INTRODUÇÃO. A hipertensão arterial sistêmica é uma doença cardiovascular comum que afeta cerca de 50 milhões de pessoas nos EUA, e um número proporcional a este no Brasil. Muitos estudos têm mostrado que diversas classes de diterpenóides exercem efeito significante sobre o sistema cardiovascular. Esses estudos apontam essa classe de metabólitos como uma fonte promissora de protótipos para o desenvolvimento de novos agentes na terapêutica cardiovascular. OBJETIVO. O presente estudo foi delineado de forma a investigar os mecanismos envolvidos no efeito cardiovascular (in vitro e in vivo) do diterpeno esclareol em ratos normotensos e hipertensos. MATERIAL E MÉTODOS. Foram utilizados ratos Wistar machos, pesando em média 250 - 300g provenientes do Biotério Central do Campus de Ribeirão Preto, Universidade de São Paulo (USP). Os animais foram acondicionados no Biotério do Departamento de Cirurgia e Anatomia, em ambiente com temperatura (22-25ºC) e ciclo claro/escuro (12:12 horas) controlados. Para a indução da hipertensão utilizou-se o modelo 2 rins - 1 clipe (artéria renal esquerda). A pressão arterial não invasiva da cauda foi avaliada utilizando-se um manguito, conectado a um sensor para registro de pressão arterial sistólica (Kent Scientific Corporation, Connecticut, USA). A monitorização da pressão arterial média foi realizada utilizando-se o MP System 100 A (BioPac System, Inc., Santa Barbara, CA, USA). A reatividade vascular in vitro foi estudada pela avaliação de curvas concentração-resposta para esclareol construídas a partir do registro de forças isométricas obtidas em anéis de aorta, com ou sem endotélio, pré-contraídos com Phe 10-7M em câmaras de órgãos (\"organ chambers\"). As dosagens indiretas de NO plasmático foram realizadas pela determinação dos níveis séricos de nitrito e nitrato utilizando-se o Sievers NOAnalizer 280i (Sievers, Boulder, CO, E.U.A.). Análise de variância de uma ou duas vias (ANOVA), seguida pelo pós-teste de Bonferroni foram realizadas para detectar possíveis diferenças entre os valores em estudo. P<0,05 foi considerado significativo. RESULTADOS. A análise do efeito do Esclareol sobre a ?PAS mostrou que, em ambos os grupos, houve uma importante redução da ?PAS. Os inibidores de óxido nítrico sintase e guanilato ciclase foram tão eficientes quanto a retirada do endotélio, em inibir o relaxamento induzido pelo esclareol. A análise das dosagens do NO plasmático mostrou que não houve diferença significante entre os grupos. CONCLUSÃO. A partir dos dados obtidos no presente estudo, conclui-se que o esclareol mostrou-se promissor quanto aos seus efeitos vasodilatadores, tanto in vivo quanto in vitro. Apesar disso, o esclareol não promoveu alterações do NO, possivelmente devido ao método utilizado / INTRODUCTION. High Blood Pressure is a common cardiovascular disease that affects about 50 million people in the US, and a proportionate number to this in Brazil. Many studies have shown that many diterpenoid classes exert significant effect on the cardiovascular system. These studies suggest these metabolites class as a promising source prototype for the development of new agents in the cardiovascular therapy. OBJECTIVE. This study was designed to investigate the mechanisms involved in cardiovascular effect (in vitro and in vivo) of diterpene esclareol in normotensive and hypertensive rats. MATERIAL AND METHODS. Male Wistar rats were used, weighing an average of 250 - 300g from the Central Animal Facility of the Campus of Ribeirão Preto, University of São Paulo (USP). The animals were kept in the animal house of the Department of Surgery and Anatomy in temperature environment (22-25ºC) and light / dark cycle (12:12 hours) controlled. For the induction of hypertension, the model was used two kidney - one clip (left renal artery). The tail noninvasive blood pressure was measured using a cuff, connected to a sensor for systolic arterial blood pressure ((Kent Scientific Corporation, Connecticut, USA). The monitoring of mean arterial blood pressure was measured using MP System 100 A (BioPac System, Inc., Santa Barbara, CA, USA). The in vitro vascular reactivity was evaluated by measuring concentration-response curves for sclareol built from the record of isometric forces obtained in aortic rings with or without endothelium precontracted with Phe 10-7M in organ chambers. The indirect plasma measurements of NO were carried out by determination of serum levels of nitrite and nitrate using the Sievers NOAnalizer 280i (Sievers, Boulder, CO, USA). One or two-way analysis of variance (ANOVA) followed by Bonferroni posttests were performed to detect possible differences between the values in the study. P <0.05 was considered significant. RESULTS. The analysis of the effect of Esclareol on ?PAS showed that there was a significant reduction in ?PAS in both groups. The nitric oxide synthase and soluble guanylate cyclase inhibitors were as efficient as the removal of endothelium, to inhibit relaxation induced by the sclareol. Analysis of the strengths of plasmatic showed no significant difference between groups. CONCLUSION. From the data obtained in this study, it is concluded that the sclareol showed promise as to their vasodilator effects, both in vivo and in-vitro. Nevertheless, the sclareol showed no change of NO, possibly due to the method used

INTRODUÇÃO. A hipertensão arterial sistêmica é uma doença cardiovascular comum que afeta cerca de 50 milhões de pessoas nos EUA, e um número proporcional a este no Brasil. Muitos estudos têm mostrado que diversas classes de diterpenóides exercem efeito significante sobre o sistema cardiovascular. Esses estudos apontam essa classe de metabólitos como uma fonte promissora de protótipos para o desenvolvimento de novos agentes na terapêutica cardiovascular. OBJETIVO. O presente estudo foi delineado de forma a investigar os mecanismos envolvidos no efeito cardiovascular (in vitro e in vivo) do diterpeno esclareol em ratos normotensos e hipertensos. MATERIAL E MÉTODOS. Foram utilizados ratos Wistar machos, pesando em média 250 - 300g provenientes do Biotério Central do Campus de Ribeirão Preto, Universidade de São Paulo (USP). Os animais foram acondicionados no Biotério do Departamento de Cirurgia e Anatomia, em ambiente com temperatura (22-25ºC) e ciclo claro/escuro (12:12 horas) controlados. Para a indução da hipertensão utilizou-se o modelo 2 rins - 1 clipe (artéria renal esquerda). A pressão arterial não invasiva da cauda foi avaliada utilizando-se um manguito, conectado a um sensor para registro de pressão arterial sistólica (Kent Scientific Corporation, Connecticut, USA). A monitorização da pressão arterial média foi realizada utilizando-se o MP System 100 A (BioPac System, Inc., Santa Barbara, CA, USA). A reatividade vascular in vitro foi estudada pela avaliação de curvas concentração-resposta para esclareol construídas a partir do registro de forças isométricas obtidas em anéis de aorta, com ou sem endotélio, pré-contraídos com Phe 10-7M em câmaras de órgãos (\"organ chambers\"). As dosagens indiretas de NO plasmático foram realizadas pela determinação dos níveis séricos de nitrito e nitrato utilizando-se o Sievers NOAnalizer 280i (Sievers, Boulder, CO, E.U.A.). Análise de variância de uma ou duas vias (ANOVA), seguida pelo pós-teste de Bonferroni foram realizadas para detectar possíveis diferenças entre os valores em estudo. P<0,05 foi considerado significativo. RESULTADOS. A análise do efeito do Esclareol sobre a ?PAS mostrou que, em ambos os grupos, houve uma importante redução da ?PAS. Os inibidores de óxido nítrico sintase e guanilato ciclase foram tão eficientes quanto a retirada do endotélio, em inibir o relaxamento induzido pelo esclareol. A análise das dosagens do NO plasmático mostrou que não houve diferença significante entre os grupos. CONCLUSÃO. A partir dos dados obtidos no presente estudo, conclui-se que o esclareol mostrou-se promissor quanto aos seus efeitos vasodilatadores, tanto in vivo quanto in vitro. Apesar disso, o esclareol não promoveu alterações do NO, possivelmente devido ao método utilizado / INTRODUCTION. High Blood Pressure is a common cardiovascular disease that affects about 50 million people in the US, and a proportionate number to this in Brazil. Many studies have shown that many diterpenoid classes exert significant effect on the cardiovascular system. These studies suggest these metabolites class as a promising source prototype for the development of new agents in the cardiovascular therapy. OBJECTIVE. This study was designed to investigate the mechanisms involved in cardiovascular effect (in vitro and in vivo) of diterpene esclareol in normotensive and hypertensive rats. MATERIAL AND METHODS. Male Wistar rats were used, weighing an average of 250 - 300g from the Central Animal Facility of the Campus of Ribeirão Preto, University of São Paulo (USP). The animals were kept in the animal house of the Department of Surgery and Anatomy in temperature environment (22-25ºC) and light / dark cycle (12:12 hours) controlled. For the induction of hypertension, the model was used two kidney - one clip (left renal artery). The tail noninvasive blood pressure was measured using a cuff, connected to a sensor for systolic arterial blood pressure ((Kent Scientific Corporation, Connecticut, USA). The monitoring of mean arterial blood pressure was measured using MP System 100 A (BioPac System, Inc., Santa Barbara, CA, USA). The in vitro vascular reactivity was evaluated by measuring concentration-response curves for sclareol built from the record of isometric forces obtained in aortic rings with or without endothelium precontracted with Phe 10-7M in organ chambers. The indirect plasma measurements of NO were carried out by determination of serum levels of nitrite and nitrate using the Sievers NOAnalizer 280i (Sievers, Boulder, CO, USA). One or two-way analysis of variance (ANOVA) followed by Bonferroni posttests were performed to detect possible differences between the values in the study. P <0.05 was considered significant. RESULTS. The analysis of the effect of Esclareol on ?PAS showed that there was a significant reduction in ?PAS in both groups. The nitric oxide synthase and soluble guanylate cyclase inhibitors were as efficient as the removal of endothelium, to inhibit relaxation induced by the sclareol. Analysis of the strengths of plasmatic showed no significant difference between groups. CONCLUSION. From the data obtained in this study, it is concluded that the sclareol showed promise as to their vasodilator effects, both in vivo and in-vitro. Nevertheless, the sclareol showed no change of NO, possibly due to the method used

O nervo depressor aórtico (NDA) é, primariamente, um conjunto de fibras aferentes que transmitem informações oriundas de alterações da pressão arterial (PA) a partir dos barorreceptores arteriais (mecanorreceptores localizados no arco da aorta ou seio carótico) aos centros de controle cardiovascular localizados no sistema nervoso central (SNC). Este mecanismo é responsável pela regulação reflexa da função cardíaca e vascular, promovendo ajustes nos centros vasoconstritor e vasodilatador, atuando simultaneamente sobre os sistemas simpático e parassimpático. Fato este que, contribui para o aumento da atividade vagal cardíaca e inibição de descargas simpáticas para vasos e coração, garantindo a manutenção dos níveis pressóricos dentro de uma faixa de normalidade. Diversos neurotransmissores foram descritos atuando nos centros de controle cardiocirculatório localizados no tronco encefálico, mais especificamente no bulbo, participando da regulação da PA. Nestas regiões centrais, os neurotransmissores glutamato, GABA (Àcido Gama Aminobutírico) e substância P (SP) foram amplamente investigados. Entretanto, em nenhum destes trabalhos foi realizado um estudo detalhado, investigando a presença da SP em nervos depressores aórticos de forma direta, sendo esta informação ainda desconhecida. Acredita-se que a SP seja um transmissor do reflexo barorreceptor, atuando na modulação deste circuito, na tentativa de atenuar elevações da pressão sanguínea. Existe portanto a necessidade de uma investigação morfológica e imunohistoquímica com o intuito de promover o esclarecimento sobre os neurotransmissores presentes no NDA. Os nervos frênicos foram utilizados como controle positivo, já que neste território a SP já se encontra caracterizada. Inúmeros são os estudos que descrevem a existência da SP em nervos frênicos, fato este que justifica a aplicação do referido nervo como controle do NDA, foco de estudo deste projeto. Baseados nestas necessidades, o objetivo do presente estudo foi primeiramente o de promover a padronização da técnica imunohistoquímica (IHQ), bem como a verificação da viabilidade de utilização do glutaraldeído à 2,5% como um fixativo primário, auxiliando na identificação de neurotransmissores dentro do sistema nervoso periférico. Em seguida, a identificação e quantificação da SP em NDA de ratos normotensos através do método imunohistoquímico indireto (3,3\'- Diaminobenzidina \"DAB\") foram realizados. O referido estudo foi desenvolvido em duas etapas. A primeira parte corresponde a padronização e otimização da técnica de imunohistoquímica em nervos frênicos de ratos Wistar através da localização e caracterização da SP e da enzima colina acetiltransferase (CAT). A segunda fase, trata-se da identificação e quantificação da SP no NDA, sendo este, um possível neurotransmissor ou neuromodulador do reflexo barorreceptor. Para este estudo foram utilizados no total 38 ratos da linhagem Wistar (Rattus Norvegicus), normotensos, com 20 semanas de idade, machos e fêmeas. Deste total, 16 animais machos foram destinados à padronização da técnica de IHQ em nervos frênicos. E para a caracterização e quantificação da SP no NDA foram utilizados 22 ratos Wistar, sendo 12 machos e 10 fêmeas. Nossos resultados demonstram de forma inédita a presença da SP em fibras amielínicas (tipo C) e fibras de pequeno diâmetro (A-delta) no NDA de forma bastante pontualizada em segmentos proximais e difusa distalmente, sugerindo a existência de subpopulações de fibras amielínicas do tipo C. Estes achados confirmam inúmeras suposições de que a SP atue como um dos neurotransmissores de aferências barorreceptoras, podendo participar na modulação do Sistema Nervoso Autônomo (SNA), uma vez que encontra-se localizada em centros responsáveis pela regulação reflexa da PA. Adicionalmente, a análise do percentual de marcação positiva à SP entre os gêneros apresentou um aparente predomínio da SP em machos mas sem diferença significativa entre os grupos. De forma semelhante, a padronização imunohistoquímica em cortes transversais e longitudinais de nervos frênicos apresentaram uma imunomarcação positiva e aleatória da SP em conjuntos de fibras amielínicas (tipo C) e em fibras de pequeno diâmetro localizadas próximo a periferia do espaço endoneural, corroborando com a localização relatada em estudos morfológicos e ultraestruturais, assegurando a especificidade e a reprodutibilidade do método. Distintamente, as fibras de grande e médio diâmetro (A-alfa, beta e gama), consideradas fibras mielinizadas de condução rápida, foram imunorreativas à CAT em nervos frênicos. Por fim, espera-se que a identificação deste neuropeptídeo sirva de gatilho para que futuras pesquisas envolvendo a liberação de neurotransmissores em aferências barorreceptoras sejam explorados. Fato este, que contribuirá para a agregação de informações pertinentes à modulação ou transmissão da informação neural, propiciando desta forma melhor entendimento da comunicação e atividades barorreflexas associadas a mecanismos cardiovasculares. / The aortic depressor nerve (ADN) is primarily a set of afferent fibers that transmit derived information of changes in arterial blood pressure (BP) from arterial baroreceptors (mechanoreceptors located in the aortic arch and carotid sinus) to sites of cardiovascular control located into central nervous system (CNS). This mechanism is responsible for the reflex regulation of cardiac and vascular function, promoting adjustments of vasoconstrictor and vasodilator centers, simultaneously acting on the sympathetic and parasympathetic systems. In addition, contributes to increased cardiac vagal activity and inhibition of sympathetic discharges to vessels and heart, ensuring the maintenance of blood pressure levels within the normal range. Many neurotransmitters have been described operating in cardio-circulatory control centers located in the brainstem, more specifically in the bulb, participating in the regulation of BP. In these central regions, the neurotransmitters glutamate, GABA (Gamma Aminobutyric Acid) and substance P (SP) have been widely investigated. However, none of these works was carried out a detailed study, investigating the presence of SP in aortic depressor nerves directly, and this information is still unknown. It is believed that SP can be a transmitter at the synapse of the baroreceptor reflex, operating in the modulation of this circuit in an attempt to attenuate elevation of blood pressure. Therefore, there is a need to investigate a morphological and immunohistochemical approach in order to promote the clarification on the present neurotransmitters into ADN. The phrenic nerves were used as a positive control, already as substance P (SP) is characterized in this territory. There have been numerous studies describing the existence of SP in phrenic nerves, a fact that justifies the application of the nerve as control of the ADN, study focus of this project. Based on these requirements, the aim of the present study is two-fold. Firstly, it attempts to promote the standardization of the immunohistochemical (IHC) technique as well as the verification of the feasibility of using glutaraldehyde fixative as a primary, assisting in the identification of neurotransmitters in the peripheral nervous system (PNS). Subsequently, the identification and quantification of SP immunoreactivity in the ADN of normotensive rats by indirect immunohistochemical method (3,3\'-Diaminobenzidine \"DAB\") were done. The study was developed in two stages. The first part corresponds to standardization and optimization of immunohistochemical technique in phrenic nerves of Wistar rats through location and characterization of the SP and enzyme choline acetyltransferase (ChAT). The second phase is about the identification and quantification of the SP into ADN, being a possible neurotransmitter or neuromodulator from the baroreceptor reflex. For this study we used a total of 38 Wistar rats (Rattus norvegicus), normotensive, 20 weeks old, male and female. From this total, 16 male animals were used for standardization of IHC technique in the phrenic nerves. Nonetheless, for the characterization and quantification of SP in ADN were used 22 Wistar rats, 12 males and 10 females. Our results showed an unprecedented manner the presence of SP in unmyelinated fibers (type C) and small diameter fibers (A-delta) into ADN, being quite focused on proximal segments and diffuse distally, suggesting the existence of subsets of unmyelinated fibers. These findings confirm numerous assumptions that the SP acts as a neurotransmitter from afferent baroreceptor and may participate in the modulation of the Autonomic Nervous System (ANS), since it is located in centers responsible for regulating reflex of BP. Further, an analysis of the percentage of positive SP staining between genders, presented an apparent predominance of SP in males but no significant difference between the groups were found. Similarly, IHC standardization in transverse and longitudinal sections of phrenic nerves showed a positive random and immunostaining of SP in sets of unmyelinated fibers (type C) and small diameter fibers located near the periphery of endoneural space, corroborating location reported on morphological and ultrastructural studies, ensuring the specificity and reproducibility of the method. Distinctly, the fibers of large and medium diameters (A-alpha, beta and gamma), considered myelinated fibers of fast conducting, were immunoreactive to ChAT in phrenic nerves. Finally, it is expected that the identification of neuropeptide serve as a trigger for that future studies involving the release of neurotransmitters into afferent baroreceptors be explored. These results could contribute to the aggregation of relevant information for the modulation and transmission of neural information, thus providing better understanding of communication and baroreflex activities associated with cardiovascular mechanisms.

O nervo depressor aórtico (NDA) é, primariamente, um conjunto de fibras aferentes que transmitem informações oriundas de alterações da pressão arterial (PA) a partir dos barorreceptores arteriais (mecanorreceptores localizados no arco da aorta ou seio carótico) aos centros de controle cardiovascular localizados no sistema nervoso central (SNC). Este mecanismo é responsável pela regulação reflexa da função cardíaca e vascular, promovendo ajustes nos centros vasoconstritor e vasodilatador, atuando simultaneamente sobre os sistemas simpático e parassimpático. Fato este que, contribui para o aumento da atividade vagal cardíaca e inibição de descargas simpáticas para vasos e coração, garantindo a manutenção dos níveis pressóricos dentro de uma faixa de normalidade. Diversos neurotransmissores foram descritos atuando nos centros de controle cardiocirculatório localizados no tronco encefálico, mais especificamente no bulbo, participando da regulação da PA. Nestas regiões centrais, os neurotransmissores glutamato, GABA (Àcido Gama Aminobutírico) e substância P (SP) foram amplamente investigados. Entretanto, em nenhum destes trabalhos foi realizado um estudo detalhado, investigando a presença da SP em nervos depressores aórticos de forma direta, sendo esta informação ainda desconhecida. Acredita-se que a SP seja um transmissor do reflexo barorreceptor, atuando na modulação deste circuito, na tentativa de atenuar elevações da pressão sanguínea. Existe portanto a necessidade de uma investigação morfológica e imunohistoquímica com o intuito de promover o esclarecimento sobre os neurotransmissores presentes no NDA. Os nervos frênicos foram utilizados como controle positivo, já que neste território a SP já se encontra caracterizada. Inúmeros são os estudos que descrevem a existência da SP em nervos frênicos, fato este que justifica a aplicação do referido nervo como controle do NDA, foco de estudo deste projeto. Baseados nestas necessidades, o objetivo do presente estudo foi primeiramente o de promover a padronização da técnica imunohistoquímica (IHQ), bem como a verificação da viabilidade de utilização do glutaraldeído à 2,5% como um fixativo primário, auxiliando na identificação de neurotransmissores dentro do sistema nervoso periférico. Em seguida, a identificação e quantificação da SP em NDA de ratos normotensos através do método imunohistoquímico indireto (3,3\'- Diaminobenzidina \"DAB\") foram realizados. O referido estudo foi desenvolvido em duas etapas. A primeira parte corresponde a padronização e otimização da técnica de imunohistoquímica em nervos frênicos de ratos Wistar através da localização e caracterização da SP e da enzima colina acetiltransferase (CAT). A segunda fase, trata-se da identificação e quantificação da SP no NDA, sendo este, um possível neurotransmissor ou neuromodulador do reflexo barorreceptor. Para este estudo foram utilizados no total 38 ratos da linhagem Wistar (Rattus Norvegicus), normotensos, com 20 semanas de idade, machos e fêmeas. Deste total, 16 animais machos foram destinados à padronização da técnica de IHQ em nervos frênicos. E para a caracterização e quantificação da SP no NDA foram utilizados 22 ratos Wistar, sendo 12 machos e 10 fêmeas. Nossos resultados demonstram de forma inédita a presença da SP em fibras amielínicas (tipo C) e fibras de pequeno diâmetro (A-delta) no NDA de forma bastante pontualizada em segmentos proximais e difusa distalmente, sugerindo a existência de subpopulações de fibras amielínicas do tipo C. Estes achados confirmam inúmeras suposições de que a SP atue como um dos neurotransmissores de aferências barorreceptoras, podendo participar na modulação do Sistema Nervoso Autônomo (SNA), uma vez que encontra-se localizada em centros responsáveis pela regulação reflexa da PA. Adicionalmente, a análise do percentual de marcação positiva à SP entre os gêneros apresentou um aparente predomínio da SP em machos mas sem diferença significativa entre os grupos. De forma semelhante, a padronização imunohistoquímica em cortes transversais e longitudinais de nervos frênicos apresentaram uma imunomarcação positiva e aleatória da SP em conjuntos de fibras amielínicas (tipo C) e em fibras de pequeno diâmetro localizadas próximo a periferia do espaço endoneural, corroborando com a localização relatada em estudos morfológicos e ultraestruturais, assegurando a especificidade e a reprodutibilidade do método. Distintamente, as fibras de grande e médio diâmetro (A-alfa, beta e gama), consideradas fibras mielinizadas de condução rápida, foram imunorreativas à CAT em nervos frênicos. Por fim, espera-se que a identificação deste neuropeptídeo sirva de gatilho para que futuras pesquisas envolvendo a liberação de neurotransmissores em aferências barorreceptoras sejam explorados. Fato este, que contribuirá para a agregação de informações pertinentes à modulação ou transmissão da informação neural, propiciando desta forma melhor entendimento da comunicação e atividades barorreflexas associadas a mecanismos cardiovasculares. / The aortic depressor nerve (ADN) is primarily a set of afferent fibers that transmit derived information of changes in arterial blood pressure (BP) from arterial baroreceptors (mechanoreceptors located in the aortic arch and carotid sinus) to sites of cardiovascular control located into central nervous system (CNS). This mechanism is responsible for the reflex regulation of cardiac and vascular function, promoting adjustments of vasoconstrictor and vasodilator centers, simultaneously acting on the sympathetic and parasympathetic systems. In addition, contributes to increased cardiac vagal activity and inhibition of sympathetic discharges to vessels and heart, ensuring the maintenance of blood pressure levels within the normal range. Many neurotransmitters have been described operating in cardio-circulatory control centers located in the brainstem, more specifically in the bulb, participating in the regulation of BP. In these central regions, the neurotransmitters glutamate, GABA (Gamma Aminobutyric Acid) and substance P (SP) have been widely investigated. However, none of these works was carried out a detailed study, investigating the presence of SP in aortic depressor nerves directly, and this information is still unknown. It is believed that SP can be a transmitter at the synapse of the baroreceptor reflex, operating in the modulation of this circuit in an attempt to attenuate elevation of blood pressure. Therefore, there is a need to investigate a morphological and immunohistochemical approach in order to promote the clarification on the present neurotransmitters into ADN. The phrenic nerves were used as a positive control, already as substance P (SP) is characterized in this territory. There have been numerous studies describing the existence of SP in phrenic nerves, a fact that justifies the application of the nerve as control of the ADN, study focus of this project. Based on these requirements, the aim of the present study is two-fold. Firstly, it attempts to promote the standardization of the immunohistochemical (IHC) technique as well as the verification of the feasibility of using glutaraldehyde fixative as a primary, assisting in the identification of neurotransmitters in the peripheral nervous system (PNS). Subsequently, the identification and quantification of SP immunoreactivity in the ADN of normotensive rats by indirect immunohistochemical method (3,3\'-Diaminobenzidine \"DAB\") were done. The study was developed in two stages. The first part corresponds to standardization and optimization of immunohistochemical technique in phrenic nerves of Wistar rats through location and characterization of the SP and enzyme choline acetyltransferase (ChAT). The second phase is about the identification and quantification of the SP into ADN, being a possible neurotransmitter or neuromodulator from the baroreceptor reflex. For this study we used a total of 38 Wistar rats (Rattus norvegicus), normotensive, 20 weeks old, male and female. From this total, 16 male animals were used for standardization of IHC technique in the phrenic nerves. Nonetheless, for the characterization and quantification of SP in ADN were used 22 Wistar rats, 12 males and 10 females. Our results showed an unprecedented manner the presence of SP in unmyelinated fibers (type C) and small diameter fibers (A-delta) into ADN, being quite focused on proximal segments and diffuse distally, suggesting the existence of subsets of unmyelinated fibers. These findings confirm numerous assumptions that the SP acts as a neurotransmitter from afferent baroreceptor and may participate in the modulation of the Autonomic Nervous System (ANS), since it is located in centers responsible for regulating reflex of BP. Further, an analysis of the percentage of positive SP staining between genders, presented an apparent predominance of SP in males but no significant difference between the groups were found. Similarly, IHC standardization in transverse and longitudinal sections of phrenic nerves showed a positive random and immunostaining of SP in sets of unmyelinated fibers (type C) and small diameter fibers located near the periphery of endoneural space, corroborating location reported on morphological and ultrastructural studies, ensuring the specificity and reproducibility of the method. Distinctly, the fibers of large and medium diameters (A-alpha, beta and gamma), considered myelinated fibers of fast conducting, were immunoreactive to ChAT in phrenic nerves. Finally, it is expected that the identification of neuropeptide serve as a trigger for that future studies involving the release of neurotransmitters into afferent baroreceptors be explored. These results could contribute to the aggregation of relevant information for the modulation and transmission of neural information, thus providing better understanding of communication and baroreflex activities associated with cardiovascular mechanisms.