Biosystem) e o produto submetido ao método de precipitação X-terminator. A mutação H274Y não foi observada, indicativo de que os vírus sequenciados eram sensíveis ao oseltamivir. As 31 amostras sequenciadas mostraram-se intimamente relacionadas com a cepa de referência A/California/7/2009(H1N1), entretanto, foram detectados 14 tipos de mutações, porém sem implicação no aumento da virulência. O segundo estudo realizado: ”Aspectos epidemiológicos e virológicos da infecção por Influenza A(H1N1)pdm09 e frequência de outros vírus respiratórios no Estado de Pernambuco, Brasil: 2009 – 2010” teve como objetivo analisar a pandemia de influenza no estado e identificar os vírus respiratórios responsáveis pelo quadro clínico que levou à hipótese diagnóstica da influenza pandêmica. Foram analisados espécimes de 705 casos para detecção do vírus da influenza A, utilizando-se a PCR em tempo real, sistema TaqMan, de acordo com o Centers for Disease Control and Prevention / Atlanta, das quais, 26,3% (186/705) foram positivas para o vírus A(H1N1)pdm09 e 2,3% (16/705) positivas para influenza A sazonal. Para detecção de outros vírus respiratórios foram analisadas 146 amostras negativas para o vírus A (H1N1)pdm09 por RT-PCR multiplex, com o kit “FTD Respiratory21 PLUS”. Entre as amostras negativas para o vírus A(H1N1)pdm09, 36,5% (53/146) foram positivas para outros vírus respiratórios, com três casos de infecção viral múltipla. Foram detectados: rhinovírus (41%), coronavírus 43 (14,3%), metapneumovírus humano (14,3%), bocavírus (7,1%), vírus respiratório sincicial (5,3%), influenza B (3,6%), parainfluenza 2 (3,6%), parainfluenza 3 (3,6%), adenovírus (1,8%), coronavírus HKU (1,8%), enterovírus (1,8%) e parainfluenza 1 (1,8%). Estes resultados mostram a circulação, além da Influenza A(H1N1)pdm09, de outros vírus respiratórios no estado em 2009-2010; evidenciam a necessidade da análise laboratorial dos casos suspeitos de influenza e a importância do monitoramento laboratorial das infecções respiratórias, uma vez que o diagnóstico etiológico baseado apenas em critérios clínicos nem sempre é acurado.

Orientador: Helio Jose Montassier / Banca: Ricardo Luiz Moro de Sousa / Banca: Manoel Victor Franco Lemos / Banca: Camillo Del Cistia Andrade / Banca: Everlon Cid Rigobelo / Resumo: Foi realizada a clonagem e expressão do gene da glicoproteína HN da estirpe La Sota do vírus da doença de Newcastle (VDN), como proteína recombinante de fusão, contendo uma cauda de poli-histidina no sistema hospedeiro constituído por leveduras da espécie Saccharomyces cerevisiae, que apesar de tentativas de otimização, não evidenciou a expressão da proteína recombinante. Após isso, foram produzidas as porções N-terminal e C-terminal da glicoproteína HN como proteínas recombinantes de fusão contendo uma cauda de poli-histidina e o peptídeo SUMO no sistema hospedeiro constituído pela bactéria Escherichia coli. Contatou-se que o sistema procarioto de expressão foi mais eficiente e permitiu a geração de dois peptídeos, que depois de devidamente caracterizados e purificados foram utilizados como antígenos para a realização de testes de imunodiagnóstico em sustituição aos kits comerciais utilizados atualmente. Foram desenvolvidos dois ensaios de ELISA baseados na adsorção de um antígeno formado pela expressão da porção N-terminal da glicoproteína HN (ELISA HN N-terminal) e na porção C-terminal da mesma glicoproteína (ELISA HN C-terminal), recuperados a partir da purificação da fração solúvel de culturas de E. coli. O ELISA C-terminal mostrou os melhores coeficientes de correlação com o teste padrão HI e com o teste S-ELISA-ConA, além de melhores índices de sensibilidade, especificidade e acurácia. Com isso, o ELISA baseado em um antígeno da porção C-terminal da glicoproteína HN e uma única diluição do soro desenvolvido neste estudo pode ser aplicado no diagnóstico e monitoramento pós-vacinal do VDN / Abstract: Was carried out the cloning and expression of the glycoprotein gene of the strain La Sota HN of the Newcastle disease virus (NDV), as a recombinant fusion protein containing a poly-histidine tail at the host system consisting of the yeast species Saccharomyces cerevisiae, which despite attempts at optimizing, showed no expression of recombinant protein. After that, the portions N-terminal and C-terminal from glycoprotein HN were produced as recombinant proteins containing a fusion tail and the poly-histidine peptide SUMO at the host system consisting of Escherichia coli. It was noted that the prokaryotic expression system was more efficient and allowed the generation of two peptides, which once characterized and purified were used as antigens for immunodiagnostic tests replacement in the commercial kits currently used. Were developed two ELISA assays based on the adsorption of the antigen formed by expression of the N-terminal portion of the HN glycoprotein (HN ELISA N-terminal) and the C-terminal portion of the same glycoprotein (HN ELISA C-terminus), recovered from purification of the soluble fraction of cultures of E. coli. The C-terminal ELISA showed the best correlation coefficients with the standard HI test and ELISA test S-ConA-, and higher sensitivity, specificity and accuracy. Therefore, the ELISA of the antigen based on a C-terminal portion of the glycoprotein HN and a single serum dilution developed in this study can be applied in the diagnosis and monitoring of post-vaccination VDN / Doutor

Coronavírus bovino (BCoV) é o agente causador de doença, tanto entérica como respiratória em bovinos, mas até agora existem controvérsias sobre a relação genealógica entre as amostras de BCoV em diferentes tecidos. Neste estudo, amostras de fezes e secreções nasais de 14 vacas de um mesmo rebanho apresentando simultaneamente disenteria epizoótica e doença respiratória foram estudados quanto a presença de BCoV. As amostras virais detectadas tiveram tanto o gene de espícula (S) como o gene hemaglutinina-esterase (HE) parcialmente sequenciados. Para o gene HE, foram obtidas 12 sequências de secreções nasais e 12 de amostras de fezes e para o gene S, foram obtidas 14 sequências de secreções nasais e 12 de amostras de fezes, com 100% de identidade nucleotídica para cada gene para as amostras deste estudo. Estes resultados apresentam algumas divergências com estudos anteriores os quais relatam que linhagens diferentes de BCoV podem ser esperados em casos de disenteria e doença respiratória em vacas, pois linhagens com sequências idênticas dos genes S e HE podem não mostrar diferenças em relação tropismo pelos diferentes tecidos. Sequências completas de duas amostras brasileiras de BCoV mostram que o já descrito padrão filogeográfico baseado no sequenciamento do gene S parcial foi mantido, foram encontradas substituições de aminoácidos específicos. / Bovine coronavirus (BCoV) is the causative agent of both enteric and respiratory disease in cattle, but hitherto there were some controversy on the genealogic relationship amongst strains from these different tissues. In this study, samples of feces and nasal secretions of 14 cows from a same herd simultaneously presenting epizootic dysentery and respiratory disease were screened for BCoV and the strains detected had both the spike (S) and hemagglutinin-esterase (HE) genes partially sequenced. For HE gene, 12 sequences from nasal secretions and 12 from fecal samples were obtained and for S gene, 14 sequences from nasal secretions and 12 from fecal samples were obtained, with 100% nucleotide identities for each gene for the strains of this study. These results have some disagreements with previous reports which try to put forward that divergent BCoV strain should be expected in cases of dysentery and respiratory disease in cows, showing that strain with identical S and HE sequences might show no differences in tropisms. Complete S gene sequences of two Brazilian BCoV strains show that the already described phylogeographic pattern based on partial S gene is sustained, though specific amino acids subtitutions are found.

Coronavírus bovino (BCoV) é o agente causador de doença, tanto entérica como respiratória em bovinos, mas até agora existem controvérsias sobre a relação genealógica entre as amostras de BCoV em diferentes tecidos. Neste estudo, amostras de fezes e secreções nasais de 14 vacas de um mesmo rebanho apresentando simultaneamente disenteria epizoótica e doença respiratória foram estudados quanto a presença de BCoV. As amostras virais detectadas tiveram tanto o gene de espícula (S) como o gene hemaglutinina-esterase (HE) parcialmente sequenciados. Para o gene HE, foram obtidas 12 sequências de secreções nasais e 12 de amostras de fezes e para o gene S, foram obtidas 14 sequências de secreções nasais e 12 de amostras de fezes, com 100% de identidade nucleotídica para cada gene para as amostras deste estudo. Estes resultados apresentam algumas divergências com estudos anteriores os quais relatam que linhagens diferentes de BCoV podem ser esperados em casos de disenteria e doença respiratória em vacas, pois linhagens com sequências idênticas dos genes S e HE podem não mostrar diferenças em relação tropismo pelos diferentes tecidos. Sequências completas de duas amostras brasileiras de BCoV mostram que o já descrito padrão filogeográfico baseado no sequenciamento do gene S parcial foi mantido, foram encontradas substituições de aminoácidos específicos. / Bovine coronavirus (BCoV) is the causative agent of both enteric and respiratory disease in cattle, but hitherto there were some controversy on the genealogic relationship amongst strains from these different tissues. In this study, samples of feces and nasal secretions of 14 cows from a same herd simultaneously presenting epizootic dysentery and respiratory disease were screened for BCoV and the strains detected had both the spike (S) and hemagglutinin-esterase (HE) genes partially sequenced. For HE gene, 12 sequences from nasal secretions and 12 from fecal samples were obtained and for S gene, 14 sequences from nasal secretions and 12 from fecal samples were obtained, with 100% nucleotide identities for each gene for the strains of this study. These results have some disagreements with previous reports which try to put forward that divergent BCoV strain should be expected in cases of dysentery and respiratory disease in cows, showing that strain with identical S and HE sequences might show no differences in tropisms. Complete S gene sequences of two Brazilian BCoV strains show that the already described phylogeographic pattern based on partial S gene is sustained, though specific amino acids subtitutions are found.