Thèse de doctorat : Biologie moléculaire : Paris 12 : 2007. / Thèse uniquement consultable au sein de l'Université Paris 12 (Intranet). Titre provenant de l'écran-titre. Bibliogr. : 300 réf.

Thèse (M.Sc.)--Université Laval, 2004. / Bibliogr.: f. [119]-131. Publié aussi en version électronique.

L'épuration mucociliaire est la première ligne de défense de l'appareil respiratoire. L'altération de l'épuration mucociliaire se traduit par une stagnation et/ou une accumulation de mucus, conduisant potentiellement à des obstructions plus ou moins partielles et à des infections chroniques des voies aériennes. On compte deux grands types d'altération de l'épuration mucociliaire. Le premier est lié aux caractéristiques du mucus, comme dans le cas de la mucoviscidose. Le deuxième est lié à des anomalies de l'ultrastructure du cil et /ou de son battement regroupées sous le terme de "ciliopathies"qui peuvent être soit innées soit acquises.Ce travail, qui s'inscrit dans le cadre clinique de la problématique des ciliopathies respiratoires et de leur prise en charge, a pour objectif de mieux caractériser, à partir des outils de la Biomécanique, les mécanismes du battement ciliaire (incluant une mesure de l'efficacité globale du battement des cils) et à transférer ces connaissances au profit de la clinique.Pour cela une méthodologie de caractérisation systématique de la mécanique ciliaire à partir de prélèvements biologiques issus de patients observés par vidéo-microscopie à haute vitesse a été développée parallèlement au développement d'un modèle numérique intégrant le couplage entre battement ciliaire et transport de fluide. Cette association entre expériences et modèle numérique a permis de proposer un nouvel index utilisable par les cliniciens pour caractériser l'efficacité du battement ciliaire. Cet index présente l'avantage de ne pas exiger de modification de la pratique clinique concernant la collecte de données biologiques / Mucociliary clearance is the first line of defense of the respiratory tract. Alteration of this clearance leads to a stagnation and/or accumulation of mucus, potentially resulting in more or less partially obstructions and in chronic infections of the airways. There are two main types of mucociliary clearance alterations. The first one is linked to the mucus characteristics, as in cystic fibrosis. The second one is connected to cilium ultrastructure abnormalities and/or ciliary beating defects encompassed by the term of "ciliopathies" which may be primary or acquired.This work, which takes place in the clinical issue of respiratory ciliopathies and their care, aims to better characterize, through biomechanics tools, the mechanisms of ciliary beating (including a measurement of the global efficiency of cilia) and to transfer these knowledges in favor of the clinical management.A methodology of systematic characterization of the ciliary mechanics, from biological samples derived from patients observed through high-speed video-microscopy analysis, has been developed as the same time as the development of a numerical model incorporating the coupling between ciliary beating and fluid motion. This association between experiments and numerical model allowed to propose a new index usable by the clinicians to characterize the ciliary beating efficiency. This index has the advantage of not requiring a modification of the clinical practice of biological data collection

La Néphronophtise (NPH) est une maladie autosomique récessive, qui se caractérise par des lésions tubulo-interstitielles conduisant à une insuffisance rénale terminale avant l'âge adulte. A ce jour des mutations dans 20 gènes (NPHP1-20) ont été identifiées comme responsables de la maladie. Les produits de ces gènes, les néphrocystines ou NPHP, se localisent et ont un rôle au cil primaire, définissant ainsi la NPH comme une ciliopathie. Nous avons identifié des mutations dans un nouveau gène candidat. Ces mutations ont été détectées dans six familles indépendantes, présentant une NPH tardive avec une fibrose rénale importante. Ce gène code MAPKBP1, une protéine très peu étudiée, ayant été décrite comme une protéine d'échafaudage de la voie JNK. MAPKBP1 interagit également avec WDR62, le produit d'un paralogue qui est le second gène le plus fréquemment muté dans les microcéphalies primaire récessives. La protéine WDR62 localise aux pôles du fuseau mitotiques (MSP) d'où elle régule l'orientation de l'axe des mitoses via la voie JNK dans le système nerveux central. Au cours de mon travail de thèse au sein du laboratoire des Maladies Rénales Héréditaires de l'Institut Imagine, j'ai étudié les fonctions cellulaires de la protéine MAPKBP1. J'ai ainsi pu mettre en évidence dans les lignées cellulaires ainsi que dans les tissus, que la protéine MAPKBP1 n'est pas présente au cil primaire et que les fibroblastes de patients ne présentent pas de défauts de ciliogenèse, indiquant que MAPKBP1 pourrait être le représentant d'une nouvelle famille de NPHP ne possédant pas de fonctions ciliaires. De manière intéressante, j'ai pu observer que MAPKBP1 est recruté aux MSP au cours des phases précoces de la mitose. Ainsi, en démontrant que certaines des mutations retrouvées chez les patients affectent le recrutement de MAPKBP1 aux MSP et perturbent également l'interaction de MAPKBP1 avec JNK et/ou WDR62, j'ai pu valider l'effet pathogène de ces mutations. De plus, j'ai montré des défauts dans la voie de réponse aux dommages à l'ADN dans les différents fibroblastes de patients comme récemment observé dans de nombreux modèles NPHP. / Nephronophthisis (NPH) is an autosomal recessive disease, characterised by tubulointerstitial lesions leading to an end-stage renal disease before adulthood. Causative mutations in 20 genes (NPHP1-20) have been identified so far. The products of those genes, the nephrocystins or NPHP, localise and function at the primary cilium, defining NPH as a ciliopathy. We identified mutations in a new candidate gene. Those mutations have been detected in six independent families, displaying late onset NPH with massive fibrosis. This gene encode MAPKBP1, a poorly studied protein that has been described as JNK pathway scaffold protein. MAPKBP1 also interacts with WDR62, the product of a paralogue which is the second most frequently mutated gene in recessive primary microcephalies. The protein WDR62 localises at the mitotic spindle poles (MSP) from where it regulates the orientation of the axis of division, through activation of JNK pathway in the central nervous system. During my work in the laboratory of Hereditary Kidney Diseases in the Imagine Institute, I studied MAPKBP1 cellular functions. I could show that in the various cell lines that have been tested, as well as in human kidney tissues, MAPKBP1 is not present at the primary cilia. And I also could show in patient fibroblasts that there is no ciliary defects, indicating that MAPKBP1 could be a novel NPHP protein that do not display ciliary functions. Interestingly, I could observe that MAPKBP1 is recruited at the MSPs during mitosis. Demonstrating that some patient mutations affect the recruitment of MAPKBP1 at the MSPs and also disturb interaction with JNK and/or WDR62, I could validate the pathogenic effect of those mutations. In addition, I could show defects in the DNA damage response in patient fibroblasts, as observed recently in various NPHP models.

Les cils sont des organites très conservés au cours de l’évolution des eucaryotes et présents à la surface de presque tous les types cellulaires. Ils sont constitués d’une structure microtubulaire, l’axonème, entourée d’une membrane en continuité avec la membrane plasmique. Ils sont nucléés par un corps basal, centriole ancré à la surface cellulaire. Grâce aux nombreux récepteurs qu’ils concentrent à leur membrane, tous les cils sont des senseurs de leur environnement. Ils peuvent aussi être motiles et assurer, par leur battement coordonné, le déplacement relatif de la cellule et du fluide environnant. Tandis que cil et structure centriolaire, hérités du premier eucaryote, ont été perdus par certains champignons et par les plantes supérieures, certains gènes codant des protéines ciliaires et centriolaires sont pourtant retrouvés dans le génome de ces espèces. Cette conservation de protéines sans l’organite suggère soit que ces protéines interviennent dans un même processus moléculaire utilisé dans plusieurs organites, soit qu’elles jouent des rôles dans des processus moléculaires distincts via leur interaction avec différents types de partenaires.J’ai choisi d’étudier l’une de ces protéines ciliaires et centriolaires, Bug22p, hautement conservée en séquence protéique entre l'homme et la paramécie, mais également présente chez les plantes supérieures. J’ai mené cette étude principalement sur la paramécie, système modèle pour la biogénèse des corps basaux et des cils, mais aussi sur des cellules de mammifère et de végétaux supérieurs. Si Bug22p est impliquée dans la détermination du battement ciliaire chez la paramécie, elle se localise également dans des cils immotiles de cellules de mammifère suggérant que son activité ciliaire n’est pas réduite à cette seule fonction. Des expériences d’inactivation génique suggèrent par ailleurs un lien entre l’activité de Bug22p et la polyglycylation. Sa surexpression dans les cellules de mammifère en culture entraîne l’apparition d’extensions cellulaires et une augmentation des réseaux de tubulines acétylées probablement associées à une stabilisation des microtubules. L'ensemble de mes résultats suggère donc un rôle de Bug22p dans la régulation de modifications post-traductionnelles. En plus d’être présente dans les structures ciliaires, Bug22p se localise aussi bien dans les noyaux de la paramécie que dans ceux des cellules humaines et des plantes supérieures Arabidopsis et Nicotiana. Ces observations ouvrent un nouveau champ d’études. En effet, si l’on sait que les tubulines ciliaires sont soumises à différentes modifications post-traductionnelles telles que polyglycylation ou acétylation, ce type de modifications touchent également des protéines nucléaires régulant ainsi le trafic de protéines nucléaires ou l’expression génique. Nous pouvons donc avancer l’hypothèse selon laquelle Bug22p agirait sur la régulation de ces modifications dans le cil et dans le noyau. Il serait donc intéressant de caractériser les modifications post-traductionnelles chez les plantes supérieures afin de vérifier une possible implication de Bug22p dans leur régulation et donc comprendre les raisons de sa conservation chez les végétaux. / Cilia, organelles that have been conserved throughout the evolution of eukaryotes, are found at the surface of most cell types. They are composed of a microtubular structure, the axoneme, surrounded by a membrane continuous to the plasma membrane. Cilia are nucleated by basal body, which is a centriole anchored to the cell surface. Cilia are environmental sensors concentrated in the ciliary membrane. Cilia can be motile and ensure the relative movement of the cell with respect to the surrounding fluid by their coordinated beating. While cilia and centriolar structures inherited from the first eukaryote have been lost by certain fungi and higher plants, certain genes encoding ciliary and centriolar proteins are found in the genomes of organisms lacking these structures. The conservation of these proteins without organelle suggests that these proteins are involved in the same molecular process into different organelles or proteins are involved into different processes through some interactions with different partners.I chose to study the ciliary and centriolar protein, Bug22p, highly conserved between human and Paramecium proteins sequences, and also present in higher plants. My work addressed this study primarily on Paramecium, a model system for biogenesis of basal bodies and cilia, and I also pursued investigation of mammalian cells and higher plants. I was able to show that Bug22p is necessary for efficient Paramecium ciliary beating, but I also localized in the immotile cilia of mammalian cells suggesting that Bug22p is not only restricted to the motile ciliary function. By knockdown experiments in Paramecium, I obtained evidence that Bug22p is involved in polyglycylation. Bug22p overexpression in mammalian cells led to the appearance of cell extensions and increased acetylated tubulin networks consistent with microtubule stabilization. My results suggest that Bug22p may regulate post-translational proteins modifications.Bug22p is also localized in the nuclei of Paramecium, human and higher plants such as Arabidopsis and Nicotiana. These observations open a new field of study. The axoneme microtubules are highly modified by post-translational modifications such as acetylation and polyglycylation; we know that in the nucleus, theses modifications are involved in the control of nuclear trafficking of some proteins and the regulation of gene expression. We can therefore speculate that Bug22p acts on the regulation of these changes in the cilium and in the nucleus. Finally, it would be interesting to characterize the post-translational modifications in higher plants to verify the possible involvement of Bug22p in their regulation and thus understand the meaning of its conservation in higher plants lacking cilia.

Thèse (Ph. D.)--Université Laval, 2008. / Bibliogr.: f. 177-193. Publié aussi en version électronique dans la Collection Mémoires et thèses électroniques.

La mégaline est un récepteur endocytique multiligand essentiellement connu comme récepteur clé pour la réabsorption protéique rénale. Au cours du développement embryonnaire murin la mégaline a été impliquée dans le développement du prosencéphale et de l’œil mais la mortalité périnatale des souris Meg-/- empêche sone étude à des stades ultérieurs. Pour analyser le rôle de la mégaline dans le système visuel nous avons généré dans le laboratoire des souris conditionnelles FoxG1-Cre MegL/L.L’analyse phénotypique des souris mutantes montre que l’absence de la mégaline dans le neuroépithélium antérieur conduit à une augmentation anormale et progressive de la taille de l’œil accompagnée par un amincissement de la rétine et la diminution, entre autres, des cellules ganglionnaires. Ces observations immunomorphologiques suggèrent que les souris mutantes présentent des signes de myopie forte et sont confirmées par l’analyse ophtalmologique. Les analyses biochimiques des souris mutantes montrent que l’absence de mégaline entraine des modification dans la structure et la fonction du corps ciliaire, à l’origine de cet élongation excessive du globe oculaire. Les résultats obtenus montent que les souris Foxg1-Cre MegL/L sont le premier modèle génétique murin qui reproduit les caractéristiques de la myopie forte. L’élucidation des mécanismes physiopathologiques sous-jacents au développement de la myopie est un préalable indispensable à l’élaboration d’en éventuel traitement préventif, espoir pour les 0,5% à 2% de la population touchés par la cécité liée aux complications de la myopie forte. / Megalin is a large multiligand endocytic receptor essentially known as the key receptor for protein reabsorption in the renal proximal tubule. Murin megalin appears to be essential for early forebrain and eye development but the perinatal lethality of Meg-/- mice precludes further analysis. To study the implication of megalin in the formation of the eye we generated (in the laboratory ) FoxG1-Cre MegL/L mice lacking megalin specifically in the anterior neuroepithelium.The phenotypic analysis of these mice show that they suffer from an excessive and progressive eye growth associated with retinal thinning and a strong decrease of some retinal cell types including the ganglion cells. The immunomorphological studies suggest that the mutant mice are highly myopic which is confirmed by the ophtalmological analysis data. The biochemical analysis of these mutant mice shows that the absence of megalin causes structural and functional modifications in the ciliary epithelium, leading to the excessive elongation of the eyeball. These results show that the FoxG1-Cre MegL/L mice are the first murine genetic model recapitulating the characteristics of high myopia. The elucidation of underlying physiopathological mechanisms of high myopia development is essential for the elaboration of a preventive treatment, hope for 0,5 to 2% of the population suffering from blindness caused by the complications of high myopia.

Notre capacité à communiquer et à apprécier la musique repose sur une discrimination de fréquences couvrant une large gamme de fréquences sonores. Cette propriété résulte de cellules mécanosensorielles « ciliées », qui sont réglées pour répondre de façon maximale à une fréquence caractéristique qui varie monotoniquement le long de l’axe de l’organe auditif, la cochlée. Les mécanismes cellulaires et moléculaires qui définissent la fréquence d’une cellule ciliée et régulent sa valeur pour différentes cellules afin de couvrir la gamme auditive demeurent néanmoins inconnus. Notre hypothèse de travail est que cette fréquence est réglée en partie par les propriétés mécaniques passives et actives de la « touffe ciliaire », l’antenne mécanosensorielle de la cellule ciliée. A l’aide d’une préparation excisée de la cochlée du rat, nous avons combiné l’iontophorèse de chélateurs de calcium (BAPTA ou EDTA) pour casser les liens de bout-de-cil qui connectent les stéréocils voisins de la touffe ciliaire, une stimulation grâce à un micro-jet de fluide pour estimer la raideur de la touffe ciliaire et des enregistrements en « patch-clamp » de courants de transduction afin de compter le nombre de liens de bout-de-cil intacts qui contribuent à la réponse. Avec les mouvements évoqués par la rupture des liens de bout-de-cil et avec nos mesures de raideur, nous avons pu estimer la tension dans toute la touffe ciliaire, ainsi que la tension dans un seul lien de bout-de-cil en connaissant le nombre de liens qui contribuent à cette tension. Dans les cellules ciliées externes, qui sont impliquées dans l’amplification du stimulus sonore mais qui n’envoient pas d’information neuronale au cerveau, nous avons observé un gradient de tension et de raideur lorsque la fréquence caractéristique de la cellule ciliée augmente, suggérant que ces paramètres physiques peuvent être impliqués dans le réglage d’une cellule ciliée à sa fréquence caractéristique. Au contraire, pour les cellules ciliées internes, les vraies cellules sensorielles de la cochlée, nos observations ne montrent pas de gradient significatif. De plus, nous avons observé des mouvements de la touffe ciliaire induits par la variation de la concentration en calcium, correspondant à une tension accrue pour des concentrations en calcium plus faibles. Ces mouvements sont similaires à ceux évoqués dans d’autres classes de vertébrés, tels que chez la grenouille ou chez la tortue. Ainsi, nos résultats réconcilient les expériences faites chez les vertébrés inférieurs et chez le mammifère, et montrent l’implication des gradients de la mécanique de la touffe ciliaire pour l’importante sélectivité fréquentielle de la cochlée / Our ability to communicate and appreciate music relies on acute frequency discrimination over a broad range of sound frequencies. This property results from the operation of mechanosensory “hair" cells, which are each tuned to respond maximally to a characteristic frequency that varies monotonically along the axis of the auditory organ, the cochlea. The cellular and molecular mechanisms that set the characteristic frequency of a hair cell and regulate its value among different cells to cover the auditory range have remained elusive. Our working hypothesis is that tuning results in part from passive and active mechanical properties of the “hair" bundle, the mechanosensory antenna of the hair cell.Using an excised preparation from the rat cochlea, we combined iontophoresis of a calcium chelator (BAPTA or EDTA) to break the tip links that interconnect neighbouring stereocilia of the hair-cell bundle, fluid-jet stimulation to estimate hair-bundle stiffness and patch-clamp recordings of transduction currents to count the number of intact transduction channels contributing to the response. From the movements evoked by tip-link breakage and our stiffness measurements, we were able to estimate tension in the whole hair bundle as well as, knowing the number of tip links contributing to this tension, in a single tip link.In outer hair cells, which are involved in sound amplification but do not send neural information to the brain, we observed a gradient of tension and stiffness from the low-frequency to the high-frequency end of the cochlea, suggesting that these physical parameters may help tune the hair cell to its characteristic frequency. Interestingly, with inner hair cells - the true sensors of the cochlea, our observations do not show any significant gradient. Furthermore, we observed calcium-evoked hair-bundle movements corresponding to an increased tension in the tip links at decreased concentrations of calcium. These movements were similar to those evoked in other classes of vertebrates, such as the frog or the turtle. Together, our results reconcile experiments performed in lower vertebrates with those performed in mammals and show the implication of hair-bundle mechanical gradients in the sharp frequency tuning of the cochlea

L’analyse du mouvement, ou l’analyse d’une séquence d’images, est l’extension naturelle de l’analyse d’images à l’analyse de séries temporelles d’images. De nombreuses méthodes d’analyse de mouvement ont été développées dans le contexte de la vision par ordinateur, incluant le suivi de caractéristiques, le flot optique, l’analyse de points-clef, le recalage d’image, etc. Dans ce manuscrit, nous proposons une boite a outils de techniques d’analyse de mouvement adaptées à l’analyse de séquences biomédicales. Nous avons en particulier travaillé sur les cellules ciliées qui sont couvertes de cils qui battent. Elles sont présentes chez l’homme dans les zones nécessitant des mouvements de fluide. Dans les poumons et les voies respiratoires supérieures, les cils sont responsables de l’épuration muco-ciliaire, qui permet d’évacuer des poumons la poussière et autres impuretés inhalées. Les altérations de l’épuration mucociliaire peuvent être liées à des maladies touchant les cils, pouvant être génétiques ou acquises et peuvent être handicapantes. Ces maladies peuvent être caractérisées par l’analyse du mouvement des cils sous un microscope avec une résolution temporelle importante. Nous avons développé plusieurs outils et techniques pour réaliser ces analyses de manière automatiques et avec une haute précision, à la fois sur des biopsies et in-vivo. Nous avons aussi illustré nos techniques dans le contexte d’éco-toxicité en analysant le rythme cardiaque d’embryons de poissons / Motion analysis, or the analysis of image sequences, is a natural extension of image analysis to time series of images. Many methods for motion analysis have been developed in the context of computer vision, including feature tracking, optical flow, keypoint analysis, image registration, and so on. In this work, we propose a toolbox of motion analysis techniques suitable for biomedical image sequence analysis. We particularly study ciliated cells. These cells are covered with beating cilia. They are present in humans in areas where fluid motion is necessary. In the lungs and the upper respiratory tract, Cilia perform the clearance task, which means cleaning the lungs of dust and other airborne contaminants. Ciliated cells are subject to genetic or acquired diseases that can compromise clearance, and in turn cause problems in their hosts. These diseases can be characterized by studying the motion of cilia under a microscope and at high temporal resolution. We propose a number of novel tools and techniques to perform such analyses automatically and with high precision, both ex-vivo on biopsies, and in-vivo. We also illustrate our techniques in the context of eco-toxicity by analysing the beating pattern of the heart of fish embryo

Les cils sont des organites très conservés au cours de l'évolution des eucaryotes et présents à la surface de presque tous les types cellulaires. Ils sont constitués d'une structure microtubulaire, l'axonème, entourée d'une membrane en continuité avec la membrane plasmique. Ils sont nucléés par un corps basal, centriole ancré à la surface cellulaire. Grâce aux nombreux récepteurs qu'ils concentrent à leur membrane, tous les cils sont des senseurs de leur environnement. Ils peuvent aussi être motiles et assurer, par leur battement coordonné, le déplacement relatif de la cellule et du fluide environnant. Tandis que cil et structure centriolaire, hérités du premier eucaryote, ont été perdus par certains champignons et par les plantes supérieures, certains gènes codant des protéines ciliaires et centriolaires sont pourtant retrouvés dans le génome de ces espèces. Cette conservation de protéines sans l'organite suggère soit que ces protéines interviennent dans un même processus moléculaire utilisé dans plusieurs organites, soit qu'elles jouent des rôles dans des processus moléculaires distincts via leur interaction avec différents types de partenaires.J'ai choisi d'étudier l'une de ces protéines ciliaires et centriolaires, Bug22p, hautement conservée en séquence protéique entre l'homme et la paramécie, mais également présente chez les plantes supérieures. J'ai mené cette étude principalement sur la paramécie, système modèle pour la biogénèse des corps basaux et des cils, mais aussi sur des cellules de mammifère et de végétaux supérieurs. Si Bug22p est impliquée dans la détermination du battement ciliaire chez la paramécie, elle se localise également dans des cils immotiles de cellules de mammifère suggérant que son activité ciliaire n'est pas réduite à cette seule fonction. Des expériences d'inactivation génique suggèrent par ailleurs un lien entre l'activité de Bug22p et la polyglycylation. Sa surexpression dans les cellules de mammifère en culture entraîne l'apparition d'extensions cellulaires et une augmentation des réseaux de tubulines acétylées probablement associées à une stabilisation des microtubules. L'ensemble de mes résultats suggère donc un rôle de Bug22p dans la régulation de modifications post-traductionnelles. En plus d'être présente dans les structures ciliaires, Bug22p se localise aussi bien dans les noyaux de la paramécie que dans ceux des cellules humaines et des plantes supérieures Arabidopsis et Nicotiana. Ces observations ouvrent un nouveau champ d'études. En effet, si l'on sait que les tubulines ciliaires sont soumises à différentes modifications post-traductionnelles telles que polyglycylation ou acétylation, ce type de modifications touchent également des protéines nucléaires régulant ainsi le trafic de protéines nucléaires ou l'expression génique. Nous pouvons donc avancer l'hypothèse selon laquelle Bug22p agirait sur la régulation de ces modifications dans le cil et dans le noyau. Il serait donc intéressant de caractériser les modifications post-traductionnelles chez les plantes supérieures afin de vérifier une possible implication de Bug22p dans leur régulation et donc comprendre les raisons de sa conservation chez les végétaux.