L'activité des NO-synthases (NOS), unique source de monoxyde d'azote (NO) chez les mammifères, s'inscrit dans des processus de signalisation (régulation de la pression artérielle, communication neuronale) et de cytotoxicité (réponse immunitaire non spécifique). Pour rendre compte de cette dualité physiologique, une partition de leur cycle catalytique a été proposée : une voie produirait du NO (signalisation), et une autre conduirait à la formation de peroxynitrite (ONOOH, PN), molécule hautement oxydante aujourd'hui associée à de nombreuses pathologies. Cependant le PN doit être activé in vivo pour exercer sa toxicité, réaction qui peut être catalysée par des porphyrines à fer et donc potentiellement par les NOSs. Dans ce contexte, l'objectif de cette thèse était d'étudier le devenir du PN synthétisé par les NOSs et d'analyser les paramètres favorisant sa production afin d'expliquer le rôle cytotoxique de l'isoforme inductible et la spécificité physiologique de chaque isoforme. Tout d'abord, nous avons étudié l'interaction des NOSs avec PN. Nous avons mis en évidence par une analyse cinétique que quelles soient les conditions expérimentales, le PN synthétisé au site actif de l'enzyme n'était pas libéré mais pris en charge par l'hème pour former d'autres oxydes d'azote. Nous avons proposé un mécanisme en plusieurs étapes pour cette réaction, qui mène à l'isomérisation ou à l'activation du PN suivant que le pH est alcalin ou acide. Dans le cas d'une activation du PN, nous avons observé un intermédiaire pour NOS avec un maximum d'absorption autour de 443 nm qui pourrait correspondre à un complexe oxoferryl, FeIV=O, et qui serait formé par rupture homolytique de la liaison O-O du complexe NOS-PN [FeIII-OONO] avec libération concomitante d'un radical •NO2. Des études comparatives de réactivité du système {NOS + PN} pour les différentes isoformes ont montré que la paire {FeIV=O...•NO2} conduit soit à l'augmentation des processus d'oxydation à un électron et de nitration de composés extérieurs, soit à la détoxication partielle ou totale du PN. La balance entre ces deux voies (toxicité versus détoxication) semble dépendre de la capacité des différentes isoformes à libérer ou à piéger les radicaux •NO2. Ainsi la diversité de réaction entre NOS et PN (génération ou extinction d'un stress oxydant) pourrait rendre compte de la spécificité physiologique des différentes isoformes. Ensuite, nous nous sommes intéressés à caractériser les paramètres physico-chimiques qui peuvent contrôler la production de PN par les NOSs ou l'oxydation du complexe FeII-NO. Dans un premier temps nous avons développé une nouvelle méthodologie de spectroélectrochimie, qui devrait permettre la mesure fiable du potentiel redox du couple FeII-NO/FeIII-NO. Nous avons mis en évidence des effets distincts du substrat L-arginine et du co-facteur H4B des NOSs sur la stabilisation de la structure en dimère de la protéine. Nous avons également démontré que l'utilisation de l'analogue H2B du co-facteur naturel ne peut être utilisé en tant que mime pour des expériences de réactivité puisqu'il n'assure pas cette structuration. Dans un deuxième temps nous avons étudié les propriétés structurales et électroniques des complexes FeII-NO par spectroscopie RPE classique et à impulsions. Nous avons mis en évidence l'existence de trois géométries pour les complexes FeII-NO, et avons pu établir une relation d'équilibre thermique entre deux d'entre elles, intrinsèquement contrôlée par l'environnement de l'hème (présence et nature du substrat, type d'isoforme). Ces résultats indiquent que les études structure/fonction des complexes FeII-NO ne doivent pas être menées à basse température pour représenter la réalité physiologique des NOSs. En conclusion, ces travaux représentent la première étude de l'interaction entre le PN et les NOSs et mettent en évidence leur capacité à générer, amplifier ou éteindre un stress oxydant cellulaire. Ils ouvrent des perspectives nouvelles et originales pour la compréhension des paramètres induisant ce stress in vivo, ou contrôlant la spécificité biologique des différentes isoformes. 5

Les NO-synthases sont des flavohémoprotéines responsables de la production de NO• chez les mammifères (mNOS). Elles se composent d’un domaine réductase, qui lie les cofacteurs FMN et FAD et le co-substrat NADPH, et d’un domaine oxygénase qui lie l’hème, le substrat L-arginine et le cofacteur redox essentiel tétrahydrobioptérine H4B. Ces quinze dernières années, plusieurs NOS d’origine bactérienne (bacNOS) ont été caractérisées et il a été montré qu’elles étaient semblables au domaine oxygénase de leurs homologues mammifères. Il existe cependant des différences significatives entre mNOS et bacNOS, la plus importante étant l’absence de domaine réductase chez les NOS d’origine bactérienne. De plus, le(s) mécanisme(s) catalytique(s) de ces dernières ainsi que leur(s) fonction(s) in vivo restent actuellement à déterminer. Plusieurs études publiées montrent que la substitution Val/Ile à proximité du site actif, conservée entre mNOS et bacNOS, est partiellement responsable des différences observées au niveau catalytique entre ces deux groupes. Dans le cadre de cette thèse, j’ai utilisé les spectroscopies d’absorption UV-visible et RPE, ainsi que des techniques de cinétiques rapides comme le stopped-flow et le freeze-quench, pour caractériser les deux mutants complémentaires bsNOS I224V et iNOS V346I afin de mieux comprendre l’influence de cette mutation. J’ai ainsi montré qu’il existait des différences fondamentales entre bacNOS et mNOS qui ne sont pas liées à la substitution Val/Ile et que ces deux familles d’enzymes suivent probablement des mécanismes catalytiques différents pour l’étape d’oxydation du NOHA. Ces résultats sont confirmés par l’étude de la NOS thermostable issue de Geobacillus stearothermophilus. Lorsqu’on s’intéresse au fonctionnement in vivo des bacNOS, se pose également la question de la nature du cofacteur redox puisque de nombreuses bactéries possédant une NOS n’ont pas la machinerie nécessaire à la synthèse de H4B ; c’est par exemple le cas de Deinococcus radiodurans pour qui l’utilisation du tétrahydrofolate H4F a été proposée. J’ai donc étudié et caractérisé deiNOS de manière approfondie en présence de différents cofacteurs afin de mieux comprendre leurs rôles redox et structural. Ceci a notamment permis de proposer un mécanisme catalytique légèrement différent de celui suivi par bsNOS ce qui suggère que ces enzymes pourraient avoir différentes fonctions in vivo. Enfin, la première caractérisation in vitro d’une NOS de plante, issue de l’algue verte unicellulaire Ostreococcus tauri est présentée dans ce manuscrit. Les résultats suggèrent que celle-ci aurait effectivement une activité NO-synthase in vivo. / NO-synthases are flavohemoproteins responsible for NO• production in mammals (mNOS). They are comprised of a reductase domain, that binds FMN, FAD and NADPH, and an oxygenase domain, that binds heme, the substrate L-arginine and the essential redox active tetrahydrobiopterin cofactor H4B. In the last 15 years, several bacterial NOS (bacNOS) have been characterized and shown to resemble the oxygenase domain of their mammalian counterpart. However bacNOS exhibit significant differences from mNOS, the most striking one being the lack of a reductase domain, and their catalytic mechanism(s) and in vivo function(s) are currently poorly understood. Previously published studies suggest that a conserved Val to Ile substitution near the active site is at least partially responsible for the differences in catalysis observed between mNOS and bacNOS. During my PhD I characterized the mutants on this particular position, bsNOS I224V and iNOS V346I, using UV-visible and EPR spectroscopies as well as rapid-kinetic technics such as stopped-flow spectrophotometry and rapid-freeze quench, to better understand the influence of this substitution. This showed that mammalian and bacterial enzymes are fundamentally different and probably follow different mechanisms for NOHA oxidation. Results from studying the thermostable NOS from Geobacillus stearothermophilus further confirm these observations. Another important issue regarding bacNOS functioning in vivo concerns the nature of the redox active cofactor since many NOS-containing bacteria do not have the machinery for H4B biosynthesis; this is for instance the case of Deinococcus radiodurans for which the use of tetrahydrofolate H4F has been proposed. I therefore performed an extensive characterization of deiNOS in the presence of various cofactors to better understand their redox and structural roles. This allowed proposing a slightly different mechanism for deiNOS, compared to bsNOS, suggesting different function(s) in vivo. Finally, the first in vitro characterization of a plant NOS from the unicellular green alga Ostreococcus tauri is reported in this manuscript. The results suggest that this NOS-like protein is indeed a genuine NO-synthase.

Les mécanismes à l'origine de la Bronchopneumopathie Chronique Obstructive (BPCO) et de ses complications cardiovasculaires restent partiellement connus. Le NO est produit par les NO synthases en quantité importante dans le poumon des sujets emphysémateux, mais son rôle dans la maladie n'est pas connu. Une dysfonction endothéliale précoce liée à une diminution de la disponibilité en NO au niveau vasculaire a aussi été observée chez les patients BPCO. Dans un premier travail, nous avons montré que iNOS et eNOS étaient induites de manière diffuse dans le poumon de souris développant un emphysème après une instillation d'élastase. Le recours à des souris iNOS-/- et eNOS -/-, ainsi qu'à un inhibiteur pharmacologique d'iNOS (1400W) ont permis de montrer que l'induction d'iNOS dans le poumon était responsable d'une accumulation de protéines nitratées dans les pneumocytes de type 2 et d'une diminution de l'oxydation protéique. Cependant ni iNOS ni eNOS n'étaient nécessaires au développement de l'emphysème induit par l'élastase. Dans un deuxième travail, nous avons exploré l'effet de la polyglobulie, une complication de la BPCO hypoxique, sur la fonction endothéliale chez 15 patients polyglobuliques et 13 normoglobuliques atteints de BPCO de sévérité égale. La polyglobulie était associée de base à une viscosité sanguine plus élevée et un diamètre artérielbrachial plus important mais avec des forces de cisaillement calculées similaires. L'étude de la vasodilatation en réponse à l'hyperhémie et celle du flux sanguin de l'avant bras mesuré par plethysmographie d'occlusion veineuse en réponse à une perfusion d'acétylcholine (ACh), et de N-monomethyl-L-arginine (L-NMMA) ont permis de montrer que les artères systémiques despatients polyglobuliques ajustent leur diamètre aux forces de cisaillement aigues et chroniques de manière adaptée grâce à une libération adaptée de NO. De plus, nos résultats suggèrent que la polyglobulie modérée n'a pas d'effet délétère sur la fonctionvasculaire chez les patients BPCO. / The mechanisms that lead to COPD and cause its cardiovascular complications are partially known. NO is produced at high levels by NO-synthases in the human lung with emphysema, but its role in this disease is not clear. Interestingly, COPD patients have an endothelial dysfunction linked to the decrease of NO levels in peripheral blood vessels. In a first study, we demonstrated that iNOS and eNOS were diffusely upregulated in the lung of mice with emphysema after elastase instillation. By using iNOS-/- and eNOS -/- mice and a drug-based inhibitor of iNOS (1400W), we demonstrated that the induction of iNOS in the lung was responsible of an increase of protein nitration in alveolar type 2 cells and of an alleviated oxidation of proteins. However, neither iNOS nor eNOS were required for the development of elastase-induced inflammation and emphysema. In a second study, we evaluated the effectsof polycythemia, a common complication of hypoxic lung diseases, on the endothelial function in 15 polycythemic and 13 normocythemic patients with a COPD of equal severity. Polycythemia was associated with higher blood viscosity and a larger diameter of the brachial artery but with a similar calculated wall shear stress (WSS). We studied the flow-mediated brachial arteryvasodilation and the forearm blood-flow responses to endothelium- and non-endothelium-dependent N-monomethyl-L-arginine (LNMMA) infusion by plethysmography. We demonstrated that systemic arteries in polycythemic patients adjust appropriately to chronic or acute WSS elevations by an appropriate basal and stimulated NO release. Overall, our results suggest that moderate polycythemia has no adverse effect on vascular function in COPD.

Les mécanismes à l'origine de la Bronchopneumopathie Chronique Obstructive (BPCO) et de ses complications cardiovasculaires restent partiellement connus. Le NO est produit par les NO synthases en quantité importante dans le poumon des sujets emphysémateux, mais son rôle dans la maladie n'est pas connu. Une dysfonction endothéliale précoce liée à une diminution de la disponibilité en NO au niveau vasculaire a aussi été observée chez les patients BPCO. Dans un premier travail, nous avons montré que iNOS et eNOS étaient induites de manière diffuse dans le poumon de souris développant un emphysème après une instillation d'élastase. Le recours à des souris iNOS-/- et eNOS -/-, ainsi qu'à un inhibiteur pharmacologique d'iNOS (1400W) ont permis de montrer que l'induction d'iNOS dans le poumon était responsable d'une accumulation de protéines nitratées dans les pneumocytes de type 2 et d'une diminution de l'oxydation protéique. Cependant ni iNOS ni eNOS n'étaient nécessaires au développement de l'emphysème induit par l'élastase. Dans un deuxième travail, nous avons exploré l'effet de la polyglobulie, une complication de la BPCO hypoxique, sur la fonction endothéliale chez 15 patients polyglobuliques et 13 normoglobuliques atteints de BPCO de sévérité égale. La polyglobulie était associée de base à une viscosité sanguine plus élevée et un diamètre artérielbrachial plus important mais avec des forces de cisaillement calculées similaires. L'étude de la vasodilatation en réponse à l'hyperhémie et celle du flux sanguin de l'avant bras mesuré par plethysmographie d'occlusion veineuse en réponse à une perfusion d'acétylcholine (ACh), et de N-monomethyl-L-arginine (L-NMMA) ont permis de montrer que les artères systémiques despatients polyglobuliques ajustent leur diamètre aux forces de cisaillement aigues et chroniques de manière adaptée grâce à une libération adaptée de NO. De plus, nos résultats suggèrent que la polyglobulie modérée n'a pas d'effet délétère sur la fonctionvasculaire chez les patients BPCO.

Protein nitration is considered as a marker of reactive nitrogen species formation. Heme oxygenases (HOs) are important for the defence against oxidative stress. We evaluated the involvement of the neuronal (nNOS), the endothelial (eNOS), and the inducible (iNOS) in nitrotyrosine formation and localitzation, and both the expression and funcional significance (HO inhibition and contractility studies) of HOs in sepsis-induced muscle contractile dysfunction. Sepsis was elicited by injecting rats and transgenic mice deficient in either nNOS, eNOS, or iNOS isoforms with E.Coli lipolysaccharide (LPS). Nitrotyrosine formation and HO expressions were assessed by immunoblotting. Oxidative stress was assessed measuring protein oxidation, lipid peroxidation, and muscle glutathione. We conclude that protein tyrosine nitration occurs in normal muscles, and sepsis-mediated increase in nitrotyrosine formation is limited to the mitochondria and membrane muscle fractions. The iNOS isoform is mostly involved in nitrotyrosine formation. HOs protect normal and septic muscles from the deleterious effects of oxidants. / En un model de sepsi de disfunció diafragmàtica, s´ha avaluat el paper de les sintetases de l'òxid nítric (NOS) en la formació i localitzacio de 3-nitrotirosina, i l´expressió i significat biològic de les hemo oxigenases (HOs) (inhibidor de les HOs i estudis de contractilitat) davant l' estrès oxidatiu. La sepsi s'induí mitjançant injecció de 20 mg/kg del lipolisacàrid (LPS) d´Escherichia Coli a rates, i a ratolins deficients en les NOS induïble (iNOS), neuronal (nNOS) i endotelial (eNOS). Les proteïnes nitrificades i les HOs es van detectar amb anticossos específics. L' estrès oxidatiu s' avaluà mitjançant l' oxidació proteica, la peroxidació lipídica i el glutation muscular. Concloem que hi han proteïnes nitrificades en el múscul normal i aquestes s'incrementen durant la sepsi en les fraccions mitocondrial i membranar. L'isoforma iNOS és majorment responsable de la formació de nitrotirosina. Les HOs protegirien el múscul normal i sèptic dels efectes deleteris dels oxidants.