L'encéphalopathie hépatique (HE) est un syndrome neuropsychiatrique complexe, une complication majeure de la maladie du foie. L'œdème cytotoxique est une complication grave de l'encéphalopathie hépatique, connu comme étant le résultat d'un gonflement des astrocytes. Les facteurs pathogéniques dérivés du sang tels que l'ammoniaque (NH4+) et le stress oxydatif (SO) sont connus pour être synergiquement impliqués. Les cellules endothéliales (CE) de la barrière hémato-encéphalique (BHE), régulant le passage vers le cerveau, sont les premières cellules à entrer en contact avec les molécules circulantes. L'effet de l'ammoniaque et du SO sur le transport et le métabolisme des CE n'a jamais été complètement exploré. Par conséquent, notre objectif était d'évaluer les effets de NH4+ et des espèces réactives de l'oxygène (ROS) sur les CE de la BHE en utilisant des systèmes de modèles in vivo et in vitro. Il a été démontré que le cotransporteur Na-K-2Cl (NKCC1) était impliqué dans la pathogenèse de l'œdème cérébral dans de nombreuses affections neurologiques. Le NKCC1 peut transporter NH4+ vers le cerveau et est régulé par les ROS. Par conséquent, l'expression de NKCC1 a été évaluée dans des CE primaires soumises à différentes concentrations de ROS et de NH4+ ainsi que dans des microvaisseaux cérébraux (MVC) isolés chez le rat BDL (bile-duct ligated), un modèle d'EH induit par une maladie hépatique chronique. Aucune régulation à la hausse de NKCC n'était présente chez les CE traitées ou les MVC. La glutamine synthétase (GS) est une enzyme qui joue un rôle compensatoire important dans la détoxification du NH4+ au cours de la maladie du foie. La GS est exprimée dans le muscle et le cerveau (astrocytes), mais n'a jamais été totalement explorée dans les CE de la BHE. L'expression et l'activité de la protéine GS ont été trouvées dans les CE de la BHE in vitro (CE primaires) et in vivo (MVC isolés de rats naïfs). Dans le modèle BDL, l'expression de GS dans les MVC n'était pas significativement différente des témoins (SHAM). Par ailleurs, nous avons traité des CE avec du milieu conditionné à partir de plasma de rats BDL et avons trouvé une diminution de l’expression de la protéine GS et de l'activité par rapport aux SHAM. De plus, les CE traitées avec NH4+ augmentaient en activité de GS tandis que les traitements avec SO avec et sans NH4+ diminuent l'activité de GS. Globalement, ces résultats démontrent pour la première fois que la GS est présente dans les CE, à la fois in vivo et in vitro. La GS est régulée à la baisse dans les CE traitées avec du plasma de BDL (mais pas dans les MVC de BDL). Il est intéressant de noter que le NH4+ stimule l'activité de GS dans les CE, alors que le SO inhibe l'activité de GS, ce qui justifie possiblement les résultats de nos études avec les milieux conditionnés. Nous supposons que le SO empêche la régulation à la hausse de GS de la BHE, en diminuant la capacité des CE à détoxifier l'ammoniaque et à limiter l'entrée d'ammoniaque dans le cerveau. Nous envisageons qu'une régulation à la hausse de GS dans les CE de la BHE pourrait devenir une nouvelle cible thérapeutique de l'EH. / Hepatic encephalopathy (HE) is a complex neuropsychiatric syndrome, which is a major complication of liver disease. Cytotoxic edema is a serious complication of HE, known to be the result of astrocyte swelling. Blood derived pathogenic factors such as ammonia (NH4+) and oxidative stress’ (OS) are known to be synergistically implicated. Endothelial cells (EC) of the blood brain barrier (BBB) are the first cells regulating passage into the brain and to contact blood-derived molecules. The effect of ammonia and oxidative stress on EC transport and metabolism has never been thoroughly explored. Therefore, our aim was to evaluate the effects of NH4+ and reactive oxygen species (ROS) on EC of the BBB using in vivo and in vitro models systems. The Na–K–2Cl cotransporter (NKCC1) has been demonstrated to be involved in the pathogenesis of brain edema in numerous neurological conditions. NKCC1 can transport NH4+ into the brain and is regulated by ROS. Therefore, the expression of NKCC1 was evaluated in primary EC submitted to different concentrations of ROS and NH4+ as well as in cerebral microvessels (CMV) isolated from the bile-duct ligated (BDL) rat, a model HE induced by chronic liver disease. No upregulation of NKCC1 was present in either the treated EC or CMV. Glutamine synthetase (GS) is an enzyme with an important compensatory role in NH4+ detoxification during liver disease. GS is expressed in muscle and brain (astrocytes) but has never been thoroughly explored in ECs of the BBB. GS protein expression and activity was found in EC of the BBB in vitro (primary EC) and in vivo (CMV isolated from naive rats). In the BDL model, GS expression in CMVs was not significantly different from SHAM-operated controls. In addition, we treated ECs with conditioned medium from plasma of BDL rats and found a decrease in GS protein and activity when compared to SHAM. Furthermore, EC treated with NH4+ increased GS activity while treatments with ROS with and without NH4+ decreased GS activity. Overall these results demonstrate for the first time that GS is present in EC both in vivo and in vitro. GS is downregulated in EC treated with BDL plasma (but not in BDL CMV). Interestingly, NH4+ stimulates GS activity in ECs, while ROS inhibits GS activity, possibly justifying the results found from the conditioned medium studies. We speculate that ROS prevents the upregulation of GS in the BBB, decreasing the capacity of the EC to detoxify ammonia and to limit ammonia entry into the brain. We foresee that upregulating GS in ECs of the BBB could become a new therapeutic target for HE.

L’œdème cérébral est une complication associée à l’encéphalopathie hépatique (EH) lors d’une insuffisance hépatique chronique (cirrhose du foie). Présentement, l’origine de sa pathogenèse, vasogénique (rupture de la barrière hémato-encéphalique (BHE)) ou cytotoxique (prise anormale d’ions), n’a pas encore été déterminée. Il a été démontré que le co-transporteur Na-K-Cl (NKCC1) du côté luminal des microvaisseaux sanguins cérébraux (CMV) joue un rôle dans le développement de l’œdème cérébral dans des modèles d’ischémie où la bumetanide, un inhibiteur de NKCC, atténue l’œdème cérébral. Deux modèles d’EH ont été utilisés pour cette étude i) la ligature de la voie biliaire (BDL) qui présente l’hyperammoniémie chronique, l’œdème cérébral et le stress oxydatif systémique ; ii) l’anastomose portocave (PCA) qui présente de l’hyperammoniémie chronique seulement. Les buts du projet étaient de: i) définir l’origine du développement de l’œdème chez les rats BDL en étudiant l’extravasation de macromolécules, les jonctions serrées et l’activation des métalloprotéinases matricielles de la BHE; ii) observer les effets de l’hyperammoniémie chronique indépendamment sur la BHE chez les rats PCA; iii) évaluer le rôle de l’hyperammoniémie et du stress oxydatif et iv) étudier le rôle du NKCC1 dans les CMV dans la pathogenèse de l’œdème cérébral. Les résultats du projet démontrent que l’œdème est d’origine cytotoxique chez les rats BDL et que l’intégrité de la BHE est conservée chez les rats PCA malgré l’hyperammoniémie. L’expression génique du NKCC1 est associée à l’œdème mais pas son expression protéique et sa phosphorylation. Enfin, l’étude démontre que l’hyperammoniémie et le stress oxydatif indépendant ne jouent pas un rôle dans la pathogenèse de l’œdème mais suggère qu’ils y aient un effet synergique. / Brain edema is a complication associated with hepatic encephalopathy (HE) due to chronic liver failure (cirrhosis). It is unclear whether brain edema is of vasogenic (blood brain barrier (BBB) breakdown) or cytotoxic (abnormal cellular uptake of ions) origin. It has been demonstrated that the Na-K-Cl cotransporter (NKCC1) located on the luminal side of the cerebral microvessels (CMV) is implicated in the pathogenesis of brain edema in animal models of ischemia and that the administration of bumetanide, an inhibitor of NKCC, attenuates brain water increase. Two distinct animal models of chronic liver failure and HE are used in the present study; 1) bile duct ligation (BDL) where brain edema, chronic hyperammonemia and systemic oxidative stress are observed; 2) portacaval anastomosis (PCA) where only chronic hyperammonemia is observed. The aims of the study were to: i) determine the origin of brain edema in BDL rats measuring brain extravasation, tight junctions expression and matrix metalloproteinase activation; ii) observe the effects of chronic hyperammonemia on the BBB in PCA rats; iii) study the role of oxidative stress and hyperammonemia; iv) evaluate the role of NKCC in CMV in the pathogenesis of brain edema. The results of the study determined that brain edema in BDL rats is of cytotoxic origin and chronic hyperammonemia independently has no effect on the BBB. An increase of NKCC1 mRNA is associated with brain edema but protein expression and phosphorylation are not. Furthermore, hyperammonemia and oxidative stress independently are not implicated in the development of brain edema however a synergistic effect between the two pathogenic factors in BDL rats remains a possibility.

L’œdème cérébral est une complication associée à l’encéphalopathie hépatique (EH) lors d’une insuffisance hépatique chronique (cirrhose du foie). Présentement, l’origine de sa pathogenèse, vasogénique (rupture de la barrière hémato-encéphalique (BHE)) ou cytotoxique (prise anormale d’ions), n’a pas encore été déterminée. Il a été démontré que le co-transporteur Na-K-Cl (NKCC1) du côté luminal des microvaisseaux sanguins cérébraux (CMV) joue un rôle dans le développement de l’œdème cérébral dans des modèles d’ischémie où la bumetanide, un inhibiteur de NKCC, atténue l’œdème cérébral. Deux modèles d’EH ont été utilisés pour cette étude i) la ligature de la voie biliaire (BDL) qui présente l’hyperammoniémie chronique, l’œdème cérébral et le stress oxydatif systémique ; ii) l’anastomose portocave (PCA) qui présente de l’hyperammoniémie chronique seulement. Les buts du projet étaient de: i) définir l’origine du développement de l’œdème chez les rats BDL en étudiant l’extravasation de macromolécules, les jonctions serrées et l’activation des métalloprotéinases matricielles de la BHE; ii) observer les effets de l’hyperammoniémie chronique indépendamment sur la BHE chez les rats PCA; iii) évaluer le rôle de l’hyperammoniémie et du stress oxydatif et iv) étudier le rôle du NKCC1 dans les CMV dans la pathogenèse de l’œdème cérébral. Les résultats du projet démontrent que l’œdème est d’origine cytotoxique chez les rats BDL et que l’intégrité de la BHE est conservée chez les rats PCA malgré l’hyperammoniémie. L’expression génique du NKCC1 est associée à l’œdème mais pas son expression protéique et sa phosphorylation. Enfin, l’étude démontre que l’hyperammoniémie et le stress oxydatif indépendant ne jouent pas un rôle dans la pathogenèse de l’œdème mais suggère qu’ils y aient un effet synergique. / Brain edema is a complication associated with hepatic encephalopathy (HE) due to chronic liver failure (cirrhosis). It is unclear whether brain edema is of vasogenic (blood brain barrier (BBB) breakdown) or cytotoxic (abnormal cellular uptake of ions) origin. It has been demonstrated that the Na-K-Cl cotransporter (NKCC1) located on the luminal side of the cerebral microvessels (CMV) is implicated in the pathogenesis of brain edema in animal models of ischemia and that the administration of bumetanide, an inhibitor of NKCC, attenuates brain water increase. Two distinct animal models of chronic liver failure and HE are used in the present study; 1) bile duct ligation (BDL) where brain edema, chronic hyperammonemia and systemic oxidative stress are observed; 2) portacaval anastomosis (PCA) where only chronic hyperammonemia is observed. The aims of the study were to: i) determine the origin of brain edema in BDL rats measuring brain extravasation, tight junctions expression and matrix metalloproteinase activation; ii) observe the effects of chronic hyperammonemia on the BBB in PCA rats; iii) study the role of oxidative stress and hyperammonemia; iv) evaluate the role of NKCC in CMV in the pathogenesis of brain edema. The results of the study determined that brain edema in BDL rats is of cytotoxic origin and chronic hyperammonemia independently has no effect on the BBB. An increase of NKCC1 mRNA is associated with brain edema but protein expression and phosphorylation are not. Furthermore, hyperammonemia and oxidative stress independently are not implicated in the development of brain edema however a synergistic effect between the two pathogenic factors in BDL rats remains a possibility.