Orientador: Jackson Antônio Marcondes de Souza / Coorientador: Tereza Cristina Luque Castellane / Banca: Janete Apparecida Desidério / Banca: Danielle Gregório Gomes Caldas / Resumo: O feijoeiro desenvolve associação simbiótica nas raízes com a bactéria Rhizobium tropici, naturalmente ou via inoculação, propiciando a infecção das raízes da planta hospedeira e provocando a formação de nódulo onde ocorre a fixação do N2. Os genes bacterianos envolvidos na formação dos nódulos estão divididos em: 1) genes que especificam a composição bioquímica da superfície celular bacteriana e 2) genes relacionados à produção de polissacarídeos. Estirpes de rizóbio são eficientes produtores de EPS, tais moléculas estão envolvidos nos processos de infecção e fixação biológica do nitrogênio (FBN). Estirpes mutantes dessa bactéria têm um papel importante não só na fixação biológica do nitrogênio, como também, biotecnologicamente. Neste trabalho foi realizada a caracterização do potencial biotecnológico de microrganismos mutantes em relação a sua estirpe selvagem SEMIA 4080, por meio da análise de expressão gênica, por PCR em tempo real, dos genes fixN, nifH, exoZ, exoR e phbC, relacionados ao processo de FBN. Foram selecionados quatro mutantes construídos por inserção de transposons Tn5. Para a avaliação da expressão gênica, o RNA foi extraído nas fases lag, log e estacionária de crescimento bacteriano e também na fase de bacterióides, isolados de nódulo de feijoeiro inoculados com as estirpes mutantes e selvagem. Os dados de seqüenciamento revelam que a mutação não ocorreu no gene exoZ, gene para o qual a mutação foi direcionada. A mutação aparentemente não alterou a expressão dos genes relacionados à FBN, no entanto, os mutantes apresentaram menor eficiência na simbiose. Sendo assim, tais mutantes são recomendados na utilização biotecnológica, uma vez que apresentam maior produção de exopolissacarídeos em relação a sua estirpe selvagem / Abstract: Plant bean develops symbiotic association with Rhizobium tropici bacteria both naturally or through inoculation, enabling the infection of roots of the host plant and triggering nodule formation where N2 fixation takes place. The bacterial genes involved in the formation of the nodules are divided into two classes: 1) genes that specify the biochemical composition of the bacterial cell surface and 2) genes related to the production of capsular polysaccharides. Rhizobia strains are efficient producers of exopolysaccharides and such exudates present complex structure involved in processes of infection and biological nitrogen fixation (BNF). This work focused on the characterization of the biotechnological potential of mutants in relation to their wild type SEMIA 4080, through gene expression analysis by real time PCR, gene fixN, nifH, exoZ, exoR and phbC, related to the process of BNF. Four mutants selected were constructed by insertion of transposons Tn5. For the evaluation of gene expression, RNA was extracted phases lag, log and stationary, bacterial growth phase and also in bacteroids isolated from nodules of bean plants inoculated with the mutant strains and wild type. The sequencing data revealed that the mutation not occur in exoZ gene, the gene to which mutation was directed. The mutation apparently did not alter the expression of genes related to BNF, however, the mutants were less efficient in symbiosis. Thus, these mutantes are recommended in the biotechnological utilization since a higher production of exopolysaccharides in relation to their wild type strain / Mestre

Orientador: Jackson Antônio Marcondes de Souza / Banca: Janete Aparecida Desidério / Banca: Rodrigo Matheus Pereira / Resumo: O Brasil é considerado mundialmente o segundo maior produtor de soja, com perspectiva para a safra de 2011 /2012 entre 72,18 e 73,29 milhões de hectares. Bactérias do tipo B.elkanii, fixadoras de nitrogênio, estabelecem uma relação simbiótica com a soja convertendo o nitrogênio atmosférico em amônia, que é o composto assimilável pela planta. Essas bactérias diazotróficas, do tipo Bradyrrizobium elkanii, têm a capacidade de sintetizar e acumular polihidroxibutirato (PHB), homopolímero de origem afilática com propriedades semelhantes aos dos polipropilenos utilizado para a produção de plástico biodegradável. Linhagens mutantes para o aumento na síntese e acúmulo de polímero foram desenvolvidas e testadas visando interesse biotecnológico da aplicação comercial das mesmas. O objetivo foi analisar a fixação biológica do nitrogênio (nifH e fixN ), conversão de amônia em aminoácidos (glnA e glnB) e acúmulo de polímero ( phbA, phbB e phbC) através da analise por PCR em tempo real. .As linhagens mutantes apresentaram expressão positiva e significativa para os genes de acúmulo e síntese de PHB in vitro; já em simbiose, apresentaram expressão negativa para os mesmos considerando a competição das vias de acúmulo de polímero e fixação biológica do nitrogênio. Frente ao potencial biotecnológico da aplicação industrial de polímeros de origem bacteriana, a análise por meio desta abordagem foi de fundamental importância para utilização futura e aprimoramento das linhagens mutantes de B. elkanii, bem como a análise expressão permitiu o conhecimento de interações metabólicas no processo de simbiose / Abstract: Brazil is considered the world's second largest soybean producer, with prospects for the harvest of 2011/2012 between 72.18 and 73.29 million hectares. B.elkanii type bacteria, nitrogen fixing, establishing a symbiotic relationship with soybean converting atmospheric nitrogen into ammonia, which is the compound assimilated by the plant. These diazotroph, Bradyrrizobium elkanii type, have the ability to synthesize and accumulate polyhydroxybutyrate (PHB), homopolymer afilática source with similar properties to the polypropylenes used for the production of biodegradable plastics. Mutant strains for the increase in polymer synthesis and accumulation have been developed and tested in order biotechnological interest of commercial application of the same. The aim was to analyze the biological nitrogen fixation (nifH and fixN), conversion of ammonia into amino acids (glnA and glnB) and accumulation of polymer (phbA, phbB and phbC) by PCR analysis in real time. . The mutant strains exhibited significant and positive expression of genes for the synthesis of PHB accumulation and in vitro, whereas in symbiosis showed negative expression for them considering the competition of the process of accumulation of polymer and biological nitrogen fixation. Front of the biotechnological potential of the industrial application of polymers of bacterial origin, the analysis by this approach was crucial for future use and improvement of mutant strains of B. elkanii and expression analysis allowed the understanding of metabolic interactions in the process of symbiosis / Mestre

Orientador: Carlos Alexandre Costa Crusciol / Banca: Denizart Bolonhez / Banca: Edson Lazarini / Resumo: Áreas que vem sendo cultivadas com pastagens por vários anos podem apresentar deficiências nutricionais e a população de bactérias fixadoras do nitrogênio atmosférico pode estar reduzida. O molibdênio é um micronutriente que faz parte da enzima nitrogenase, a qual é responsável pela fixação simbiótica do nitrogênio nas leguminosas, e está presente nos bacteróides nodulares. Com base nisso, o presente trabalho teve por objetivo avaliar o efeito da aplicação de molibdênio e inoculante, na cultura do amendoim em semeadura direta sobre palhada de forrageiras. Foram conduzidos quatro experimentos, dois no ano agrícola 2008/09 e dois no ano agícola 2009/10, onde a cultura do amendoim foi semeada, respectivamente, sobre as palhadas da Brachiaria brizantha, Brachiaria ruziziensis, Brachiaria brizantha e Brachiaria decumbens no delineamento de blocos casualizados, em esquema de parcelas subdivididas, com quatro repetições. As parcelas dos experimentos foram constituídas por dois tratamentos, com e sem aplicação de inoculante (1- inoculação artificial com estirpe específica de bactéria Bradyrhizobium spp. para a cultura do amendoim e 2- sem inoculação artificial) e as subparcelas dos experimentos do ano agrícola 2008/09 por três doses de molibdênio (27,5, 55, 110g ha-1) aplicadas via tratamento de sementes, na forma de molibdato de amônio e a testemunha. As subparcelas dos experimentos do ano agrícola 2009/10 constituíram-se de três doses de molibdênio (50, 100, 200g ha-1) aplicadas via foliar, na forma de molibdato de amônio e a testemunha. Foram avaliados o estado nutricional das plantas, a nodulação (número e matéria seca de nódulos por planta), a atividade da enzima nitrogenase pelo método da redução do acetileno, a atividade específica da nitrogenase, os componentes da produção... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: The areas that have been cultivated with pasture for several years may have nutritional deficiencies and the population of atmospheric nitrogen fixing bacteria may be reduced. Molybdenum, a nutrient that is part of the nitrogenase enzyme, is responsible for symbiotic nitrogen fixation in legumes and is present in bacteria from the nodules. This study aimed at evaluating the effect of molybdenum and inoculant application, in peanut crop sown on a straw of forages. Four experiments were carried out, two in 2008/09 crop year and two in 2009/10 crop year, where peanut crop was directly sown, respectively, on the straws of Brachiaria brizantha, Brachiaria ruziziensis, Brachiaria brizantha and Brachiaria decumbens in the design of randomized blocks in a split-plot with four replications. The plots comprised two treatments, with and without inoculant application (1 - artificial inoculation with specific strain of Bradyrhizobium spp. for peanut crop and 2 - without artificial inoculation) and the subplots of the experiments carried out in the 2008/09 crop year in three molybdenum rates (27,5, 55 e 110 g ha-1) applied in the form of ammonium molybdate by seeds treatment and a control. The subplots of the experiments carried out in the 2009/10 crop year comprised three molybdenum rates (50, 100 e 200 g ha-1) applied as ammonium molybdate by foliar spraying and a control. The nutritional status of plants, nodulation (number and mass of dry matter of the nodules per plant), the activity of nitrogenase enzyme by acetylene reduction method, the specific activity of nitrogenase, yield components and the yield of pods and grains were evaluated. The data of each experiment were subjected to analysis of variance following the split plot model. To compare the average of inoculation, the method of comparison of unprotected average... (Complete abstract click electronic access below) / Mestre

Orientadora: Eliana Gertrudes de Macedo Lemos / Banca: Maria José Valarini / Banca: Miguel Luis Menezes Freitas / Banca: João Martins Pizauro Junior / Banca: Leandro Borges Lemos / Resumo: A diversidade genética de quinze estirpes de rizóbios isoladas do feijoeiro, provenientes de várias localidades do Brasil e da Venezuela, foi determinada pelo seqüenciamento do gene 16S rRNA. Selecionaram-se as duas melhores estirpes de cada país, com base em nodulação, produção de massa seca e de nitrogênio total em plantas de feijão, e compararam-se as suas produtividades e nodulação no feijoeiro, com duas estirpes comerciais, CIAT-899 e PRF-81, em um solo Latossolo Vermelho-Escuro da região de Jaboticabal SP. Determinou-se ainda a diversidade genética das populações nativas do solo e das quatro estirpes, pelo seqüenciamento do espaço intergênico, entre os genes 16S e 23S rRNA. Experimentos foram conduzidos em blocos casualizados com três repetições, em casa de vegetação, na UNESP, em 2007. O primeiro foi realizado em tubetes com vermiculita e quinze tratamentos: sete diluições seriadas do solo de 10-1 a 10-7, as quatro estirpes, as comerciais e duas testemunhas com e sem nitrogênio. Das colônias isoladas extraiu-se o DNA genômico e realizou-se o seqüenciamento do espaço intergênico. O segundo experimento foi realizado em vasos contendo solo e treze tratamentos: as quatro estirpes isoladamente e misturadas com a estirpe PRF- 81, as comerciais, a mistura delas, e duas testemunhas com e sem nitrogênio. Houve coincidência entre os marcadores moleculares do gene 16S rRNA e o espaço intergênico na identificação das espécies. Encontraram-se estirpes tão produtivas quanto as comercias. A mistura com a estirpe PRF-81 não incrementou a produtividade e produziu um efeito antagônico com a estirpe LBMP-12BR. A população nativa do solo foi identificada como Rhizobium sp., sendo ineficiente na fixação de nitrogênio. Há estirpes promissoras que mostram uma resposta diferencial quando são misturadas nos inoculantes. / Abstract: The genetic diversity of 15 rhizobia strains isolated from common beans grown in Brazil and Venezuela was determined by sequencing the 16S rRNA gene. Two strains were selected from each country for further study based on nodulation, dry weight, and total nitrogen in the common bean plants, and productivity and nodulation on the common bean of these strains were evaluated in Latossolo Vermelho Escuro soil of Jaboticabal SP, in comparison to two commercial strains, CIAT-899 and PRF-81. The genetic diversity of the native soil population and the four strains was determined by sequencing of the intergenic space between the 16S and 23S rRNA genes. In 2007, experiments were carried out under glass house conditions at the UNESP. The first was conducted in tubs with vermiculite, and 15 treatments were examined: seven soil serial dilutions (10-1 to 10-7), the four novel strains, two commercial strains, and two controls with and without nitrogen. From the pure isolated colonies, DNA was extracted, and the intergenic space was sequenced. The second experiment was conducted in pots filled with soil, and 13 treatments were examined: the four strains alone and in mixture with the PRF-81 strain, the two commercial strains alone and in mixture, and two controls with and without nitrogen. There was coincidence between the 16S rRNA gene and the intergenic space molecular markers for species identification. Strains that had productivity values equivalent to the commercial strains were identified. The mixture of PRF-81 strain to each one of the four strains did not increase productivity and produced an antagonistic effect on the LBMP-12BR strain. The native soil population was identified as Rhizobium sp. and was found to be inefficient in nitrogen fixation. This study identified promising new Rhizobium strains that exhibit differential responses in mixtures on inoculants. / Doutor

Resumo: O arroz é o cereal mais consumido na dieta humana no mundo, sendo que o Brasil é um dos maiores produtores e consumidores desse cereal. A produção brasileira entre arroz irrigado e sequeiro é estimada entre 10 a 11 milhões toneladas por ano. Os gastos com fertilizantes nitrogenados nessa cultura provocam um alto custo de produção para o agricultor, sendo esses gastos repassados ao consumidor. Desta forma, existe a necessidade de avanços nas pesquisas sobre os microrganismos que se encontram na rizosfera de diversos vegetais e que auxiliam o vegetal na obtenção de nutrientes diminuindo o custo de produção da cultura, além de aumentar a produção de grãos. O objetivo deste trabalho foi avaliar cinco estirpes de Rhizobium leguminosarum bv trifolii e isolados selvagens obtidos de dois cultivares de arroz no Brasil, avaliar quanto à produção de ácido indolacético, potencial de fixação biologica de nitrogênio e capacidade de promover o crescimento de arroz em solução nutritiva. Os ensaios com arroz foram realizados em uma câmara de crescimento, em um delimento inteiramente casualisado em um período de 30 dias. Todos os isolados R. leguminosarum deste experimento e 19 isolados selvagens foram positivos para a produção de ácido indolacético in vitro. As estirpes SEMIAs 2051 e 235 foram às maiores produtores de ácido indolacético com 91,56 Tg/mL e 68,30 Tg /mL, respectivamente. Entretanto somente três estirpes de rizóbios e 12 isolados selvagens conseguiram reduzir acetileno a etileno em condições laboratoriais, sendo a SEMIA 2051 a que mais se destacou. Inoculações de sementes de arroz com as estirpes SEMIAs 235, 2050, 2051 e MT6 resultaram em aumento significativo em relação à massa seca, e no números de raízes laterais nas radículas das plântulas em 30 dias. (para P < 001). Este estudo indicou que as bactérias SEMIAs 235, 2050 e 2051 e MT6 podem... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Rice is the most consumed cereal grain in human food and Brasil is one of the most important producers of this culture. Brazilian production of irrigated and non-irrigated Rice is estimated in 10 - 11 millions of thousand kilograms per year. Nitrogenated fertilizers represents an important part f the production costs that are repassed to the final consumers. In this way, there are needs of more efforts in research about microorganisms that live in plant rizosphere and that were able to help the plant to obtain nutrients from the soil, mainly nitrogen, and so, increase the production while decreasing the production costs. This work has the objective of evaluate the indolacetic acid production of five strains of Rhizobium leguminosarum bv trifolii, and e wild isolated of two cultivating of rice in Brazil its biological nitrogen fixation potential and its capacity to promote rice growth in nutritional solution. Essays were carried out in growth chamber with outline completely casualized during 30 days. All strains of R. leguminosarum and wild isolated produced indolacetic acid, and SEMIAs 2051 and 235 were the higher producers, with 91,56 Tg/mL and 68,30 Tg /mL, respectively. However, only three strains and 12 wild isolated were able to reduce acetilene to etilene in laboratorial conditions, and SEMIA 2051 was the most efficient strain. Inoculations in Rice seeds that were made with SEMIAs 235, 2050, 2051and MT6 strains resulted in a significative increase in dry mass and in the number of lateral roots in the plants in 30 days (P < 001). This work showed that strains SEMIAs 235, 2050 e 2051 and MT6 can promote Rice growth in nutritive solutions and so, are important for the developing of inoculants that could be used for this culture, reducing the cultural costs and also increase the rice production in world. / Orientadora: Lúcia Maria Carareto Alves / Coorientadora: Eliana Gertrudes Macedo Lemos / Banca: Vera Lúcia Divan Baldani / Banca: Edvan Alves Chagas / Banca: Ester Wickert / Banca: Janete Apparecida Desidério Sena / Doutor