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Etude de la fonction de HIPK1, sa régulation et son implication en oncologie / Study of HIPK1 function, regulation and oncological implicationRey, Christophe 26 November 2010 (has links)
HIPK1 (Homeodomain Interacting Protein Kinase 1) est une sérine/thréonine kinase de la superfamille des CMGC kinases. Les HIPKs, initialement identifiées comme des régulateurs des facteurs de transcription à homéodomaine, constituent un groupe de quatre kinases. Parmi elles, trois semblent jouer un rôle dans la modulation de l’activité de p53. Il est bien connu que HIPK2 peut phosphoryler p53 sur sa sérine 46 en activant sa fonction pro-apoptotique et plus récemment il a été découvert que HIPK4 pouvait phosphoryler p53 sur sa sérine 9. Concernant HIPK1 le rôle fonctionnel de son interaction avec p53 n’a pas encore été clairement élucidé. De plus, la régulation d’autres voies de signalisation, telles que celle des MAP kinases par HIPK1 a été aussi documentée. L’objectif de mes travaux a été de caractériser la fonction de HIPK1 dans les cellules cancéreuses afin d’identifier son rôle potentiel dans la biologie tumorale, i.e. dans les processus de cancérogénèse ou dans la réponse aux traitements. Par sur-expression de HIPK1 nous avons caractérisé sa localisation subcellulaire, identifié ses déterminants moléculaires, et trouvé que HIPK1 est rapidement dégradée dans le compartiment nucléaire. De plus nous avons trouvé que HIPK1 active principalement la transcription p53-dépendante, en phosphorylant p53 sur sa sérine 15 et en stabilisant cette dernière. La sur-expression de HIPK1 a un effet anti-prolifératif, associé avec l’induction de p21. Nous avons donc exploré le profil d’expression de HIPK1 dans une collection de 80 cancers colorectaux et observé que HIPK1 est souvent plus fortement exprimée dans les tissus tumoraux que dans les tissus sains, mais aussi que son expression est indépendante du statut de p53 (sauvage ou muté). / HIPK1 (Homeodomain Interacting Protein Kinase 1) is a serine/threonine kinase which belongs to the CMGC kinases superfamily. HIPKs that have been initially identified as regulators of homeodomain transcription factors constitute a group of four kinases. Among them, three seem to play a role in the modulation of p53 activity. While it is well known that HIPK2 can phosphoylate p53 on serine 46 and activates its proapoptotic function, it has more recently been shown that HIPK4 can also phosphorylate p53 on serine 9. Concerning HIPK1, although some first studies have indicated that it could interact with p53, the functional role of this interaction has not been clearly elucidated. Moreover, the regulation of other signaling pathways, such as MAP Kinases by HIPK1 has also been documented. The purpose of this work is to characterize HIPK1 function in cancer cells to identify its possible role in tumor biology, i.e. in cancerogenesis process or in the response to treatments. By overexpressing HIPK1 we characterized the subcellular localization of the kinase, identified its molecular determinants, and found that HIPK1 is rapidly degradated in the nuclear compartment. Moreover we found that HIPK1 activates principally the p53 dependent transcription, by phophorylating p53 on its serine 15 and by stabilizating it. The overexpression of HIPK1 has an anti-proliferative effect, associated with the induction of p21.We have explored the HIPK1 expression profile in a collection of 80 colorectal cancers and observed that HIPK1 is often strongly expressed in the tumor tissue compared to the normal tissue, but also that its expression is p53 status independent (wild-type or mutated).
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Développement de stratégies et d'outils analytiques novateurs pour la détection de vaches atteintes de paratuberculoseFock-Chow-Tho, David January 2016 (has links)
La paratuberculose bovine est une maladie causée par la mycobactérie Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis (MAP). Elle est responsable d’énormes pertes économiques dans le monde. En effet, cette maladie provoque la diminution de la production laitière chez les vaches ainsi qu’un état de fatigue général en raison d’une entérite chronique chez les sujets atteints. Des indices mettent également en évidence le potentiel zoonotique de MAP et malheureusement aucun traitement n’est connu à ce jour. Ainsi, les stratégies actuelles pour contrer la maladie dans les troupeaux reposent plutôt sur des actions préventives. Actuellement, le diagnostic de la paratuberculose reste difficile et la prévalence de la maladie est probablement sous-estimée dans les troupeaux en raison de la faible sensibilité des tests diagnostiques.
Dans l’optique de développer une nouvelle méthode diagnostique pour la paratuberculose, ce projet de recherche s’est établi en deux étapes : la mise en place d’un système de diagnostic robuste des animaux par les méthodes de dépistage traditionnelles, incluant une étude comparative de l’efficacité de trousses commerciales, et finalement l’étude de la prolifération cellulaire spécifique des lymphocytes comme d’une épreuve diagnostique pour la maladie. Ainsi, la comparaison des trousses commerciales a démontré un écart d’efficacité qui a permis d’établir de nouvelles recommandations pour l’analyse des animaux ainsi que l’amélioration du diagnostic de la paratuberculose dans les troupeaux. Concernant le développement d’une méthode de diagnostique basée sur la prolifération lymphocytaire, de nombreuses difficultés techniques ont entravé le bon déroulement du projet mais ces travaux montrent la possibilité de caractériser de manière plus complète les différents types lymphocytaires par cytométrie de flux chez le bovin laitier.
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Analyse des interactions entre les cellules épithéliales intestinales et le collagèneMorin, Annie January 2010 (has links)
Le collagène occupe une place importante au niveau de plusieurs champs d'étude. En plus d'être reconnu, dans le domaine de la biologie cellulaire, pour ses propriétés adhésives aux cellules environnantes, physiologiquement le collagène contribue au maintien de l'unité fonctionnelle des organes grâce à son rôle de soutien.Le collagène répond également à maints champs d'exploitation, dont la cosmétologie, pour son apport hydrique, la chirurgie, vu sa propriété d'agrégant plaquettaire et de colle lors de suturation des plaies, mais également celui de l'orthopédie où le collagène sert à la régénérescence osseuse. Cependant, les collagènes utilisés dans ces sphères d'activités, sont majoritairement d'origine bovine, ovine, caprine ou murine. Étant donné que le collagène d'origine mammifère est susceptible d'être contaminé par des prions et donc de transmettre à l'humain l'encéphalopathie spongiforme bovine, une maladie mortelle, et que le collagène de queue de rat n'est disponible qu'en petite quantité et sous une forme dénaturée, nous avions pour objectif d'analyser les particularités d'un nouveau collagène natif extrait de la peau de poissons d'eau chaude. Dans cette étude, nous avons utilisé les cellules épithéliales intestinales humaines indifférenciées HIEC comme modèle cellulaire, afin de comparer la morphologie, l'adhésion, la différenciation et la prolifération des cellules cultivées sur le collagène natif marin à celles cultivées sur le collagène de queue de rat standard. Les résultats obtenus par diverses méthodes dont la microscopie à contraste de phase, les tests d'adhésion, l'immunobuvardage de type Western, le RT-PCR et l'immunofluorescence indirecte ont permis de démontrer de grandes similitudes entre les deux types de collagène analysés. Les résultats obtenus démontrent que le collagène natif marin est très semblable au collagène de queue de rat, en ce qui a trait à son aspect adhésif et son incapacité à induire la différenciation cellulaire. D'autre part, le collagène marin adopte une conformation structurale beaucoup plus organisée, sous forme de fibrilles trimériques, alors que la solution de collagène de queue de rat contient principalement que des monomères. De plus, le collagène marin semble être significativement moins proprolifératif [i.e. prolifératif] que le collagène de queue de rat. Cette particularité nous paraît bien intéressante, puisque le collagène natif marin pourrait avoir de nombreuses retombées sur le marché thérapeutique, afin de soulager les patients atteints de maladies associées avec une hyperprolifération comme le psoriasis. Un baume à base de collagène marin serait en mesure de réduire la prolifération des cellules épidermiques et par le fait même limiter la progression des lésions, par exemple. Plusieurs laboratoires de recherche pourront bénéficier des propriétés comparables du collagène natif marin à moindre coût et plus sécuritaire pour la santé.
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Impact de la liaison de la p27 aux complexes cycline D3-CDK4Bockstaele, Laurence 15 December 2006 (has links)
La progression à travers le cycle cellulaire est assurée par l’activation séquentielle d’une série de complexes cycline-CDK. Les complexes cycline D-CDK4 assurent la progression au cours de la phase G1 du cycle cellulaire en phosphorylant les protéines « antioncogéniques » de la famille Rb. L’activation de la CDK4 nécessite son association à une cycline D et sa phosphorylation sur Thr172 par la CAK nucléaire (CDK activating kinase). Le rôle essentiel des protéines de la famille Cip/Kip dans la régulation de l’activité de ces complexes reste controversé. Les protéines de cette famille (comprenant p27 et p21) ont initialement été identifiées comme des inhibiteurs puissants des complexes cycline-CDK et comme les intermédiaires de l’action antimitogénique de différents signaux intra ou extra-cellulaires. Il a été proposé que la liaison de la p27 ou de la p21 aux complexes cycline D-CDK4 empêche leur phosphorylation activatrice par la CAK et leur activité pRb kinase. Cependant, l’observation que des complexes cycline D-CDK4 associés à p21/p27 possèdent une activité pRb kinase a donné naissance à une seconde hypothèse sur la régulation de ces complexes par la p27 ou la p21. Ces « inhibiteurs » ont été paradoxalement proposés comme facteurs nécessaires et suffisants d’assemblage et de localisation nucléaire des complexes cycline D-CDK4. Dans le modèle physiologiquement relevant des thyrocytes de chien en culture primaire, la mitogénèse dépendante de l’AMPc activée par la TSH diffère des cascades des facteurs de croissance puisqu’elle n’induit pas les cyclines D mais au contraire augmente l’accumulation de l’«inhibiteur» de CDK p27. L’AMPc stimule l’assemblage des complexes cycline D3-CDK4, leur translocation nucléaire et leur association à p27. Dans ce modèle, le TGF inhibe la mitogénèse dépendante de l’AMPc en inhibant la translocation nucléaire des complexes cycline D3-CDK4 et leur association à la p27.
Nous avons étudié l’activité catalytique et l’activation des complexes cycline D3-CDK4-p27 issus des thyrocytes de chien en culture primaire ou produits en cellules d’eucaryotes supérieurs (CHO et Sf9). Nous avons pu montrer que les complexes cycline D3-CDK4-p27 issus des thyrocytes de chien stimulés par la TSH présentent une activité pRb-kinase qui est inhibée par le TGF. En outre, la production des complexes cycline D3-CDK4-p27 en cellules CHO ou Sf9 nous a permis de montrer que l’impact de la p27 sur l’activité catalytique des complexes cycline D3-CDK4 dépend de sa stoechiométrie de liaison à ces complexes. L’analyse du profil de séparation par électrophorèse bidimensionnelle de la CDK4 issue de ces trois systèmes montre que la p27 n’empêche pas la phosphorylation activatrice de la CDK4, même aux concentrations de p27 qui empêchent l’activité pRb kinase du complexe cycline D3-CDK4. Nous avons également montré dans les cellules CHO que la p27 détermine la localisation nucléaire des complexes cycline D3-CDK4, ceux-ci étant relocalisés dans le cytoplasme par la transfection d’un mutant de la p27 dépourvu de son signal de localisation nucléaire. Ces résultats valident les observations réalisées par immunofluorescence dans les thyrocytes de chien dans lesquels nous avons mis en évidence une étroite corrélation au niveau des cellules individuelles stimulées par la TSH entre la translocation nucléaire de la CDK4 et l’apparition de la p27 nucléaire. Cette colocalisation est partiellement inhibée par le TGF. Ces observations renforcent l’hypothèse d’un rôle de la p27 dans l’ancrage nucléaire des complexes cycline D3-CDK4.
Alors que la localisation de la CAK est considérée comme exclusivement nucléaire et son activité catalytique constitutive, nous avons pu montrer que la phosphorylation activatrice de la CDK4 associée à la cycline D3 n’est pas affectée par sa localisation sub-cellulaire et qu’elle est régulée par le TGF dans les thyrocytes de chien et par le sérum dans les cellules T98G indépendamment de l’association de la CDK4 à la p27. De plus, la phosphorylation de la CDK4 sur Thr172 dans les cellules T98G est stimulée par le sérum, alors que la phosphorylation activatrice de la CDK6, son homologue fonctionnel, ne l’est pas. La comparaison de la séquence de ces deux CDKs à proximité des Thr phosphorylées (Thr177 pour la CDK6) révèle, outre une forte similarité de séquence, une différence au niveau de l’acide aminé situé en aval de la thréonine : il s’agit d’une proline dans la CDK4 et d’une sérine dans la CDK6. La mutation P173S de la CDK4 abolit la phosphorylation sur Thr172 et l’activité de la CDK4 associée à la cycline D3 dans les cellules CHO, mais n’affecte pas la phosphorylation et l’activation de la CDK4 par la CAK recombinante in vitro. L’ensemble de ces résultats suggère que la/les CAKs régulée(s) responsables de l’activation de la CDK4 n’ont pas encore été identifiées et que la proline située en aval de la Thr172 de la CDK4 est essentielle pour sa phosphorylation activatrice et son activité pRb kinase.
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Rôles de la cathepsine L et des facteurs de transcription Hnf4[alpha] et Hnf1[alpha] dans la différenciation fonctionnelle de l'épithélium de l'intestin grêleLussier, Carine January 2009 (has links)
L'épithélium de l'intestin grêle est en constant renouvellement.L'équilibre entre la prolifération et la différenciation cellulaire y est finement régulé par de nombreuses interactions entre l'épithélium et son environnement. Les interactions épithéliomésenchymateuses engendrent une signalisation qui affecte l'expression génique essentielle au développement et au maintien d'une muqueuse fonctionnelle. Plusieurs facteurs de transcription endodermiques ont été identifiés comme régulateurs de l'épithélium intestinal. Cdx2 en est un exemple, son expression dans les cellules épithéliales intestinales indifférenciées est suffisante à l'induction de leur différenciation en culture. Manuscrit 1: Afin de mieux comprendre les voies moléculaires impliquées dans la différenciation de l'épithélium intestinal, les gènes dont l'expression est modulée suite à l'induction de Cdx2 dans les cellules épithéliales intestinales ont été analysés. La cathepsine L est induite avec la polarisation et la différenciation des cellules épithéliales intestinales et l'inhibition de son activité interfère avec ces processus. De plus, la perte de l'activité de cette protéase conduit à une augmentation de la multiplicité tumorale dans l'intestin des souris APC[indice supérieur Min]. Ces résultats montrent une fonction intracellulaire non suspectée pour la cathepsine L dans l'épithélium intestinal au cours de la polarisation et de l'initiation tumorale. Manuscrit 2 : Pour identifier de nouveaux régulateurs de la différenciation épithéliale intestinale, un modèle de co-culture cellulaire permettant de récapituler la différenciation de cet épithélium a été établi et caractérisé génétiquement. Hnf-4[alpha] et Hnf-1[alpha] sont fortement induits au cours de cette différenciation.L'expression forcée de Hnf-4[alpha] dans les cellules indifférenciées entraîne l'activation de Hnf-1[alpha] et de plusieurs marqueurs des fonctions digestives, ainsi que l'établissement d'une barrière fonctionnelle en co-culture. Ces observations suggèrent que Hnf-4[alpha] est un joueur important dans la régulation de la différenciation des cellules épithéliales intestinales. Manuscrit 3 : Afin de démontrer les fonctions de Hnf-1[alpha] dans l'homéostasie de l'épithélium intestinal in vivo, le phénotype intestinal des souris invalidées pour Hnf-1[alpha] a été analysé. Ces souris présentent une intestinalomégalie caractérisée par une augmentation de la prolifération cellulaire et cryptale. Ces phénomènes étant associés à une augmentation de l'activité de mTOR. De plus, les souris invalidées pour Hnf-1[alpha] présentent une modulation de l'expression de plusieurs marqueurs de cellules entéroendocrines. Ces observations suggèrent un rôle insoupçonné pour Hnf-1[alpha] dans le maintien de la croissance et le devenir des cellules entéroendocrines de l'intestin grêle. Section 4 : Afin de confirmer la collaboration entre les facteurs Hnf-4[alpha] et Hnf-1[alpha] dans l'homéostasie de l'épithélium intestinal in vivo, des souris invalidées pour Hnf-1[alpha] de façon classique et pour Hnf-4[alpha] uniquement dans l'épithélium intestinal (doublement invalidées), au cours du développement embryonnaire (villine-Cre) ainsi que chez l'adulte (CYP1A1-Cre), ont été produites. Les souris doublement invalidées au cours du développement meurent dans les premières 36 heures suivant leur naissance et les souris doublement invalidées à l'âge adulte meurent au cours du traitement qui permet l'invalidation de Hnf-4[alpha]. Ces résultats indiquent que la double invalidation de Hnf-1[alpha] et de Hnf-4[alpha] au niveau de la muqueuse de l'intestin grêle est incompatible avec la survie des souris.
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Implication du facteur de transcription E2F4 dans le contrôle du cycle cellulaire, de la survie et de la sénescence des cellules épithéliales intestinales humaines normales et cancéreusesGarneau, Hugo January 2010 (has links)
Les facteurs de transcription E2F sont impliqués dans différents processus physiologiques comme l'apoptose, la sénescence et la progression dans le cycle cellulaire par exemple. Des travaux antérieurs dans le laboratoire ont démontré que la localisation de E2F4 est dépendante du cycle cellulaire. Dans les cellules prolifératives de la crypte intestinale, E2F4 se localise au noyau alors que dans les cellules quiescentes ou différenciées, E2F4 est cytoplasmique. La localisation cellulaire de E2F4 est un élément important pour le contrôle de son activité transcriptionnelle. Nous avons analysé l'effet de l'expression nucléaire et constitutive de E2F4 dans un modèle de cellules épithéliales intestinales humaines normales (HIEC) pour en mesurer l'impact sur la prolifération et la survie cellulaire. Nous démontrons pour la première fois que E2F4 module l'expression de gènes associés à la régulation de la voie intrinsèque et extrinsèque de l'apoptose, un rôle qui lui était inconnu jusqu'à présent. Par interférence d'ARN, nous avons diminué les niveaux d'expression de p53, un gène au coeur de la régulation de l'apoptose. Nous avons observé que la mort cellulaire est significativement retardée. De plus, nous avons démontré que l'inhibition de l'activité des caspases ne prévient pas non plus la mort cellulaire. L'implication de mécanismes de mort cellulaire alternatifs p53 indépendants a été investiguée. Nos résultats démontrent que l'inhibition de l'activité des calpaïnes/cathepsines, de RIP, de la voie JNK, même en combinaison avec une réduction des niveaux de p53, ne font que retarder la mort cellulaire mais ne l'empêche jamais. Nos résultats indiquent que plusieurs mécanismes de mort cellulaire classiques (voies intrinsèque et extrinsèque) et alternatifs (ROS, autophagie, AIF) sont probablement activés par la surexpression nucléaire de E2F4 dans les cellules épithéliales intestinales. Nous avons aussi évalué l'importance de E2F4 dans le contrôle de la prolifération des cellules épithéliales intestinales humaines normales et cancéreuses. Nous avons observé un ralentissement important de la prolifération et une cinétique d'entrée en phase S ralentie pour les populations HIEC qui expriment des niveaux réduits de E2F4. Ce ralentissement est probablement attribuable à la modulation des niveaux d'expression autant en ARNm et en protéines de nombreux gènes régulateurs de la transition G1/S tels que c-myc, cdk2, les cyclines A et D ainsi que p21 et p27 notamment. L'impact majeur de E2F4 sur le contrôle de la transition Gl/S n'avait jamais encore été décrit dans la littérature. De plus, dans les lignées cellulaires cancéreuses colorectales, E2F4 est surexprimé et se localise préférentiellement dans le noyau. Cette observation est confirmée par l'utilisation d'une banque de tissus où nous avons constaté que dans 24 spécimens sur 30, E2F4 est surexprimé dans la tumeur par rapport au tissu normal et que E2F4 est surtout nucléaire Finalement, nous avons aussi diminué les niveaux d'expression de E2F4 par interférence à l'ARN dans les lignées cellulaires Caco-2/15 et HCT-116 pour en analyser l'impact sur la prolifération et la survie cellulaire. Dans les deux lignées, la réduction de l'expression de E2F4 induit un ralentissement de la prolifération significatif et elle réduit leur capacité à former des colonies en agar mou. Par ailleurs, la réduction des niveaux d'expression de E2F4 entraîne une entrée accélérée en sénescence cellulaire dans les cellules HIEC et induit l'apparition de caractéristiques liées à la sénescence dans la lignée cellulaire Caco-2/15 révélant ainsi un rôle insoupçonné de E2F4 dans le contrôle de la sénescence cellulaire. Pris ensemble, mes résultats démontrent que E2F4 est un acteur majeur du contrôle du cycle cellulaire, de la survie et de la sénescence cellulaire dans les cellules épithéliales intestinales humaines normales et cancéreuses.
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Évolution des réponses CD4 et CD8 dirigés contre le VIH au cours de l'infectionKernaleguen, Anne-Elen January 2005 (has links)
Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.
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Étude des voies de signalisation impliquées lors de la prolifération et l'apoptose des cellules du cancer du sein en réponse aux acides grasHardy, Serge January 2005 (has links)
Thèse numérisée par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.
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Étude sur l'inhibition du phénotype des gliomes malins par la voie de signalisation du TGF-ßSathoud, Yannick January 2013 (has links)
Les gliomes malins prolifèrent d’une manière très anarchique et elles s’infiltrent dans le parenchyme cérébral. Plusieurs facteurs de croissance, tels que le Transforming Growth Factor Beta (TGF-ß), sont surexprimés dans les gliomes malins. La voie de signalisation du TGF-ß joue un rôle clé dans la régulation des mécanismes liés au métabolisme et à la prolifération cellulaire. L’objectif principal de cette étude est d’évaluer les effets de l’inhibition de la voie de signalisation du TGF-ß sur le phénotype des gliomes malins. Deux méthodes ont été utilisées pour inhiber la voie du TGF-ß. La première est un traitement à la chloroquine, un agent alcalinisant lysosomotropique, qui module à la hausse le pH du Trans Golgi Network (TGN )/endosome. Cet agent inhibe la furine, une protéase nécessaire à la maturation du TGF-ß, ainsi que la métalloprotéases-2 (MMP-2) qui permet la libération du TGF-ß de la matrice extracellulaire (MEC). La deuxième méthode est un traitement avec l’Avasimibe™, un agent qui inhibe l'Acyl-CoA-Acétyltransférase (ACAT) démontrée comme étant activé par le TGF-ß. Les effets de ces deux agents ont été testés sur la sécrétion de TGF-ß, sur le métabolisme et la prolifération cellulaire de la lignée de gliomes murins F98. Par l’immunobuvardage de type Western blot, notre étude a révélé la présence de la forme immature de TGF-ß1 et de Latency Associated Peptide (LAP) dans le surnageant de la lignée de gliomes murins F98. Par le test Enzyme Linked Immunosorbent Assay (ELISA), l’étude a indiqué que la chloroquine et l’Avasimibe™ diminuent de 85 ± 3 % et 65 ± 1 % la concentration de TGF-ß1 mature sécrétée dans le surnageant cellulaire. Les essais WST-1 et BrdU ont montré que des expositions de 24 h et 48 h à la chloroquine et l’Avasimibe™ diminuent significativement de plus de 74 ± 9 % et 86 ± 2 % % le métabolisme et la prolifération cellulaire. La zymographie pousse à croire que les effets de chloroquine étaient associés à une inhibition de 75 ± 1 % de l’activité de la MMP-2 en 48 h. L’ajout de la chloroquine et de l’Avasimibe™ pourrait être bénéfique au traitement standard des gliomes malins en réduisant leur phénotype.
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Etude du rôle de la phosphatase SHIP2 dans un modèle d'astrocytomes humainsElong Edimo, William's 28 February 2013 (has links)
Le metabolisme des phosphoinositides est constitue dfun reseau complexe dfenzymes et de seconds messagers participant a la regulation de nombreux processus cellulaires :la proliferation, la croissance, la survie et la migration. Le phosphatidylinositol 3,4,5-trisphosphate (PtdIns(3,4,5)P3), est un second messager intracellulaire tres important dont le taux est controle a la fois au niveau de sa synthese par des kinases et au niveau de sa degradation par des phosphatases. La phosphatase PTEN (phosphatase and tensin homolog deleted on chromosomes 10), gene suppresseur de tumeurs frequemment mutee dans des cancers (comme dans des glioblastomes), le dephosphoryle en position 3. Il existe egalement une activite á inositol 5-phosphatase â pour de nombreux derives du myo-inositol. Cfest la proteine SHIP2 (SH2-containing Inositol 5-phosphatase 2), une phosphatase membre de la famille des phosphatidylinositol polyphosphate 5-phosphatases qui est, entre autre, responsable de cette activite.Le but principal de ce travail de these a ete de mettre en evidence le role pro ou anti-oncogenique de SHIP2 dans un modele cellulaire humain de glioblastomes :les cellules 1321 N1. Ce modele cellulaire a comme particularite lfabsence dfexpression de PTEN au niveau proteique.La caracterisation des clones cellulaires deficients pour SHIP2 nous a permis de mettre en evidence une augmentation du taux du PtdIns(3,4,5)P3 par rapport a des cellules qui expriment un taux normal de SHIP2. Par un simple comptage, nous avons observe une augmentation du nombre de cellules en culture par rapport aux cellules controles. Lfimmunomarquage de la F-actine nous a permis de montrer une difference de morphologie entre les cellules N1 shSHIP2 et les cellules controles. Au travers de Western blots, nous avons observe que la phosphorylation de la PKB ainsi que celle de Erk1/2 etait augmentee dans les cellules deficientes pour SHIP2 en comparaison aux cellules qui expriment SHIP2.Dans les cellules COS-7 transfectees par SHIP2 sauvage, nous avons identifie par spectrometrie de masse 8 sites de phosphorylation sur Tyr, Ser et Thr. En systeme endogene dans les cellules N1, notre etude a demontre la presence de 3 sites de phosphorylations sur Ser (position 132 et 1258) et Thr (position 1254). Nous avons genere deux anticorps specifiques contre la proteine SHIP2 phosphorylee sur la Ser132 et Thr1254. Lfanticorps contre la Ser 132 nous a permis de mettre en evidence une colocalisation entre pSHIP2 Ser132 et le facteur dfepissage SC35 present dans les speckles nucleaires. Cette donnee nous suggere un role nucleaire nouveau pour SHIP2.De maniere originale nous avons mis en evidence dans les cellules dfastrocytomes N1 trois localisations subcellulaires de SHIP2 :i) a la membrane plasmique au niveau des adherences focales ou SHIP2 serait impliquee dans le controle du taux de PtdIns(3,4,5)P3/ PtdIns(4,3)P2, et de la migration ii) au niveau perinucleaire ou SHIP2 ainsi que la forme phosphorylee sur Ser132 seraient impliquees dans des interactions proteiques via ses proprietes de á docking protein â et enfin iii) dans le noyau specifiquement dans les speckles ou la forme phosphorylee de SHIP2 sur Ser132 serait impliquee dans le controle du taux de PtdIns(4,5)P2, mais egalement dans la signalisation nucleaire impliquant les phosphoinositides.La presence de SHIP2 dans les adherences focales nous a amene a rechercher par quel mecanisme SHIP2 pouvait se retrouver a cette localisation. Nous avons par immunoprecipitation suivie dfune analyse par spectrometrie de masse identifie la myosine 1c (Myo1c) comme nouveau partenaire de SHIP2. Les cellules deficientes pour la Myo1c presentent une modification de la morphologie cellulaire, ainsi qufune modification de la localisation intracellulaire de SHIP2. Les cellules N1 deficientes pour la Myo1c montrent aussi une diminution de lfexpression de la sous unite regulatrice de la PI 3-kinase (p85ƒ¿) ainsi qufune absence de la phosphorylation de la PKB sur la Ser473 et la Thr308. En outre, ces cellules N1 shMyo1c presentent un taux eleve dfapoptose compare aux cellules controles.En conclusion, ces travaux ont permis de montrer que dans un modele humain de glioblastomes N1, SHIP2 etait phosphorylee sur la Ser 132 et que cette phosphorylation semblait etre requise pour son activite phosphatase. SHIP2 possedait trois localisations subcellulaires probablement associees a des fonctions differentes, qufelle interagissait au minimum avec les proteines partenaires nouvelles lamin A/C et Myo1c. Enfin SHIP2 exercait un controle negatif sur la proliferation et la migration de ces cellules. Ces resultats mettent en evidence plusieurs fonctions originales de SHIP2 comme son role dans la migration et la proliferation qui ouvrent des perspectives nouvelles dans lfetude de cette phosphatase dans le contexte general et surtout physiopathogique des fonctions attribuees aux phosphoinositides. / Doctorat en Sciences biomédicales et pharmaceutiques / info:eu-repo/semantics/nonPublished
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