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L'homéostasie chlorure (HC) est un acteur essentiel dans la transmission nerveuse. Le GABA, via son récepteur GABAA, permet les mouvements d'ions chlorures en fonction de leur potentiel électrochimique. Dans les neurones sensitifs de ganglions rachidiens dorsaux (GRD), le co-transporteur cation-chlorure NKCC1 est responsable de l'accumulation intracellulaire des ions Cl- et de l'effet dépolarisant du GABA. Suite à une lésion, l'augmentation de la concentration intracellulaire en ions Cl- ([Cl-]i) permet une amélioration des capacités régénératives neuronales. Au cours de ma thèse, je me suis en premier lieu intéressé à la régulation de l'HC par interleukine 6 (IL6) en réponse à une lésion nerveuse. L'axotomie du nerf sciatique induit l'expression de l'IL6 et son récepteur IL6-Rα dans les neurones sensitifs des GRD lombaires L4-L5. Des mesures par patch perforé sur des neurones sensitifs en culture ont montré une augmentation de la [Cl-]i dépendante de l'IL6 dans une sous-population de neurones mécano- et proprioceptifs en réponse à l'axotomie. Cette régulation est permise par la phosphorylation à la membrane plasmique neuronale de NKCC1. Le co-transporteur KCC3 est impliqué dans une maladie génétique conduisant dès la naissance à une perte sensorimotrice, ce qui m'a conduit à étudier son rôle dans la régulation de l'HC des neurones sensitifs au cours du développement et chez l'adulte. Nos données ont démontré l'existence d'un « switch chlorure » développemental, diminuant la [Cl-]i. Ce switch est altéré chez la souris KCC3-/-, dans laquelle une partie des neurones a déjà diminué sa [Cl-]i. Au stade adulte, nous avons également observé un doublement de la [Cl-]i dans 30% des neurones sensitifs de souris KCC3-/-, pourcentage corrélé à la proportion de neurones WT exprimant KCC3. Ces données prouvent que KCC3 est impliqué, de manière directe ou non, dans la régulation de l'HC des neurones sensitifs au cours du développement et chez l'adulte. / Chloride homeostasis (CH) is a major component of nerve transmission. Interaction between the neurotransmitter GABA and his receptor, GABAA, allows chloride movements depending on electrochemical potential. In dorsal root ganglia (DRG) sensory neurons, the cation-chloride cotransporter NKCC1 is responsible for intracellular accumulation of chloride ions and depolarizing effects of GABA. After injury, an increase of intracellulaire chloride concentration ([Cl-]i) allows an improvement of neuronal regenerative capacities. In a first time, I worked on regulation of CH by interleukine 6 (IL6) in response to nerve injury. Axotomy of the sciatic nerve induces expression of IL6 and his receptor IL6-Rα in sensory neurons from lombar L4-L5 DRG. Perforated patch measurements of sensory neurons have demonstrated an increase of [Cl-]i depending on IL6 in a sub-population of mechano- and proprioceptors in response to lesion. This regulation is provided by phosphorylation at the neuronal plasma membrane of NKCC1. The cation-chloride cotransporter KCC3 is implicated in a hereditary syndrome leading after birth to sensorymotors defects. This is why I have studied his role in regulation of CH in sensory neurons during development and in adulthood. Data have shown the existence of a peripheral developmental “chloride switch”. This switch is abolished in KCC3-/- sensory neurons, in which a part of neurons has already decreased [Cl-]i. In adulthood, we also observed an [Cl-]i twice as much as WT in 30% of sensory neurons from KCC3-/- mice. This percentage is correlated to the proportion of WT neurons expressing KCC3. These results demonstrate for the first time that KCC3 is implicated in regulation of CH in sensory neurons during development and in adulthood.

Les études cliniques montrent que l’incidence des crises épileptiformes est la plus forte durant la période néonatale. Ces crises ont de nombreux facteurs étiologiques : un traumatisme crânien, des épisodes anoxo-ischémiques, des infections périnatales, des hémorragies intracrâniennes, des troubles métaboliques et de la fièvre... Ces crises per se peuvent entrainer des conséquences délétères à long terme. Notamment, l’hypothèse que la propagation des crises répétées vers des structures cérébrales naïves peut conduire à la formation d’un foyer épileptique secondaire qui génère des crises spontanées a été longtemps suggérée comme étant un mécanisme de base dans l’épilepsie humaine. Par conséquent, il est nécessaire de traiter efficacement les crises néonatales. Cependant, les traitements de premier choix comme le phénobarbital et le diazépam qui ont été développés pour traiter les crises chez l’adulte, sont souvent inefficaces chez les nouveau-nés et peuvent même aggraver les crises. Les mécanismes à l’origine de cette différence sont actuellement mal connus. Récemment, à l’aide d’une préparation développée dans le laboratoire composée des deux hippocampes néonataux interconnectés, il a été montré pour la première fois que des crises induites dans un hippocampe qui se propagent vers l’hippocampe controlatéral pouvaient conduire à la formation d’un foyer épileptique secondaire - foyer miroir (« seizure beget seizure »). Ce modèle a permis de montrer qu’un des mécanismes clés de la formation d’un foyer épileptique était l’augmentation permanente du chlore intracellulaire résultant en une action GABAergique excitatrice favorisant la genèse de crises spontanées. Déterminer les mécanismes à l’origine de l’épileptogenèse secondaire est d’une importance clinique majeure, et permettra de développer de nouvelles stratégies de prévention des effets pathologiques des crises.La première partie de ce travail a été de définir l’implication du co-transporteur de chlore NKCC1 dans la genèse de crises et l’épileptogenèse secondaire. Nous avons montré que le blocage de NKCC1, à l’aide d’outils pharmacologiques ou génétiques, ne prévient ni la formation d’un foyer miroir par des crises propagées ni l’augmentation permanente de chlore intracellulaire. Par conséquent, NKCC1 n’est ni nécessaire ni suffisant à induire ces modifications. Dans la deuxième partie, utilisant des outils électrophysiologiques et immunochimiques, nous apportons un faisceau d’évidences montrant que le co-transporteur de chlore KCC2 est internalisé et altéré fonctionnellement par des crises suggérant que l’accumulation de chlore résulte essentiellement de l’incapacité des neurones à évacuer le chlore. Dans la troisième partie nous avons étudié les effets du phénobarbital (PB) et du diazépam (DZP) sur la genèse de crises et l’épileptogenèse durant la période néonatale. En particulier, nous montrons que le PB, mais pas le DZP, bloque des crises initiales induites et prévient l’induction d’un foyer épileptique secondaire. Cette différence est due à un blocage partiel des récepteurs AMPA/KA par le PB. Cependant, une fois le foyer miroir établi, le PB comme le DZP aggravent les crises spontanées en exacerbant les effets excitateurs du GABA. Ces résultats montrent que l’histoire des crises détermine les effets du PB. En outre, le bumétanide, un antagoniste de NKCC1 qui réduit le chlore intracellulaire, améliore l’action du PB et bloque les crises spontanées. En conclusion, nos observations plaident fortement pour un traitement rapide des crises néonatales afin de protéger autant que faire les capacités du neurone à réguler le chlore intracellulaire. / Clinical studies show that children, especially neonates are in a much higher risk than adults to develop seizures. Such seizures in the brain may be provoked by different factors: tumor, infection, anoxia, fever, trauma, cysts, vascular malformations... Seizures in neonates are also often resistant to treatments and available antiepileptic drugs (AEDs) are inefficient or even provoke and aggravate neonatal seizures. A fundamental concept in epilepsy is that the seizures generated in epileptogenic regions propagate to the other brain structures even to the contralateral side and may develop permanent epileptic focus in the naïve brain structures – secondary epileptic focus. Consequently, it is necessary to treat the neonatal seizures. Diazepam (DZP) and phenobarbital (PB) are extensively used as first and second line drugs to treat acute seizures in neonates and their actions are thought to be mediated by increasing the actions of GABAergic signals. Yet, their efficacy is different and variable with occasional failure or even aggravation of recurrent seizures questioning whether other mechanisms are not involved in their actions. We studied these issues in the intact interconnected hippocampal preparation from neonatal rats and mice. Using this preparation and three-compartment chamber we induced seizures in one hippocampus that propagated to the contralateral one. The propagation of recurrent seizures transformed the contralateral hippocampus into independent epileptogenic focus – mirror focus (MF) - that was capable of generating spontaneous seizures (« seizure beget seizure »). The formation of MF is associated with a permanent increase of the intracellular concentration of chloride and a shift of the actions of GABA from inhibitory to excitatory. Therefore determining how secondary epileptogenesis is induced will have major clinical impact as it will enable to develop tools that prevent selectively the pathogenic seizures.At first, we have determined the impact and the contribution of chloride co-transporter NKCC1 in seizure generation and secondary epileptigenesis. We have shown that the pharmacologically or genetically blockade of NKCC1 did not prevent neither the generation nor propagation of evoked seizures nor formation of MF. However, in the isolated MF, bumetanide effectively blocked spontaneous epileptiform activity. Bumetanide partially reduced DFGABA and therefore the excitatory action of GABA in epileptic neurons. Therefore, bumetanide is a potent anticonvulsive agent although it cannot prevent formation of the epileptogenic MF.Second using different electrophysiological and immunochemistry approaches we have demonstrated that the accumulation of chloride and the excitatory actions of GABA in mirror foci neurons are mediated by NKCC1 chloride importer and by a downregulation and internalisation of the chloride exporter KCC2.Finally using our MF model we have compared the actions of PB and DZP on neonatal seizures. We have revealed that PB but not DZP dramatically reduced initial propagating seizures and prevented formation of epileptogenic MF. We show that PB in contrast to DZP has a highly specific action on AMPA/kainate receptor mediated currents. This action underlies an important difference between the two AEDs as in contrast to PB, DZP aggravates early seizures reflecting the advantage of PB over DZP to prevent secondary epileptogenesis. Yet, after repeated seizures, once an epileptogenic MF has been formed, this difference is abolished because of the strong excitatory actions of GABA. Therefore, the history of seizures prior to GABA acting AED treatment determines its effects and rapid treatment of severe potentially epileptogenic neonatal seizures is recommended to prevent secondary epileptogenesis associated with KCC2 down regulation.

Le GABA et la glycine, principaux neurotransmetteurs inhibiteurs de la moelle épinière adulte, jouent un rôle clé dans la plasticité neuronale. Ils peuvent être excitateurs selon la concentration en chlorure du neurone cible. Celle-ci est principalement régulée par les co-transporteurs, KCC2, spécifique des neurones et NKCC1, ubiquitaire. Ces protéines font respectivement sortir et entrer les ions chlorure. Au cours du développement, l’expression de KCC2 augmente alors que celle de NKCC1 diminue, au moment où l’effet des potentiels post-synaptiques inhibiteurs sur le potentiel de membrane des neurones passe d’une dépolarisation à une hyperpolarisation. Une lésion médullaire à P0 bloque cette augmentation développementale. Cela est corrélé à une perte de fonction de KCC2, laquelle est restaurée après traitement avec un agoniste des récepteurs 5-HT2, indiquant que les voies descendantes issues du tronc cérébral, en particulier sérotoninergique, sont essentielles à la maturation du système inhibiteur. Une lésion chez l’adulte, induit une diminution de l’expression KCC2, en particulier à la surface des motoneurones et de ce fait, de la force de l’inhibition post-synaptique. Le BDNF est impliqué dans cette diminution mais son effet s’inverse 15 jours après la lésion, permettant le réacheminement de KCC2 à la surface des cellules. La phosphorylation des tyrosines et sérines serait impliquée dans l’adressage et la stabilisation de KCC2 dans la membrane plasmique alors que celle des thréonines jouerait un rôle dans son activation fonctionnelle. Ces résultats indiquent que KCC2 est une cible de choix pour restaurer l’inhibition neuronale dans la moelle épinière après traumatisme. / Le GABA et la glycine, principaux neurotransmetteurs inhibiteurs de la moelle épinière adulte, jouent un rôle clé dans la plasticité neuronale. Ils peuvent être excitateurs selon la concentration en chlorure du neurone cible. Celle-ci est principalement régulée par les co-transporteurs, KCC2, spécifique des neurones et NKCC1, ubiquitaire. Ces protéines font respectivement sortir et entrer les ions chlorure. Au cours du développement, l’expression de KCC2 augmente alors que celle de NKCC1 diminue, au moment où l’effet des potentiels post-synaptiques inhibiteurs sur le potentiel de membrane des neurones passe d’une dépolarisation à une hyperpolarisation. Une lésion médullaire à P0 bloque cette augmentation développementale. Cela est corrélé à une perte de fonction de KCC2, laquelle est restaurée après traitement avec un agoniste des récepteurs 5-HT2, indiquant que les voies descendantes issues du tronc cérébral, en particulier sérotoninergique, sont essentielles à la maturation du système inhibiteur. Une lésion chez l’adulte, induit une diminution de l’expression KCC2, en particulier à la surface des motoneurones et de ce fait, de la force de l’inhibition post-synaptique. Le BDNF est impliqué dans cette diminution mais son effet s’inverse 15 jours après la lésion, permettant le réacheminement de KCC2 à la surface des cellules. La phosphorylation des tyrosines et sérines serait impliquée dans l’adressage et la stabilisation de KCC2 dans la membrane plasmique alors que celle des thréonines jouerait un rôle dans son activation fonctionnelle. Ces résultats indiquent que KCC2 est une cible de choix pour restaurer l’inhibition neuronale dans la moelle épinière après traumatisme.

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Les travaux entrepris au cours de cette thèse ont eu pour but d'étudier la modulation de la transmission synaptique inhibitrice au niveau des réseaux moteurs spinaux, à la fois au cours du développement et après lésion de la moelle épinière. Le nouveau-né présente des activités motrices spontanées qui jouent un rôle important dans la maturation des muscles et des réseaux de neurones de la moelle épinière. Dans une première étude, nous avons identifié l'un des mécanismes impliqués dans la genèse de ces activités chez le rat nouveau-né in vitro. Nous avons démontré que l'activation des récepteurs GABAᴀ au niveau des terminales d'afférences primaires joue un rôle majeur dans le déclenchement et la propagation de ces activités spontanées. Dans une deuxième étude, nous avons testé la robustesse des dépolarisations de nature GABAergique enregistrées in vitro, c'est-à-dire leur dépendance vis-à-vis des paramètres du milieu de perfusion. Nous avons démontré que l'action dépolarisante des neurotransmetteurs GABA/glycine au niveau des motoneurones et celle du GABA au niveau des terminales d'afférences primaires ne sont pas dues à une fourniture énergétique insuffisante. La dernière étude a été consacrée à la modulation de la transmission synaptique inhibitrice après lésion de la moelle épinière. Nous avons montré que l'activation des récepteurs 5-HT2 (R5-HT2), particulièrement celle de l'isoforme 5-HT2ᴀ, renforce le poids synaptique inhibiteur via une hyperpolarisation du potentiel d'équilibre des ions chlorure (ECl) et une augmentation d'expression de KCC2 au niveau de la membrane des motoneurones. / The aim of this thesis was to explore the modulation of the inhibitory synaptic transmission within the spinal motor networks, both during development and after SCI. Spontaneous movements are an ubiquitous feature of fetal and infant behavior. They provide signals that are important for the development of muscles and the assembly of neuronal networks in the spinal cord. In a first study, we characterized one of the mechanisms underlying spontaneous motor behaviors in the in vitro spinal cord preparation isolated from neonatal rats. We demonstrated that the GABA is playing a key role in promoting spontaneous activity through primary afferent depolarizations which reach firing threshold. In the second part of my thesis, we tested the robustness of the in vitro GABAergic depolarizations and their dependence on the aCSF parameters. We demonstrated that during development the depolarizing actions of GABA/glycine on motoneurons and GABA on primary afferent terminals are not due to inadequate energy supply. In the last part of my thesis, we focused on the modulation of the inhibitory synaptic transmission following SCI. We demonstrated that activation of the 5-HT2 receptors, particularly the 5-HT2ᴀ subtype, strengthens inhibitory synaptic transmission to spinal motoneurons by hyperpolarizing the reversal potential of Cl- ions (ECl) and by increasing the cell-membrane expression of KCC2. This phenomenon reduces spasticity after SCI in rats. Upregulation of KCC2 function by targeting 5-HT2ᴀ receptors therefore opens new therapeutic strategies for the treatment of spasticity following SCI.

Les dysplasies corticales (FCD) sont une cause fréquente d’épilepsie lésionnelle requérant un traitement chirurgical, caractérisées par l’association de troubles de l’architecture corticale et la présence de cellules neuronales et/ou gliales anormales Les FCD restent parfois difficiles à identifier / localiser et la physiopathologie des activités épileptiques qu’elles produisent reste mal connue. L’objectif de ce travail est d’optimiser la localisation anatomique et fonctionnelle des FCD chez l’enfant et d’étudier leur épileptogénicité par une double approche, in vivo en imagerie de perfusion IRM-ASL (Arterial Spin Labeling), et in vitro par enregistrements de tissus humains post-opératoires sur matrice de micro électrodes. L’intérêt de l’étude de ces dysplasies chez l’enfant est majeure à un âge où la récurrence des crises n’a pas encore modifié le réseau … Tout d’abord, nous avons montré une hypoperfusion focale des dysplasies corticales focales de type II colocalisée à l’hypo métabolisme en 18FDG-PET scan et au défect histologique. Nous avons développé une méthode d’analyse statistique du signal ASL permettant l’intégration des données objectives de l’imagerie dans une approche multimodale des anomalies interictales associant ASL et IRM fonctionnelle-EEG. Ensuite, nous avons exploré in vitro des tranches de cortex humain dysplasique post-opératoire. La présence d’activités épileptiques interictales spontanées témoignait de la persistance des caractéristiques épileptogéniques des FCD, variables selon les sous types histologiques. L’étude de la signalisation GABAergique et de la régulation du chlore a montré que le co transporteur du chlore NKCC1 chargeait excessivement les neurones en chlore alors que son concurrent KCC2, extrudant normalement ces anions, était down-régulé. La dérégulation neuronale du chlore qui en résulte est à l’origine d’effets paradoxalement dépolarisants du GABA, rendant compte non pas d’une perte d’inhibition GABAergique mais de son implication active dans les processus épileptiques. Enfin, nous avons contribué à mettre en évidence le rôle des hémicanaux Pannexines1, et de la transmission purinergique dans l’initiation et la maintenance des activités ictales, ouvrant une nouvelle piste thérapeutique chez les patients présentant ces épilepsies pharmaco résistantes. / Focal cortical Dysplasias (FCD) are a frequent etiology of lesional epilepsy, requiring surgical treatment. They are defined by abnormalities of cortical architecture intermixed with the presence of abnormal neuronal or glial cells. Imaging FCD remains challenging, both to detect and map the lesion, and the pathophysiology of the epileptic discharges they produce is incompletely understood. The aim of this PhD is to improve in vivo FCD mapping in children with perfusion MRI, and to study in vitro their epileptogenicity with human postoperative cortical slices electrophysiological recordings on micro electrode arrays. First, we showed with ASL MRI (Arterial Spin Labeling) a focal hypoperfusion in type II FCD, colocalized with 18FDG-PET hypo metabolism and histological defects. We developed a statistical analysis of ASL under SPM integrated in a multimodal approach of FCD with EEG-fMRI and ASL-MRI. Second, we studied in vitro slices of human postoperative dysplastic cortex. We could record reliable spontaneous inter ictal discharges, specific of the histological subtype, showing that tissues retain epileptogenic features. We focused our study on GABAergic signaling and neuronal chloride regulation. We have identified an excessive chloride load in neurons by the co transporter NKCC1 whereas chloride extrusion was deficient because of KCC2 down regulation. The consequent chloride dysregulation resulted in paradoxical GABAergic depolarization, responsible for a loss of inhibitory processes but also a shift to excitatory effects of GABAergic signals. Third, we also contributed to a study on Pannexin hemichannels, revealing that Pannexin1 channels sustain initiation and maintenance of ictal activity though purinergic neurotransmission in human cortical slices, supporting new anti epileptic targets in human pharmaco resistant epilepsies.

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