A Thermotoga marítima (Tm) é uma bactéria que vive em temperaturas na faixa dos 65 até 90°C, com temperatura ótima do redor dos 80°C. A proteína TM1030 de Tm, é um regulador transcricional da família TetR (Tetracycline repressor protein) reguladores da expressão génica das proteínas TetA e TetB (Tetracycline resistance protein). Neste trabalho se rodarem 200ns de trajetória de dinâmica molecular a três temperaturas (293, 323 e 353K) da proteína TM1030 (PDB-1Z77) usando o pacote GROMACS com o potencial Amber99 e solvente explicito numa caixa cúbica com 90Å de comprimento, observando que RMSD da estrutura média da trajetória é menor em relação à estrutura cristalográfica, além disso que num primer momento esse RMSD tem uma mudança grande e que se estabiliza com uma maior velocidade nas maiores temperaturas. Também foi feito um analise de modos normais na mesma estrutura usando o mesmo potencial, mas com solvente implícito, usando o modelo GBSA, minimizando a estrutura até ter um coeficiente de força média de 6,4x10-8J·mol-1·cm-1 que assegura um bom mínimo local. Das trajetórias simuladas a partir das 6 menores frequências se achou uma relação com os movimentos observados nas dinâmicas moleculares e os esperados na transição alostérica entre as duas estruturas cristalográficas. Finalmente se calculam os fatores de temperatura das três trajetórias de dinâmica molecular, observando que seus esses fatores de temperatura aumentam com o aumento da temperatura, contrario do esperado da cristalografia onde diminuam com o aumento da temperatura do sistema. / The Thermotoga maritima (Tm) is a bacterium who can lives at temperatures of 65 to 90°C, with optimum temperature around of 80°C. The TM1030 protein of Tm is a transcriptional regulator from TetR family (Tetracycline repressor protein) regulators of gene expression of the TetA and TetB protein (Tetracycline resistance protein). In this work 200ns of molecular dynamics trajectory was run at three temperatures (293, 323 and 353K) of TM1030 protein (PDB-1Z77) using GROMACS package with Amber99 potential and explicit solvent in a cubic box with length 90A, noting that RMSD of the average structure of the trajectory is smaller with respect to the crystallographic structure, in addition, in a first time this RMSD have a large change and stabilizes at a higher speed at higher temperatures. There was also an analysis of normal modes on the same structure using the same potential, but with implicit solvent, using the GBSA model, minimizing the structure to have a medium force coefficient of 6,4x10-8J·mol-1·cm-1which ensures a good local minimum. Of the trajectories simulated from 6 lower frequencies was found a relationship with the movements observed in molecular dynamics and expected the allosteric transition between the two crystal structures. Finally was calculate the temperature factor of the three trajectories of molecular dynamics, observing their temperature factors increase with increasing temperature, contrary to expectations of crystallography which decrease with the increase of the system temperature.

A Thermotoga marítima (Tm) é uma bactéria que vive em temperaturas na faixa dos 65 até 90°C, com temperatura ótima do redor dos 80°C. A proteína TM1030 de Tm, é um regulador transcricional da família TetR (Tetracycline repressor protein) reguladores da expressão génica das proteínas TetA e TetB (Tetracycline resistance protein). Neste trabalho se rodarem 200ns de trajetória de dinâmica molecular a três temperaturas (293, 323 e 353K) da proteína TM1030 (PDB-1Z77) usando o pacote GROMACS com o potencial Amber99 e solvente explicito numa caixa cúbica com 90Å de comprimento, observando que RMSD da estrutura média da trajetória é menor em relação à estrutura cristalográfica, além disso que num primer momento esse RMSD tem uma mudança grande e que se estabiliza com uma maior velocidade nas maiores temperaturas. Também foi feito um analise de modos normais na mesma estrutura usando o mesmo potencial, mas com solvente implícito, usando o modelo GBSA, minimizando a estrutura até ter um coeficiente de força média de 6,4x10-8J·mol-1·cm-1 que assegura um bom mínimo local. Das trajetórias simuladas a partir das 6 menores frequências se achou uma relação com os movimentos observados nas dinâmicas moleculares e os esperados na transição alostérica entre as duas estruturas cristalográficas. Finalmente se calculam os fatores de temperatura das três trajetórias de dinâmica molecular, observando que seus esses fatores de temperatura aumentam com o aumento da temperatura, contrario do esperado da cristalografia onde diminuam com o aumento da temperatura do sistema. / The Thermotoga maritima (Tm) is a bacterium who can lives at temperatures of 65 to 90°C, with optimum temperature around of 80°C. The TM1030 protein of Tm is a transcriptional regulator from TetR family (Tetracycline repressor protein) regulators of gene expression of the TetA and TetB protein (Tetracycline resistance protein). In this work 200ns of molecular dynamics trajectory was run at three temperatures (293, 323 and 353K) of TM1030 protein (PDB-1Z77) using GROMACS package with Amber99 potential and explicit solvent in a cubic box with length 90A, noting that RMSD of the average structure of the trajectory is smaller with respect to the crystallographic structure, in addition, in a first time this RMSD have a large change and stabilizes at a higher speed at higher temperatures. There was also an analysis of normal modes on the same structure using the same potential, but with implicit solvent, using the GBSA model, minimizing the structure to have a medium force coefficient of 6,4x10-8J·mol-1·cm-1which ensures a good local minimum. Of the trajectories simulated from 6 lower frequencies was found a relationship with the movements observed in molecular dynamics and expected the allosteric transition between the two crystal structures. Finally was calculate the temperature factor of the three trajectories of molecular dynamics, observing their temperature factors increase with increasing temperature, contrary to expectations of crystallography which decrease with the increase of the system temperature.

Les protéines-G hétérotrimériques, constituées des sous-unités α, β et γ, sont les premières actrices de la transduction du signal en interagissant directement avec les Récepteurs Couplés aux protéines-G (RCPG). Les protéines-G ont la capacité de lier soit une molécule de GDP lorsqu'elles sont inactives, soit une molécule de GTP quand elles sont activées par un RCPG. Cet échange de nucléotide va conduire à la dissociation de l'hétérotrimère avec d'une part la sous-unité α seule, et d'autre part le complexe βγ. Chacune de ces entités va ensuite propager le signal dans le compartiment intracellulaire. Les travaux effectués au cours de cette thèse ont pour but de mieux comprendre la dynamique des protéines-G hétérotrimériques et de leurs récepteurs par des techniques de mécanique moléculaire incluant la Dynamique Moléculaire (DM) et l'Analyse de Modes Normaux (AMN). Dans un premier temps une AMN nous a permis de décrire les possibles mouvements de larges amplitudes des protéine-G. Nous avons à l'occasion de cette étude mis au point une méthode de sélection de Modes Normaux (MN) pertinents que nous avons appelés modes représentatifs. Nous avons également développé une méthode d'extraction de ligand (ici le GDP) le long de ces MN. Ceci nous a permis de montrer qu'un mouvement concerté de toute la sous-unité α pouvait permettre l'ouverture de la poche et la sortie du GDP. Dans un deuxième temps, nous avons affiné nos résultats en reconstruisant des profils d'énergie libre le long de plusieurs chemins de sortie possibles pour le GDP. Ainsi nous avons pu proposer un mécanisme fin de sortie du ligand et plusieurs résidus clés impliqués dans cette sortie. Nous avons également étudié le processus de dissociation de l'hétérotrimère par la technique de la Dynamique Moléculaire Dirigée. Il a été possible, à l'issue de cette étude, de proposer un mécanisme à l'échelle moléculaire de la séparation des sous-unités α et βγ. Pour finir, nous avons également étudié le macro-complexe RCPG : protéine-G. Deux études traitent des mécanismes d'activation et de couplage des protéines-G à son récepteur. Nous avons notamment montré que l'hétérotrimère de protéine-G contraint très fortement les mouvements du récepteur. Un mouvement très largement retrouvé dans le complexe ainsi que dans plusieurs autres RCPGs dont les structures sont connues a été proposé comme étant le mouvement d'activation des RCPG une fois complexés à leurs protéines partenaires. / Heterotrimeric G-proteins, constituted of α, β and γ subunits are the first actresses of the intra-cellular signal transduction and interact directly with G-protein Coupled Receptors (GPCR). The heterotrimer is able to bind either a GDP molecule (inactive state) or a GTP molecule (active state). The nucleotide exchange is triggered by the interaction with an activated GPCR and leads to the dissociation of the whole heterotrimer into two independant entities : α and tightly bound βγ subunits. Both subunits further propagate the signal into the intracellular compartment. Goals of the present work were to better understand the mechanics of G-proteins and GPCR by combining several molecular mechanics techniques such as Molecular Dynamics (MD) and Normal Mode Analysis (NMA).Firstly, we described large amplitude motions of the whole G-protein heterotrimer. In this study we developped a method to select relevant Normal Modes (NM), we called representative NM. We also developped a method which consists to extract a ligand (in our case the GDP) out of its binding pocket along computed NM. With these two new methods, we showed that a concerted motion of the α subunit would promote the opening of the pocket and the release of the GDP.Secondly, to refine our results, we performed free energy profiles reconstructions along several putative exit pathways of the GDP. Thus, we proposed for the first time a fine-tuned mechanism of GDP exit at the molecular scale and putative key-residues. We proposed also a molecular scale mechanism for the dissociation of the heterotrimeric G-protein through the use of the Targeted Molecular Dynamics (TMD). Finally we were interested in the study of the GPCR:G-protein complex. We performed two studies related to the activation and to the coupling of the macro-complex. We showed that G-protein constrain drastically the GPCR motions. One over-represented motion in the complex that was also retrieved in other crystallized structures of several different GPCRs thus suggested that this motion could be the putative activation motion of a GPCR when complexed to its favorite protein partners.

Les récepteurs ionotropiques du glutamate sont responsables de la vaste majorité de la neurotransmission excitatrice rapide dans le système nerveux central. Parmi eux, les récepteurs NMDA (rNMDA) sont les médiateurs de la plasticité synaptique, fondement cellulaire des processus d’apprentissage et de mémoire. Leurs dysfonctionnements sont impliqués dans de nombreuses pathologies neurologiques et psychiatriques comme les maladies d’Alzheimer et de Parkinson, l’épilepsie et la schizophrénie. Les rNMDA forment des complexes hétérotétramériques massifs (>500 kDa) dotés de propriétés allostériques uniques grâce à un ensemble de 8 domaines extracellulaires bilobés organisé en deux strates superposées : la couche de domaines N-terminaux (NTD) et la couche de domaines de liaison de l’agoniste (ABD). Malgré un nombre croissant de structures complètes de rNMDA, le mécanisme de transduction permettant aux interactions entre ces domaines de contrôler l’activité du récepteur restait inconnu. En combinant analyse expérimentale et computationnelle, nous montrons qu’un mouvement de roulis à l’interface entre les deux dimères de la couche d’ABD est un déterminant clé du processus d’activation et de modulation des rNMDA. Cette rotation des deux dimères d’ABD constitue un commutateur conformationnel qui règle l’ouverture du canal en fonction de la conformation des NTD situés à l’opposé. Ce travail révèle comment des changements conformationnels concertés entre couches de domaines gouvernent l’activité des rNMDA. Il illumine notre compréhension d’un récepteur synaptique majeur du système nerveux central et ouvre la voie à la conception de nouveaux agents pharmacologiques ciblant le mécanisme allostérique élucidé. / Ionotropic glutamate receptors are responsible for the vast majority of fast excitatory neurotransmission in the central nervous system. Among them, NMDA receptors (NMDARs) are key mediators of synaptic plasticity, which is considered as the cellular basis of learning and memory. NMDAR dysfunction is implicated in numerous neurological and psychiatric brain disorders such as Alzheimer and Parkinson’s disease, epilepsy and schizophrenia. NMDAR form massive hetero tetrameric complexes (>500 kDa) endowed with unique allosteric capacity provided by a cluster of eight extracellular clamshell-like domains arranged as two superimposed layers: the Nterminal domain (NTD) layer and the agonist binding domain (ABD) layer. Despite an increasing number of full-length NMDAR structures, the transduction mechanism by which these domains interact in an intact receptor to control its activity remained poorly understood. Combining experimental and in silico analysis, we identify a rolling motion at an interface between the two constitute dimers in the ABD layer as a key determinant in NMDAR activation and modulation pathways. This rotation of the two ABD dimers acts as a conformational switch that tunes channel opening depending on the conformation of the membrane-distal NTD layer. This work unveils how NMDAR domains move and operate in a concerted manner to transduce conformational changes between layers and command receptor activity. It illuminates our understanding of a major synaptic receptor of the central nervous system and paves the way for the development of new pharmacological tools targeting the elucidated allosteric mechanism.

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La dynamique structurelle des biomolécules est intimement liée à leur fonction, mais très coûteuse à étudier expériementalement. Pour cette raison, de nombreuses méthodologies computationnelles ont été développées afin de simuler la dynamique structurelle biomoléculaire. Toutefois, lorsque l'on s'intéresse à la modélisation des effects de milliers de mutations, les méthodes de simulations classiques comme la dynamique moléculaire, que ce soit à l'échelle atomique ou gros-grain, sont trop coûteuses pour la majorité des applications. D'autre part, les méthodes d'analyse de modes normaux de modèles de réseaux élastiques gros-grain (ENM pour "elastic network model") sont très rapides et procurent des solutions analytiques comprenant toutes les échelles de temps. Par contre, la majorité des ENMs considèrent seulement la géométrie du squelette biomoléculaire, ce qui en fait de mauvais choix pour étudier les effets de mutations qui ne changeraient pas cette géométrie. Le "Elastic Network Contact Model" (ENCoM) est le premier ENM sensible à la séquence de la biomolécule à l'étude, ce qui rend possible son utilisation pour l'exploration efficace d'espaces conformationnels complets de variants de séquence. La présente thèse introduit le pipeline computationel ENCoM-DynaSig-ML, qui réduit les espaces conformationnels prédits par ENCoM à des Signatures Dynamiques qui sont ensuite utilisées pour entraîner des modèles d'apprentissage machine simples. ENCoM-DynaSig-ML est capable de prédire la fonction de variants de séquence avec une précision significative, est complémentaire à toutes les méthodes existantes, et peut générer de nouvelles hypothèses à propos des éléments importants de dynamique structurelle pour une fonction moléculaire donnée. Nous présentons trois exemples d'étude de relations séquence-dynamique-fonction: la maturation des microARN, le potentiel d'activation de ligands du récepteur mu-opioïde et l'efficacité enzymatique de l'enzyme VIM-2 lactamase. Cette application novatrice de l'analyse des modes normaux est rapide, demandant seulement quelques secondes de temps de calcul par variant de séquence, et est généralisable à toute biomolécule pour laquelle des données expérimentale de mutagénèse sont disponibles. / The dynamics of biomolecules are intimately tied to their functions but experimentally elusive, making their computational study attractive. When modelling the effects of thousands of mutations, time-stepping methods such as classical or enhanced sampling molecular dynamics are too costly for most applications. On the other hand, normal mode analysis of coarse-grained elastic network models (ENMs) provides fast analytical dynamics spanning all timescales. However, the vast majority of ENMs consider backbone geometry alone, making them a poor choice to study point mutations which do not affect the equilibrium structure. The Elastic Network Contact Model (ENCoM) is the first sequence-sensitive ENM, enabling its use for the efficient exploration of full conformational spaces from sequence variants. The present work introduces the ENCoM-DynaSig-ML computational pipeline, in which the ENCoM conformational spaces are reduced to Dynamical Signatures and coupled to simple machine learning algorithms. ENCoM-DynaSig-ML predicts the function of sequence variants with significant accuracy, is complementary to all existing methods, and can generate new hypotheses about which dynamical features are important for the studied biomolecule's function. Examples given are the maturation efficiency of microRNA variants, the activation potential of mu-opioid receptor ligands and the effect of point mutations on VIM-2 lactamase's enzymatic efficiency. This novel application of normal mode analysis is very fast, taking a few seconds CPU time per variant, and is generalizable to any biomolecule on which experimental mutagenesis data exist.