Os produtos naturais marinhos são apontados com uma das fontes de substâncias bioativas mais importantes para a descoberta de novos fármacos. Neste ambiente, os organismos estão em constante interação ecológica por meio da produção de metabólitos secundários. Fungos endofíticos e cianobactérias representam grupos de micro-organismos que realizam a biossíntese de substâncias com características químicas únicas e atividades biológicas potentes. Entretanto, quando retirados de seu habitat natural, esses seres microbianos geralmente perdem sua capacidade metabólica através de um fenômeno denominado silenciamento gênico, no qual genes biossintéticos deixam de ser transcritos devido a motivos ainda indeterminados. Esse mecanismo genético é intermediado, dentre outros fatores, pelas enzimas DNAmetiltransferase (DNA-MT) e Histona-desacetilase (HDAC). Deste modo, seus inibidores têm sido utilizados com sucesso para promover a eliciação de substâncias que não seriam produzidas em condições laboratoriais. Outra importante abordagem na pesquisa de produtos naturais têm sido a desreplicação baseada na fragmentação (MS/MS) para identificação de substâncias ou análogos. As redes moleculares (molecular networking) constituem uma nova abordagem na qual dados de espectrometria de massas são agrupados de acordo com as semelhanças entre os padrões de fragmentação, formando famílias de moléculas, permitindo a rápida visualização do perfil químico de várias amostras ao mesmo tempo. Deste modo, este trabalho apresenta o isolamento e identificação de metabólitos inéditos a partir de fungos endofíticos e cianobactérias oriundos do ambiente marinho. Para isto, técnicas de eliciação epigenética foram utilizadas em ambos os grupos de organismos, e a desreplicação via redes moleculares foi utilizada em cianobactérias. Fungos endofíticos associados à macroalga vermelha Bostrychia tenella foram alvo de estudos químicos e epigenéticos. As linhagens Xylaria sp. e Nigrospora oryzae foram submetidas ao cultivo em meio sólido arroz, o que resultou no isomento da substância citocalasina D e de um derivado potencialmente inédito da griseofulvina. A linhagem Penicillium decaturense foi cultivada em meio líquido PDB resultando no isolamento da 10,11-deidrocurvularina e possíveis análogos. Experimentos com inibidores epigenéticos (butirato de sódio e procaína) promoveram a modulação do perfil químico desta linhagem, ao estimular a produção de metabólitos não expressos em condições normais de cultivo. Ainda, a linhagem Acremonium sp. produziu várias substâncias quando cultivada em meio de líquido Czapek sob a influência de procaína, sendo uma delas potencialmente inédita e derivada da classe de metabólitos das brevianamidas. Frações orgânicas da cianobactéria Schizothrix sp., coletada no Panamá, foram analisadas em LC-MS/MS e os dados gerados foram utilizados para a criação de redes moleculares. Este estudo resultou na identificação dos metabólitos barbamida, hectoclorina, curacinas A e D, curazole, acetato de malingamida D, dolastatina 10 e carmaficina B. Ainda, análogos das substâncias curazole, dolastatina D e dois análogos inéditos das carmaficinas foram propostos. A cianobactéria Moorea producens JHB, coletada na Jamaica, foi submetida ao cultivo sob influência do ii composto butirato de sódio, e produziu dois metabólitos inéditos, propostos de acordo com os dados de fragmentação, como sendo derivados da jamaicamida e da hectoclorina, num tipo de biossíntese cruzada. Portanto, este trabalho confirma os fungos endofíticos e cianobactérias marinhos como promissores quanto a exploração do metabolismo secundário. / Marine natural products are pointed out as one of the most important sources of bioactive compounds for drug discovery. In this environment, organisms are in constantly interaction ecological through the production of secondary metabolites. Endophytic fungi and cyanobacteria represent groups of microorganisms that perform biosynthesis of substances with unique chemical features and potent biological activities. However, when removed from their natural habitat, these microbial beings generally lose their metabolic capacity through a phenomenon called gene silencing, in which biosynthetic genes are no longer transcribed due to reasons still undetermined. This genetic mechanism is brokered, among other factors, by the enzyme DNA methyltransferase (DNA-MT) and histone deacetylase (HDAC). Thus, their inhibitors have been used successfully to promote the elicitation of substances that would not be produced under laboratory conditions. Another important approach in the natural products research field have been dereplication based on the fragmentation (MS/MS) for the identification of substances or analogues. The molecular networking is a new approach in which data from mass spectrometry are grouped according to the similarities between the patterns of fragmentation, forming families of molecules, allowing rapid visualization of the chemical profile of several samples simultaneously. Thus, this work presents the isolation and identification of novel metabolites from endophytic fungi and cyanobacteria originating from the marine environment. For this propose, epigenetic elicitation techniques were used in both groups of organisms and the molecular networks via dereplication was used in cyanobacteria. Endophytic fungi associated with red seaweed Bostrychia tenella were subjected to chemical and epigenetic studies. Xylaria sp. and Nigrospora oryzae strains were cultured in solid medium rice, resulting in isolation of substance of cytochalasin D and a potentially novel derivative of griseofulvin. Penicillium decaturense strain was grown in PDB liquid medium resulting in the isolation of 10,11- deidrocurvularina and possible analogues. Experiments with epigenetic inhibitors (sodium butyrate and procaine) promoted the modulation of the chemical profile of this strain, to stimulate the production of metabolites not expressed under normal culture conditions. Moreover, Acremonium sp. produced various substances when grown in liquid medium under the influence of Czapek procaine, one of novel and potentially derived from the class of metabolites brevianamides. Organic fractions of the cyanobacteria Schizothrix sp., collected in Panama, were analized by LC-MS/MS and the data generated were used to create molecular networks. This study resulted in the identification of metabolites barbamide, hectochlorin, curacins A and D, curazole malyngamide D acetate, dolastatin 10 and carmaphycin B. Also, analogs of curazole, dolastatin 10 and carmaphycins A and B have been proposed. Cyanobacteria Moorea producens JHB, collected in Jamaica, was grown under the influence of sodium butyrate, and produced two new proposed metabolites in accordance with the fragmentation data as being derived from jamaicamide and hectochlorin, in a sort of crossed biosynthesis. Therefore, this work corroborates marine endophytic fungi and cyanobacteria as promising for exploration of secondary metabolism.

Os produtos naturais marinhos são apontados com uma das fontes de substâncias bioativas mais importantes para a descoberta de novos fármacos. Neste ambiente, os organismos estão em constante interação ecológica por meio da produção de metabólitos secundários. Fungos endofíticos e cianobactérias representam grupos de micro-organismos que realizam a biossíntese de substâncias com características químicas únicas e atividades biológicas potentes. Entretanto, quando retirados de seu habitat natural, esses seres microbianos geralmente perdem sua capacidade metabólica através de um fenômeno denominado silenciamento gênico, no qual genes biossintéticos deixam de ser transcritos devido a motivos ainda indeterminados. Esse mecanismo genético é intermediado, dentre outros fatores, pelas enzimas DNAmetiltransferase (DNA-MT) e Histona-desacetilase (HDAC). Deste modo, seus inibidores têm sido utilizados com sucesso para promover a eliciação de substâncias que não seriam produzidas em condições laboratoriais. Outra importante abordagem na pesquisa de produtos naturais têm sido a desreplicação baseada na fragmentação (MS/MS) para identificação de substâncias ou análogos. As redes moleculares (molecular networking) constituem uma nova abordagem na qual dados de espectrometria de massas são agrupados de acordo com as semelhanças entre os padrões de fragmentação, formando famílias de moléculas, permitindo a rápida visualização do perfil químico de várias amostras ao mesmo tempo. Deste modo, este trabalho apresenta o isolamento e identificação de metabólitos inéditos a partir de fungos endofíticos e cianobactérias oriundos do ambiente marinho. Para isto, técnicas de eliciação epigenética foram utilizadas em ambos os grupos de organismos, e a desreplicação via redes moleculares foi utilizada em cianobactérias. Fungos endofíticos associados à macroalga vermelha Bostrychia tenella foram alvo de estudos químicos e epigenéticos. As linhagens Xylaria sp. e Nigrospora oryzae foram submetidas ao cultivo em meio sólido arroz, o que resultou no isomento da substância citocalasina D e de um derivado potencialmente inédito da griseofulvina. A linhagem Penicillium decaturense foi cultivada em meio líquido PDB resultando no isolamento da 10,11-deidrocurvularina e possíveis análogos. Experimentos com inibidores epigenéticos (butirato de sódio e procaína) promoveram a modulação do perfil químico desta linhagem, ao estimular a produção de metabólitos não expressos em condições normais de cultivo. Ainda, a linhagem Acremonium sp. produziu várias substâncias quando cultivada em meio de líquido Czapek sob a influência de procaína, sendo uma delas potencialmente inédita e derivada da classe de metabólitos das brevianamidas. Frações orgânicas da cianobactéria Schizothrix sp., coletada no Panamá, foram analisadas em LC-MS/MS e os dados gerados foram utilizados para a criação de redes moleculares. Este estudo resultou na identificação dos metabólitos barbamida, hectoclorina, curacinas A e D, curazole, acetato de malingamida D, dolastatina 10 e carmaficina B. Ainda, análogos das substâncias curazole, dolastatina D e dois análogos inéditos das carmaficinas foram propostos. A cianobactéria Moorea producens JHB, coletada na Jamaica, foi submetida ao cultivo sob influência do ii composto butirato de sódio, e produziu dois metabólitos inéditos, propostos de acordo com os dados de fragmentação, como sendo derivados da jamaicamida e da hectoclorina, num tipo de biossíntese cruzada. Portanto, este trabalho confirma os fungos endofíticos e cianobactérias marinhos como promissores quanto a exploração do metabolismo secundário. / Marine natural products are pointed out as one of the most important sources of bioactive compounds for drug discovery. In this environment, organisms are in constantly interaction ecological through the production of secondary metabolites. Endophytic fungi and cyanobacteria represent groups of microorganisms that perform biosynthesis of substances with unique chemical features and potent biological activities. However, when removed from their natural habitat, these microbial beings generally lose their metabolic capacity through a phenomenon called gene silencing, in which biosynthetic genes are no longer transcribed due to reasons still undetermined. This genetic mechanism is brokered, among other factors, by the enzyme DNA methyltransferase (DNA-MT) and histone deacetylase (HDAC). Thus, their inhibitors have been used successfully to promote the elicitation of substances that would not be produced under laboratory conditions. Another important approach in the natural products research field have been dereplication based on the fragmentation (MS/MS) for the identification of substances or analogues. The molecular networking is a new approach in which data from mass spectrometry are grouped according to the similarities between the patterns of fragmentation, forming families of molecules, allowing rapid visualization of the chemical profile of several samples simultaneously. Thus, this work presents the isolation and identification of novel metabolites from endophytic fungi and cyanobacteria originating from the marine environment. For this propose, epigenetic elicitation techniques were used in both groups of organisms and the molecular networks via dereplication was used in cyanobacteria. Endophytic fungi associated with red seaweed Bostrychia tenella were subjected to chemical and epigenetic studies. Xylaria sp. and Nigrospora oryzae strains were cultured in solid medium rice, resulting in isolation of substance of cytochalasin D and a potentially novel derivative of griseofulvin. Penicillium decaturense strain was grown in PDB liquid medium resulting in the isolation of 10,11- deidrocurvularina and possible analogues. Experiments with epigenetic inhibitors (sodium butyrate and procaine) promoted the modulation of the chemical profile of this strain, to stimulate the production of metabolites not expressed under normal culture conditions. Moreover, Acremonium sp. produced various substances when grown in liquid medium under the influence of Czapek procaine, one of novel and potentially derived from the class of metabolites brevianamides. Organic fractions of the cyanobacteria Schizothrix sp., collected in Panama, were analized by LC-MS/MS and the data generated were used to create molecular networks. This study resulted in the identification of metabolites barbamide, hectochlorin, curacins A and D, curazole malyngamide D acetate, dolastatin 10 and carmaphycin B. Also, analogs of curazole, dolastatin 10 and carmaphycins A and B have been proposed. Cyanobacteria Moorea producens JHB, collected in Jamaica, was grown under the influence of sodium butyrate, and produced two new proposed metabolites in accordance with the fragmentation data as being derived from jamaicamide and hectochlorin, in a sort of crossed biosynthesis. Therefore, this work corroborates marine endophytic fungi and cyanobacteria as promising for exploration of secondary metabolism.

Serrated tussock (Nassella trichotoma) and Giant Parramatta Grass (Sporobolus fertilis) are among the most noxious weeds in Australia. Both cause problems in pasture and there are limited control measures relying heavily on the herbicide flupropanate. With the recent confirmation of flupropanate resistance in serrated tussock and the report of suspected flupropanate resistance in Giant Parramatta Grass (GPG), this option appeared to be under threat.The aims of this thesis were to determine the extent of flupropanate resistance in serrated tussock and GPG in Australia and to understand the genetics of flupropanate resistance in serrated tussock. This thesis also documents the GPG resistance to 2,2-DPA and investigates a fungal pathogen, Nigrospora oryzae, as a potential biocontrol agent for GPG. A local paddock survey determined the spread and extent of flupropanate resistance in serrated tussock within 5 km of the original resistant site. The pot-dose method of assessing resistance identified plants resistant to flupropanate up to 3.5 km from the original site found in Victoria. Seeds from these plants showed 0-100% resistance, with sensitive plants often having a low („T5%) level of resistant seed. These results indicate the movement of flupropanate resistance through seeds or pollen and shows that its spread occurred within one year of detection. A national mail survey confirmed the massive impacts of serrated tussock across Australia, with annual serrated tussock costs ranging from $15,000 to $16,000 per year per respondent. This survey also identified the widespread infestation of this weed in a variety of land use patterns, from pasture to native grasslands, and the decrease in the value of farmland as a result. Heritability studies using controlled breeding experiments indicated a strong involvement of a maternal component in the inheritance of flupropanate resistance in serrated tussock, with a minor proportion of resistance heritable through pollen. GPG plants and seedlings were tested for flupropanate and 2,2-DPA resistance.Seedlings tested for flupropanate resistance were highly resistant (tolerating 33-39 times more than sensitive biotypes). With 2,2-DPA, resistant GPG plants did not die even at 14 times the field rate and resistant seedlings also showed 5-6 times more resistance than the sensitive biotype. The study has confirmed that flupropanate and 2,2-DPA resistance now exists in GPG.The potential of Nigrospora oryzae, a pathogenic fungus, as a biocontrol agent for GPG was determined. Mature plants and seedlings of GPG were inoculated with conidia of N. oryzae using three treatments (run-off, crown, and spray). Inoculated plants were smaller, with greater proportions of dead leaves (70% with the run-off a nd crown treatments and 53% with the spray treatment) than the control plants. GPG seedlings inoculated with N. oryzae were stunted and showed greater proportions of necrotic leaves in all the treatments than the control. There is potential to develop N. oryzae as a mycoherbicide to control GPG and further testing is warranted.

O estudo das interações planta-microrganismos tem sido de grande interesse ao longo dos últimos anos. Atualmente, as interações que ocorrem entre microrganismos que vivem em estreita relação também vêm merecendo grande atenção, pois forças competitivas e mutualísticas podem induzir a produção de novos metabólitos bioativos. Portanto, estudar interações existentes entre os microrganismos endofíticos que colonizam uma mesma planta parece ser uma estratégia promissora para a obtenção de substâncias quimicamente diferentes, eventualmente bioativas. Através da utilização de culturas mistas de microrganismos, o presente trabalho contribuiu para o conhecimento da relação existente entre os fungos endofíticos SS13 (Papulaspora immersa), SS50 (Fusarium oxysporum), SS67 (Nigrospora sphaerica), SS77 (Alternaria tenuissima) e SS84 (Phoma betae), isolados da planta medicinal Smallanthus sonchifolius (yacon), e sua implicação no aumento da diversidade química de produtos naturais microbianos, com o intuito de se identificar metabólitos secundários anticancerígenos. Para isso, os fungos foram cultivados em culturas singles e mistas em meios de cultivo líquidos e semi-sólidos. Foram utilizados diferentes meios de cultura, diferentes maneiras de se estabelecer o cultivo misto e diferentes formas de extração. Os extratos foram analisados química e biologicamente. Após fracionamento, foram isoladas cinco substâncias: afidicolina (I), 3-desóxi-afidicolina (II), estenfiperilenol (III), alterperilenol (IV) e alternariol monometil éter (V), sendo as duas primeiras de origem terpênica e as outras de origem policetídica. As substâncias I e II foram produzidas pelo fungo SS67, sendo que a produção de I aparentemente aumentou nas culturas mistas líquidas com SS13 e SS84, diminuindo consideravelmente na cultura mista com SS77. Devido à afidicolina ser um composto altamente citotóxico, os cultivos do fungo SS67 originaram extratos muito ativos frente aos ensaios de citotoxicidade em células cancerígenas. A substância III, primeiramente, só foi detectada por CLAE-DAD na cultura mista dos fungos SS67 e SS77, e a produção da substância IV foi maior nessa cultura mista que na cultura simples do fungo SS77 (meio fermentativo de extrato de malte). Provavelmente esses compostos foram produzidos por SS77 em resposta à presença de SS67. O extrato obtido durante esse cultivo misto foi o que apresentou maior atividade citotóxica frente à linhagem celular MDAMB-435 (câncer de mama). Posteriormente, a substância III foi também isolada da cultura simples do fungo SS77 cultivado em outras condições (meio fermentativo PDB), juntamente com a substância V. Os experimentos de antagonismo em placa de Petri envolvendo esses dois fungos revelaram, ainda, a presença de vários outros compostos na zona de inibição, que não correspondem às substâncias previamente isoladas de meio líquido, e podem ser responsáveis pelo efeito antagônico observado em meio semi-sólido. Os experimentos de atividade antagônica dos metabólitos produzidos pelos fungos evidenciaram que muitos compostos ativos, provavelmente, são produzidos em quantidades ínfimas, o que impossibilita a detecção por CLAE-DAD. Além disso, verificou-se que a substância I não possui atividade antifúngica significativa contra os fungos SS13, SS50 e SS77 e que a inibição de SS67 por SS77 ocorre devido à produção de compostos difusíveis em meio semi-sólido, e ainda, muito provavelmente, pela produção da substância III e IV em meio líquido, além de outros policetídeos. A produção de metabólitos secundários por fungos endofíticos deve ocorrer em consequência do papel ecológico que desempenham na natureza. Assim, a utilização de culturas mistas desses microrganismos deve induzir a produção de compostos que não seriam produzidos em condições não naturais. / The study of plant-microbe interactions has been of great interest over the past years. Currently, the interactions that occur among organisms that live in close relationship also have been receiving great attention because mutualistic and competitive forces may induce the production of new bioactive metabolites. Therefore, studying the interactions between endophytic microorganisms that colonize the same plant seems to be a promising strategy for obtaining chemically different substances that might also be bioactive. Through the utilization of mixed microbial cultures, this study contributed to knowledge of the relationship among the endophytic fungi SS13 (Papulaspora immersa), SS50 (Fusarium oxysporum), SS67 (Nigrospora sphaerica), SS77 (Alternaria tenuissima) and SS84 (Phoma betae), isolated from the medicinal plant Smallanthus sonchifolius (yacon), and its role in the increase of the chemical diversity of microbial natural products, in order to identify anticancer secondary metabolites. For this aim, the fungi were grown in single and mixed cultures, both in liquid and semi-solid media. Different media, different approaches to establish the mixed cultures and different extraction methods were used. The extracts were analyzed chemically and biologically. After the fractionation, five compounds were isolated: aphidicolin (I), 3-deoxy-aphidicolin (II), stemphyperylenol (III), alterperylenol (IV) and alternariol monomethyl ether (V). Compounds I and II are terpene derivatives, while III, IV and V are polyketide derivatives. The substances I and II were produced by the fungus SS67, and the production of I apparently increased in liquid mixed cultures with SS13 and SS84, decreasing considerably in mixed culture with SS77. Due to the high cytotoxic activity of aphidicolin (I), the cultures of the fungus SS67 originated extracts highly active in the cytotoxicity assays in cancer cells. Substance III was only detected by HPLC-DAD in the mixed culture between the fungi SS67 and SS77, and the production of compound IV was higher in this mixed culture when compared to the single culture of the fungus SS77 (malt extract medium). Probably these compounds were produced by SS77 in response to the presence of SS67. The extract obtained during this mixed culture showed the highest cytotoxic activity against the cell line MDAMB-435 (breast cancer). In a subsequent fermentation in PDB medium, compound III was also isolated from the single culture of the fungus SS77 grown, along with compound V. Additionally, antagonism experiments in Petri dishes with these two fungi revealed the presence of several other compounds in the inhibition zone, which does not correspond to the substances previously isolated from the liquid medium, and may be responsible for the antagonistic effect observed in semi-solid medium. The experiments of antagonistic activity of metabolites produced by fungi showed that many active compounds are probably produced in very small quantities, making it impossible to detect by HPLC-DAD. Moreover, it was found that aphidicolin (I) did not have significant antifungal activity against the fungi SS13, SS50 and SS77 and that the SS67 inhibition by SS77 is due to the production of diffusible compounds in semi-solid medium, and likely, due to the production of compound III and IV in liquid medium, and other polyketides. The production of secondary metabolites by endophytic fungi probably occurs as a result of the ecological role they play in nature. Thus, the use of mixed cultures of these microorganisms may induce the production of compounds that would not be produced under unnatural conditions.

O estudo das interações planta-microrganismos tem sido de grande interesse ao longo dos últimos anos. Atualmente, as interações que ocorrem entre microrganismos que vivem em estreita relação também vêm merecendo grande atenção, pois forças competitivas e mutualísticas podem induzir a produção de novos metabólitos bioativos. Portanto, estudar interações existentes entre os microrganismos endofíticos que colonizam uma mesma planta parece ser uma estratégia promissora para a obtenção de substâncias quimicamente diferentes, eventualmente bioativas. Através da utilização de culturas mistas de microrganismos, o presente trabalho contribuiu para o conhecimento da relação existente entre os fungos endofíticos SS13 (Papulaspora immersa), SS50 (Fusarium oxysporum), SS67 (Nigrospora sphaerica), SS77 (Alternaria tenuissima) e SS84 (Phoma betae), isolados da planta medicinal Smallanthus sonchifolius (yacon), e sua implicação no aumento da diversidade química de produtos naturais microbianos, com o intuito de se identificar metabólitos secundários anticancerígenos. Para isso, os fungos foram cultivados em culturas singles e mistas em meios de cultivo líquidos e semi-sólidos. Foram utilizados diferentes meios de cultura, diferentes maneiras de se estabelecer o cultivo misto e diferentes formas de extração. Os extratos foram analisados química e biologicamente. Após fracionamento, foram isoladas cinco substâncias: afidicolina (I), 3-desóxi-afidicolina (II), estenfiperilenol (III), alterperilenol (IV) e alternariol monometil éter (V), sendo as duas primeiras de origem terpênica e as outras de origem policetídica. As substâncias I e II foram produzidas pelo fungo SS67, sendo que a produção de I aparentemente aumentou nas culturas mistas líquidas com SS13 e SS84, diminuindo consideravelmente na cultura mista com SS77. Devido à afidicolina ser um composto altamente citotóxico, os cultivos do fungo SS67 originaram extratos muito ativos frente aos ensaios de citotoxicidade em células cancerígenas. A substância III, primeiramente, só foi detectada por CLAE-DAD na cultura mista dos fungos SS67 e SS77, e a produção da substância IV foi maior nessa cultura mista que na cultura simples do fungo SS77 (meio fermentativo de extrato de malte). Provavelmente esses compostos foram produzidos por SS77 em resposta à presença de SS67. O extrato obtido durante esse cultivo misto foi o que apresentou maior atividade citotóxica frente à linhagem celular MDAMB-435 (câncer de mama). Posteriormente, a substância III foi também isolada da cultura simples do fungo SS77 cultivado em outras condições (meio fermentativo PDB), juntamente com a substância V. Os experimentos de antagonismo em placa de Petri envolvendo esses dois fungos revelaram, ainda, a presença de vários outros compostos na zona de inibição, que não correspondem às substâncias previamente isoladas de meio líquido, e podem ser responsáveis pelo efeito antagônico observado em meio semi-sólido. Os experimentos de atividade antagônica dos metabólitos produzidos pelos fungos evidenciaram que muitos compostos ativos, provavelmente, são produzidos em quantidades ínfimas, o que impossibilita a detecção por CLAE-DAD. Além disso, verificou-se que a substância I não possui atividade antifúngica significativa contra os fungos SS13, SS50 e SS77 e que a inibição de SS67 por SS77 ocorre devido à produção de compostos difusíveis em meio semi-sólido, e ainda, muito provavelmente, pela produção da substância III e IV em meio líquido, além de outros policetídeos. A produção de metabólitos secundários por fungos endofíticos deve ocorrer em consequência do papel ecológico que desempenham na natureza. Assim, a utilização de culturas mistas desses microrganismos deve induzir a produção de compostos que não seriam produzidos em condições não naturais. / The study of plant-microbe interactions has been of great interest over the past years. Currently, the interactions that occur among organisms that live in close relationship also have been receiving great attention because mutualistic and competitive forces may induce the production of new bioactive metabolites. Therefore, studying the interactions between endophytic microorganisms that colonize the same plant seems to be a promising strategy for obtaining chemically different substances that might also be bioactive. Through the utilization of mixed microbial cultures, this study contributed to knowledge of the relationship among the endophytic fungi SS13 (Papulaspora immersa), SS50 (Fusarium oxysporum), SS67 (Nigrospora sphaerica), SS77 (Alternaria tenuissima) and SS84 (Phoma betae), isolated from the medicinal plant Smallanthus sonchifolius (yacon), and its role in the increase of the chemical diversity of microbial natural products, in order to identify anticancer secondary metabolites. For this aim, the fungi were grown in single and mixed cultures, both in liquid and semi-solid media. Different media, different approaches to establish the mixed cultures and different extraction methods were used. The extracts were analyzed chemically and biologically. After the fractionation, five compounds were isolated: aphidicolin (I), 3-deoxy-aphidicolin (II), stemphyperylenol (III), alterperylenol (IV) and alternariol monomethyl ether (V). Compounds I and II are terpene derivatives, while III, IV and V are polyketide derivatives. The substances I and II were produced by the fungus SS67, and the production of I apparently increased in liquid mixed cultures with SS13 and SS84, decreasing considerably in mixed culture with SS77. Due to the high cytotoxic activity of aphidicolin (I), the cultures of the fungus SS67 originated extracts highly active in the cytotoxicity assays in cancer cells. Substance III was only detected by HPLC-DAD in the mixed culture between the fungi SS67 and SS77, and the production of compound IV was higher in this mixed culture when compared to the single culture of the fungus SS77 (malt extract medium). Probably these compounds were produced by SS77 in response to the presence of SS67. The extract obtained during this mixed culture showed the highest cytotoxic activity against the cell line MDAMB-435 (breast cancer). In a subsequent fermentation in PDB medium, compound III was also isolated from the single culture of the fungus SS77 grown, along with compound V. Additionally, antagonism experiments in Petri dishes with these two fungi revealed the presence of several other compounds in the inhibition zone, which does not correspond to the substances previously isolated from the liquid medium, and may be responsible for the antagonistic effect observed in semi-solid medium. The experiments of antagonistic activity of metabolites produced by fungi showed that many active compounds are probably produced in very small quantities, making it impossible to detect by HPLC-DAD. Moreover, it was found that aphidicolin (I) did not have significant antifungal activity against the fungi SS13, SS50 and SS77 and that the SS67 inhibition by SS77 is due to the production of diffusible compounds in semi-solid medium, and likely, due to the production of compound III and IV in liquid medium, and other polyketides. The production of secondary metabolites by endophytic fungi probably occurs as a result of the ecological role they play in nature. Thus, the use of mixed cultures of these microorganisms may induce the production of compounds that would not be produced under unnatural conditions.

Submitted by Fabio Sobreira Campos da Costa (fabio.sobreira@ufpe.br) on 2015-05-15T12:08:56Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) Santos, Irailton Prazeres - 579.5 CDD.pdf: 2652551 bytes, checksum: 3622e108d9dab2f7f5dafd30a0b8eb5b (MD5) / Made available in DSpace on 2015-05-15T12:08:57Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) Santos, Irailton Prazeres - 579.5 CDD.pdf: 2652551 bytes, checksum: 3622e108d9dab2f7f5dafd30a0b8eb5b (MD5) Previous issue date: 2015-02-11 / FACEPE, CAPES, CNPq / Fungos endofíticos vêm despertando grande interesse biotecnológico em virtude da aplicabilidade de seus metabólitos secundários na medicina, indústria e agricultura. A espécie Indigofera suffruticosa é uma planta encontrada no Brasil, conhecida por apresentar várias atividades biológicas. Nesse trabalho fungos endofíticos foram isolados de folhas de I. suffruticosa na Mata Atlântica e na Caatinga, do estado de Pernambuco, durante as estações seca e chuvosa, taxonomicamente caracterizados e avaliados quanto a produção de metabólitos com atividade antimicrobiana. Todos os fungos isolados foram submetidos a um screening preliminar, e os que apresentaram melhores resultados foram fermentados em diferentes meios de cultura líquidos e semi-sólidos, e tiveram sua atividade antimicrobiana análisada através do método de difusão em disco. O extrato metanólico de Nigrospora sphaerica (NsME) obtido a partir do clutivo em meio de cultura de arroz, e o extrato de acetato de etila de N. sphaerica (NsEAE) obtido a partir do sobrenadante após o cultivo no meio líquido Batata Dextrose, tiveram suas concentração mínima inibitória (CMI) e concentração mínima bactericida (CMB) determinadas contra bactérias Gram-negativas e bactérias Gram-positivas. O extrato NsEAE foi submetido a colunas cromatográficas e as frações e subfrações obtidas foram analizadas através de ressonância magnética nuclear, resultando na identificação do ácido indólico-3-carboxílico, o qual foi avaliado quanto a sua atividade anti-Candida. Um total de 107 fungos foram isolados e identificados de acordo com as características morfológicas e chaves taxonómicas. Entre os nove táxons identificados, Colletotrichum gloeosporioides (13,4%), Pseudocochliobolus pallescens (8,3%), Nigrospora sphaerica [Khuskia oryzae] (7,4%), e Pestalotiopsis maculans (6,9%) foram os mais frequentes. Curvularia australiensis e Chaetomella raphigera foram isolados apenas na Caatinga durante períodos seco e chuvoso, respectivamente e são relatadas como a primeira vez que foram isoladas a partir de uma planta na Caatinga. Lasiodiplodia theobromae foi encontrada apenas na Mata Atlântica no período de seco, floresta em que a diversidade de fungos isolados foi maior. Entre os fungos endofíticos isolados, 18 fungos mostraram atividade contra pelo menos um microorganismo teste em um screening preliminar, e os melhores resultados foram obtidos com a espécie N. sphaerica (URM-6060) e P. maculans (URM-6061). Após a fermentação, apenas N. sphaerica apresentou atividade antibacteriana quando fermentada meio de cultura líquido Batata Dextrose e no meio semi-sólido arroz. Os extrato NsME e NsEAE foram ativos contra bactérias Gram-negativas e Gram-positivas, com CMI variando entre 1.56 e 6.25 mg/mL e CMB variando entre 6.25 e 50 mg/mL. O melhor resultado foi observado contra Staphylococcus aureus, com CMI 1,56 mg/ml e CMB 6,25 mg/ml para NsME e CMI 0,39 mg/ml e CMB 3,12 mg/ml com o extrato NsEAE. O ácido indólico-3-carboxílico apresentou atividade fungicida contra todas as espécies de Candida testadas, com CMI variando entre 0.125 e 0.0039 mg/mL e concentração mínima fungicida (CMF) variando entre 0.125 e 0.0039 mg/mL, sendo os melhores resultados observados contra Candida guilermondii, C. haemulonii and C. albicans. Estes resultados representam o primeiro relato sobre a micobiota endofítica de I. suffruticosa demonstrando que as características da Mata Atlântica favorecem uma maior colonização de fungos endofíticos, em comparação com a Caatinga, em que o fungo N. sphaerica demonstrou ser capaz para produzir agentes bioativos com potencial uso farmacêutico na busca de novas fontes biológicas de candidatos a fármacos.