BRITO, T. S. Atividade vasorrelaxante do 2-nitro-1-fenil-1-propanol em preparações vasculares isoladas de ratos. 2015. 108 f. Tese (Doutorado em Farmacologia) - Faculdade de Medicina, Universidade Federal do Ceará, Fortaleza, 2015. / Submitted by Erika Fernandes (erikaleitefernandes@gmail.com) on 2015-11-05T13:50:43Z No. of bitstreams: 1 2015_tese_tsbrito.pdf: 2302175 bytes, checksum: 7172b4cc84d7726d7a04784392130264 (MD5) / Approved for entry into archive by Erika Fernandes(erikaleitefernandes@gmail.com) on 2015-11-05T13:50:54Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2015_tese_tsbrito.pdf: 2302175 bytes, checksum: 7172b4cc84d7726d7a04784392130264 (MD5) / Made available in DSpace on 2015-11-05T13:50:54Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2015_tese_tsbrito.pdf: 2302175 bytes, checksum: 7172b4cc84d7726d7a04784392130264 (MD5) Previous issue date: 2015-09-01 / 2-Nitro-1-phenyl-1-propanol (NPP) is a nitro-alcohol used as a chemical intermediate in the synthesis of ephedrine and norephedrine, sympathomimetic agonists. Its chemical structure resembles the norephedrine, with replacement of the NH2 group by NO2. The presence of the nitro group led us to consider that this compound is able of produce vasodilatory effect, since it was demonstrated in a previous study the vasodilator actions of the nitro compound 1-nitro-2-phenylethane, resulting from stimulation of the guanylate cyclase-cGMP pathway. Our aim was to characterize the effect of on rat isolated vessels. Isometric contractions of isolated rings of thoracic aorta or 2nd-3rd generation branchs mesenteric artery of Wistar rats were recorded by data acquisition system. Cyclic nucleotide levels were measured by ELISA. Signals of strength and calcium fluorescence were simultaneously captured in confocal microscope connected to the data acquisition system. On isolated aorta with intact endothelium, NPP relaxed preparations contracted with phenylephrine (1 µM), K+ (60 mM) or U-46619 (0.3 µM) with EC50 of 30.2 [25.5 - 35.7], 31.8 [27.1 - 37.3] and 28.5 [23.1 - 35.2] µM, respectively. Conversely, in mesenteric vessels, NPP relaxed preparations contracted with phenylephrine (10 µM), K+ (60 mM) or U-46619 (1 µM) with EC50 of 0.41 [0.31 - 0.55], 0.16 [0.10 - 0.24] and 15.1 [10.4 - 24.4] µM, respectively, showing higher potency of NPP in these tissues. The extracellular K+ concentration increase produced gradual decrease in the relaxant effect of the NPP in mesenteric vessels. Pre-treatment with TEA had no effect in the relaxant effect of NPP in aortic rings, however, pretreated mesenteric vessels with TEA, BaCl2, CsCl ou apamin responded less to NPP. Pre-treatment with indomethacin, glybenclamide, 4-aminopyridine or L-NAME did not affect the vasorelaxant effect of the NPP in either aorta or mesenteric vessels. However, its potency was significantly reduced by ODQ (guanylate cyclase inhibitor), MDL-12,330A (adenylate cyclase inhibitor), H-89 (PKA inhibitor) or bisindolylmaleimide IV (PKC inhibitor) pre-treatment. NPP inhibited the vasoconstriction induced by Ca2+ in aorta pre-contracted with phenylephrine or K+, an effect prevented by pretreatment with ODQ or MDL-12,330A. Furthermore, NPP showed a tendency to increase the levels of cAMP and cGMP in aortic rings. The vasorelaxant activity of the NPP was higher in the presence of Y-27632, a Rho- kinase inhibitor. In mesenteric vessels, NPP inhibited both the strength and the calcium fluorescence intensity, indicating that this compound is able to decrease the cytosolic concentration of this ion. So, NPP has vasodilatory action with higher potency in mesenteric vessels. The mechanisms involved in it effect appear to involve the participation of cyclic nucleotides, the control of Ca2+ influx and the regulation of sensitivity of contractile filaments to Ca2+. Moreover, evidences support that the opening of potassium channels is involved in it effect in mesenteric vessels, but not in aortic. / 2-Nitro-1-fenil-1-propanol (NFP) é um nitro-álcool utilizado como intermediário químico na síntese de norefedrina e efedrina, agonistas simpatomiméticos. Sua estrutura química assemelha-se com a da norefedrina, com substituição do grupo NH2 pelo NO2. A presença do grupo nitro nos levou a hipótese deste composto ser capaz de produzir efeito vasodilatador, visto que foi demonstrada em estudo prévio a ação vasodilatadora do nitrocomposto 1-nitro-2-feniletano, resultante da estimulação da via guanilil ciclase-GMPc. Assim, nosso objetivo foi caracterizar o efeito do NFP em preparações vasculares isoladas de ratos. Contrações isométricas de anéis isolados da aorta torácica ou de ramos de 2ª-3ª geração da artéria mesentérica de ratos Wistar com ou sem endotélio funcional foram registradas por sistema de aquisição de dados. Níveis de nucleotídeos cíclicos foram medidos por ELISA. Sinais de fluorescência ao Ca2+ e de força foram capturados simultaneamente em microscópio confocal acoplado a sistema de aquisição de dados. Em anéis de aorta isolada com endotélio intacto, NFP relaxou preparações contraídas com fenilefrina (1 µM), K+ (60 mM) ou U-46619 (0,3 µM) com CE50 de 30,2 [25,5 - 35,7], 31,8 [27,1-37,3] e 28,5 [23,1-35,2] µM, respectivamente. Por outro lado, em vasos mesentéricos, NFP relaxou as preparações contraídas com fenilefrina (10 µM), K+ (60 mM) ou U-46619 (1 µM) com CE50 de 0,41 [0,31-0,55], 0,16 [0,10-0,24] e 15,1 [10,4-24,4] µM, respectivamente, indicando maior potência do NFP nesses tecidos. O aumento da concentração extracelular de K+ produziu diminuição gradual do efeito relaxante do NFP em vasos mesentéricos. O pré-tratamento com TEA não afetou o efeito relaxante do NFP em anéis de aorta, contudo, vasos mesentéricos pré-tratados com TEA, BaCl2, CsCl ou apamina responderam menos ao NFP. Pré-tratamento com indometacina, glibenclamida, 4-aminopiridina ou L-NAME não alterou seu efeito relaxante em ambas as preparações. Em contrapartida, sua potência foi significativamente reduzida pelo tratamento prévio com ODQ (inibitor de guanilil ciclase), MDL 12,330A (inibitor de adenilil ciclase), H-89 (inibitor de PKA) ou bisindolilmaleimida IV (inibitor de PKC). NFP inibiu a vasoconstrição induzida por Ca2+ em aorta pré-contraída com fenilefrina ou K+, efeito prevenido pelo pré-tratamento com ODQ ou MDL-12,330A. Além disso, NFP apresentou uma tendência para o aumento dos níveis de GMPc e AMPc em anéis de aorta. A atividade vasorrelaxante do NFP foi maior na presença do Y-27632, inibidor de Rho-cinase. Em vasos mesentéricos, NFP inibiu simultaneamente a força e a intensidade de fluorescência ao Ca2+, indicando que este composto é capaz de diminuir a concentração citossólica deste íon. Portanto, NFP possui ação vasodilatadora de maior potência em vasos mesentéricos. Os mecanismos envolvidos em seu efeito parecem envolver a participação dos nucleotídeos cíclicos, o controle do influxo de Ca2+ e a regulação da sensibilidade dos filamentos contráteis ao Ca2+ e o controle do influxo de Ca2+. Além disso, evidências apontam que a abertura de canais para potássio parece estar envolvida no seu efeito em vasos mesentéricos, mas não em aórticos.

Os pacientes que usam lítio (Li) para tratamento do transtorno bipolar freqüentemente apresentam poliúria e deficiência de concentração urinária, sintomas do Diabetes Insipidus nefrogênico (DIN). Animais tratados com Li apresentam baixos níveis de produção de adenosina monofosfato cíclico (AMPc) em resposta ao hormônio antidiurético (HAD). O Sildenafil (Sil), um inibidor da fosfodiesterase 5 (PDE5), eleva os níveis intracelulares de guanosina monofosfato cíclico (GMPc), levando a inserção de aquaporina 2 (AQP2) na membrana plasmática das células do ducto coletor. Portanto, inibidores de PDE podem promover a inserção de AQP2 na membrana plasmática mesmo sem a ativação do receptor de HAD, indicando a participação de uma via alternativa mediada pelo GMPc. Nós investigamos o efeito do Sil na expressão renal das proteínas de membrana AQP2, UT-A1, NKCC2, NHE3, P-ENaC em ratos com DIN induzido pelo Li. Ratos Wistar foram divididos nos seguintes grupos: grupo controle, recebendo dieta alimentar normal durante quatro semanas; grupo Li, recebendo dieta alimentar normal com 40 mmol Li por quilo de dieta durante quatro semanas; grupo Li + Sil, recebendo dieta alimentar normal com 40 mmol Li por quilo de dieta durante quatro semanas e 200 mg por quilo de dieta de Sil a partir da segunda semana; grupo Sil, recebendo dieta alimentar normal durante a primeira semana e a partir da segunda semana recebendo dieta normal com 200 mg de Sil por quilo de dieta. Os animais do grupo Li desenvolveram poliúria, diminuição da osmolalidade urinária e diminuição da expressão da AQP2. No grupo Li+Sil, o Sil foi capaz de reverter parcialmente a poliúria, diminuir o clearance de água livre, aumentar a osmolalidade urinária e aumentar a expressão da AQP2. A expressão de UTA1 foi completamente normalizada com o tratamento com Sil. A expressão das proteínas NKCC2 e NHE3 apresentaram-se aumentadas no grupo tratado com Li, e o Sil não foi capaz de reverter tal alteração. Além disso, o tratamento com Sil reverteu completamente o aumento da resistência vascular renal. Assim, concluímos que o tratamento com Sil em ratos com DIN melhora a poliúria, aumenta a smolalidade urinária e diminui o clearance de água livre pelo aumento da expressão de AQP2 e UT-A1. O tratamento com Sil pode ser benéfico para pacientes que sofrem com DIN induzida pelo Li. / Patients taking lithium to treat bipolar disorder often present polyuria and urinary concentrating defect. In addition, lithium-treated animals present lower cyclic adenosine monophosphate production in response to vasopressin. Sildenafil (Sil), a phosphodiesterase 5 (PDE5) inhibitor, elevates intracellular cyclic guanosine monophosphate (cGMP) levels, leading to plasma membrane accumulation of aquaporin 2 (AQP2). Therefore, PDE inhibitors might induce AQP2 membrane insertion even without vasopressin receptor activation by activating a parallel cGMP-mediated signal transduction pathway. We investigated the effect of sildenafil on renal expression of AQP2, UT-A1, sodium/hydrogen exchanger (NHE3), type 1 bumetanide-sensitive Na-K-2Cl cotransporter (NKCC2), and the epithelial sodium channel alpha subunit (P-ENaC). Wistar rats received lithium (40 mmol/kg food) or not for 4 weeks (Li or control), some rats also receiving sildenafil (200 mg/kg food) in weeks 2-4, with or without lithium (Li+Sil or Sil). In Li+Sil rats, urine output was markedly lower, as was water free clearance, whereas urine osmolality was higher. Semiquantitative immunoblotting revealed the following: AQP2 expression was partially normalized; UT-A1 expression was completely normalized; expression of NKCC2 and NHE3 was significantly higher in Li rats (although not significantly different between Li+Sil rats and Li rats); and P-ENaC protein expression was unaltered in all groups. Sildenafil treatment completely reversed the lithium-induced increase in renal vascular resistance. In conclusion, sildenafil treatment of lithium-induced nephrogenic diabetes insipidus (NDI) improves polyuria, increases urinary osmolality, and decreases free water clearance via upregulation of renal AQP2 and UT-A1. Sildenafil treatment could be beneficial in patients with lithium-induced NDI.

Os pacientes que usam lítio (Li) para tratamento do transtorno bipolar freqüentemente apresentam poliúria e deficiência de concentração urinária, sintomas do Diabetes Insipidus nefrogênico (DIN). Animais tratados com Li apresentam baixos níveis de produção de adenosina monofosfato cíclico (AMPc) em resposta ao hormônio antidiurético (HAD). O Sildenafil (Sil), um inibidor da fosfodiesterase 5 (PDE5), eleva os níveis intracelulares de guanosina monofosfato cíclico (GMPc), levando a inserção de aquaporina 2 (AQP2) na membrana plasmática das células do ducto coletor. Portanto, inibidores de PDE podem promover a inserção de AQP2 na membrana plasmática mesmo sem a ativação do receptor de HAD, indicando a participação de uma via alternativa mediada pelo GMPc. Nós investigamos o efeito do Sil na expressão renal das proteínas de membrana AQP2, UT-A1, NKCC2, NHE3, P-ENaC em ratos com DIN induzido pelo Li. Ratos Wistar foram divididos nos seguintes grupos: grupo controle, recebendo dieta alimentar normal durante quatro semanas; grupo Li, recebendo dieta alimentar normal com 40 mmol Li por quilo de dieta durante quatro semanas; grupo Li + Sil, recebendo dieta alimentar normal com 40 mmol Li por quilo de dieta durante quatro semanas e 200 mg por quilo de dieta de Sil a partir da segunda semana; grupo Sil, recebendo dieta alimentar normal durante a primeira semana e a partir da segunda semana recebendo dieta normal com 200 mg de Sil por quilo de dieta. Os animais do grupo Li desenvolveram poliúria, diminuição da osmolalidade urinária e diminuição da expressão da AQP2. No grupo Li+Sil, o Sil foi capaz de reverter parcialmente a poliúria, diminuir o clearance de água livre, aumentar a osmolalidade urinária e aumentar a expressão da AQP2. A expressão de UTA1 foi completamente normalizada com o tratamento com Sil. A expressão das proteínas NKCC2 e NHE3 apresentaram-se aumentadas no grupo tratado com Li, e o Sil não foi capaz de reverter tal alteração. Além disso, o tratamento com Sil reverteu completamente o aumento da resistência vascular renal. Assim, concluímos que o tratamento com Sil em ratos com DIN melhora a poliúria, aumenta a smolalidade urinária e diminui o clearance de água livre pelo aumento da expressão de AQP2 e UT-A1. O tratamento com Sil pode ser benéfico para pacientes que sofrem com DIN induzida pelo Li. / Patients taking lithium to treat bipolar disorder often present polyuria and urinary concentrating defect. In addition, lithium-treated animals present lower cyclic adenosine monophosphate production in response to vasopressin. Sildenafil (Sil), a phosphodiesterase 5 (PDE5) inhibitor, elevates intracellular cyclic guanosine monophosphate (cGMP) levels, leading to plasma membrane accumulation of aquaporin 2 (AQP2). Therefore, PDE inhibitors might induce AQP2 membrane insertion even without vasopressin receptor activation by activating a parallel cGMP-mediated signal transduction pathway. We investigated the effect of sildenafil on renal expression of AQP2, UT-A1, sodium/hydrogen exchanger (NHE3), type 1 bumetanide-sensitive Na-K-2Cl cotransporter (NKCC2), and the epithelial sodium channel alpha subunit (P-ENaC). Wistar rats received lithium (40 mmol/kg food) or not for 4 weeks (Li or control), some rats also receiving sildenafil (200 mg/kg food) in weeks 2-4, with or without lithium (Li+Sil or Sil). In Li+Sil rats, urine output was markedly lower, as was water free clearance, whereas urine osmolality was higher. Semiquantitative immunoblotting revealed the following: AQP2 expression was partially normalized; UT-A1 expression was completely normalized; expression of NKCC2 and NHE3 was significantly higher in Li rats (although not significantly different between Li+Sil rats and Li rats); and P-ENaC protein expression was unaltered in all groups. Sildenafil treatment completely reversed the lithium-induced increase in renal vascular resistance. In conclusion, sildenafil treatment of lithium-induced nephrogenic diabetes insipidus (NDI) improves polyuria, increases urinary osmolality, and decreases free water clearance via upregulation of renal AQP2 and UT-A1. Sildenafil treatment could be beneficial in patients with lithium-induced NDI.

Os pacientes que usam lítio (Li) para tratamento do transtorno bipolar frequentemente apresentam poliúria e deficiência de concentração urinária, sintomas do Diabetes Insipidus Nefrogênico (DIN). Animais tratados com Li apresentam baixos níveis de produção de adenosina monofosfato cíclico (AMPc) em resposta ao hormônio antidiurético (HAD). O Sildenafil (Sil), um inibidor da fosfodiesterase 5 (PDE5), eleva os níveis intracelulares de guanosina monofosfato cíclico (GMPc), levando a inserção de aquaporina 2 (AQP2) na membrana plasmática das células do ducto coletor. Portanto, inibidores de PDE podem promover a inserção de AQP2 na membrana plasmática mesmo sem a ativação do receptor de HAD, indicando a participação de uma via alternativa mediada pelo GMPc. Nós investigamos as vias de ação do Sil no tratamento da DIN induzida pelo Li. Ratos Wistar foram divididos nos seguintes grupos: grupo controle, recebendo dieta alimentar normal durante quatro semanas; grupo Li, recebendo dieta alimentar normal com 40 mmol Li por quilo de dieta durante quatro semanas; grupo Li + Sil, recebendo dieta alimentar normal com 40 mmol Li por quilo de dieta durante quatro semanas e 200 mg por quilo de dieta de Sil a partir da segunda semana; grupo Sil, recebendo dieta alimentar normal durante a primeira semana e a partir da segunda semana recebendo dieta normal com 200 mg de Sil por quilo de dieta. Os animais do grupo Li desenvolveram poliúria, diminuição da osmolalidade urinária e diminuição da expressão da AQP2 tanto na fração citoplasmática como de membrana celular e o Sil reverteu essas alterações. Demonstramos ainda que a concentração de GMPc intracelular estava aumentada nos túbulos papilares tratados com Sil. Observamos que a provável via de fosforilação da AQP2 induzida pelo GMPc é pela PKA. Além disso, o tratamento com Sil aumenta a expressão de pCreb, fator de transcrição para ativação do gene da AQP2. Observamos ainda que o Li diminui a expressão de eNOS e o tratamento com Sil normaliza essa diminuição. Assim, concluímos que o tratamento com Sil em ratos com DIN melhora a poliúria aumentando a produção e a inserção de AQP2. O tratamento com Sil pode ser benéfico para pacientes que sofrem com DIN induzido pelo Li / Patients taking lithium to treat bipolar disorder often present polyuria and urinary concentrating defect. In addition, lithium-treated animals present lower cyclic adenosine monophosphate production in response to vasopressin. Sildenafil (Sil), a phosphodiesterase 5 (PDE5) inhibitor, elevates intracellular cyclic guanosine monophosphate (cGMP) levels, leading to plasma membrane accumulation of aquaporin 2 (AQP2). Therefore, PDE inhibitors might induce AQP2 membrane insertion even without vasopressin receptor activation by activating a parallel cGMP-mediated signal transduction pathway. We investigated Sil pathways of action in rats with lithium-induced nephrogenic Diabetes Insipidus (NDI). Wistar rats received lithium (40 mmol/kg food) or not for 4 weeks (Li or control), some rats also receiving sildenafil (200 mg/kg food) in weeks 2-4, with or without lithium (Li+Sil orSil). Animals in Li group developed polyuria, decreased urinary osmolality and decreased expression of AQP2 in both the cytoplasmic fraction and the cell membrane and Sil reversed these changes. We also demonstrated that intracellular cGMP concentration was increased in papillary tubules treated with Sil. We found that PKA may be involved in the pathway of cGMP induced AQP2 phosphorylation. In addition, Sil treatment increases Creb phosphorylation. Creb phosphorylation, acts as AQP2 gene transcription factor. We also observed that Li decreases eNOS expression and treatment with Sil normalizes this alteration. We conclude that Sil treatment improves polyuria by increasing production and insertion of AQP2. Sil treatment may be beneficial to patients suffering from induced DIN Li

Os pacientes que usam lítio (Li) para tratamento do transtorno bipolar frequentemente apresentam poliúria e deficiência de concentração urinária, sintomas do Diabetes Insipidus Nefrogênico (DIN). Animais tratados com Li apresentam baixos níveis de produção de adenosina monofosfato cíclico (AMPc) em resposta ao hormônio antidiurético (HAD). O Sildenafil (Sil), um inibidor da fosfodiesterase 5 (PDE5), eleva os níveis intracelulares de guanosina monofosfato cíclico (GMPc), levando a inserção de aquaporina 2 (AQP2) na membrana plasmática das células do ducto coletor. Portanto, inibidores de PDE podem promover a inserção de AQP2 na membrana plasmática mesmo sem a ativação do receptor de HAD, indicando a participação de uma via alternativa mediada pelo GMPc. Nós investigamos as vias de ação do Sil no tratamento da DIN induzida pelo Li. Ratos Wistar foram divididos nos seguintes grupos: grupo controle, recebendo dieta alimentar normal durante quatro semanas; grupo Li, recebendo dieta alimentar normal com 40 mmol Li por quilo de dieta durante quatro semanas; grupo Li + Sil, recebendo dieta alimentar normal com 40 mmol Li por quilo de dieta durante quatro semanas e 200 mg por quilo de dieta de Sil a partir da segunda semana; grupo Sil, recebendo dieta alimentar normal durante a primeira semana e a partir da segunda semana recebendo dieta normal com 200 mg de Sil por quilo de dieta. Os animais do grupo Li desenvolveram poliúria, diminuição da osmolalidade urinária e diminuição da expressão da AQP2 tanto na fração citoplasmática como de membrana celular e o Sil reverteu essas alterações. Demonstramos ainda que a concentração de GMPc intracelular estava aumentada nos túbulos papilares tratados com Sil. Observamos que a provável via de fosforilação da AQP2 induzida pelo GMPc é pela PKA. Além disso, o tratamento com Sil aumenta a expressão de pCreb, fator de transcrição para ativação do gene da AQP2. Observamos ainda que o Li diminui a expressão de eNOS e o tratamento com Sil normaliza essa diminuição. Assim, concluímos que o tratamento com Sil em ratos com DIN melhora a poliúria aumentando a produção e a inserção de AQP2. O tratamento com Sil pode ser benéfico para pacientes que sofrem com DIN induzido pelo Li / Patients taking lithium to treat bipolar disorder often present polyuria and urinary concentrating defect. In addition, lithium-treated animals present lower cyclic adenosine monophosphate production in response to vasopressin. Sildenafil (Sil), a phosphodiesterase 5 (PDE5) inhibitor, elevates intracellular cyclic guanosine monophosphate (cGMP) levels, leading to plasma membrane accumulation of aquaporin 2 (AQP2). Therefore, PDE inhibitors might induce AQP2 membrane insertion even without vasopressin receptor activation by activating a parallel cGMP-mediated signal transduction pathway. We investigated Sil pathways of action in rats with lithium-induced nephrogenic Diabetes Insipidus (NDI). Wistar rats received lithium (40 mmol/kg food) or not for 4 weeks (Li or control), some rats also receiving sildenafil (200 mg/kg food) in weeks 2-4, with or without lithium (Li+Sil orSil). Animals in Li group developed polyuria, decreased urinary osmolality and decreased expression of AQP2 in both the cytoplasmic fraction and the cell membrane and Sil reversed these changes. We also demonstrated that intracellular cGMP concentration was increased in papillary tubules treated with Sil. We found that PKA may be involved in the pathway of cGMP induced AQP2 phosphorylation. In addition, Sil treatment increases Creb phosphorylation. Creb phosphorylation, acts as AQP2 gene transcription factor. We also observed that Li decreases eNOS expression and treatment with Sil normalizes this alteration. We conclude that Sil treatment improves polyuria by increasing production and insertion of AQP2. Sil treatment may be beneficial to patients suffering from induced DIN Li