TRBP (TAR RNA Binding Protein), est un facteur activateur de la réplication du Virus de l'Immunodéficience Humaine de type 1 (VIH-1). Cette protéine cellulaire qui interagit avec les ARN double brins est connue pour son rôle crucial dans la voie des miRNA. Isolée pour sa capacité à interagir avec la séquence leader TAR présente à l'extrémité 5' de tous les ARN du VIH-1, TRBP favorise la réplication du VIH-1 au niveau post-transcriptionnel, en partie via l'inhibition de la PKR (Protéine Kinase ARN dépendante).Dans le but de mieux comprendre les mécanismes moléculaires par lesquels TRBP facilite la réplication du VIH-1, le complexe protéique associé à TRBP a été purifié par immunoprécipitation par double affinité et identifié par spectrométrie de masse. En plus des facteurs déjà connus, un nouveau partenaire à activité ARN 2'-O-méthyltransférase (2'-OMTase) potentielle a été copurifié : la protéine FTSJ3. Chez les eucaryotes supérieurs, deux 2'-OMTases permettent la méthylation des ARNm cellulaires au niveau de la position ribose 2'-O- du premier (coiffe 1) et du deuxième nucléotide (coiffe 2). Cette coiffe 1/2 est une signature moléculaire permettant de discriminer les ARNm endogènes et exogènes. Dans la cellule, MDA5, un senseur cytoplasmique, reconnait les ARN exogènes non coiffés et déclenche la production d'interférons (IFNs) de type I pour établir un état antiviral. Pour échapper à la réponse immune innée, certains virus ont développé des mécanismes leur permettant de mimer une coiffe 1/2.Le VIH ne code pas pour une activité 2'-OMTase. Cependant FTSJ3, de par son interaction avec TRBP, se retrouve à proximité de l'extrémité 5' de l'ARN viral. Cette 2'-OMTase méthyle l'ARN TAR in vitro, qui, transfecté dans les cellules monocytaires humaines U937 n'induit plus la production d'IFNs de type I. A l'inverse, le virus VIH-1 produit en l'absence de FTSJ3 déclenche une induction de l'expression des IFNs de type I dépendante de MDA5 dans les cellules U937. L'expression de ce virus est atténuée suite à un défaut d'import nucléaire. Ainsi, ces travaux montrent que la protéine FTSJ3, recrutée au niveau de l'extrémité 5' de l'ARN du VIH-1 par TRBP, facilite la réplication du VIH-1 en assurant la synthèse d'une coiffe 1/2 qui permet au VIH-1 d'échapper à la reconnaissance par le senseur MDA5 et à l'induction des IFNs de type I. Cette étude met en évidence un nouveau mécanisme permettant au VIH-1 d'échapper à la détection par le système d'immunité innée cellulaire. / TRBP (TAR RNA Binding Protein) is a cellular RNA binding protein that facilitates the replication of Human Immunodeficiency Virus type 1 (HIV-1). Isolated for its ability to bind HIV-1 TAR sequence present at the 5' end of all HIV-1 RNA, TRBP promotes HIV-1 replication at a post-transcriptional level by counteracting the antiviral activity of the protein kinase R (PKR).To gain more insight on how TRBP enhances HIV-1 replication, TRBP associated factors were purified using tandem immunoaffinity purification and identified by mass spectrometry. In addition to already known associated factors, a new protein with a putative RNA 2'-O-methyltransferase activity (2'OMTases) was copurified: FTSJ3. In higher eukaryotes, cellular mRNA are methylated on 2'-O ribose position on the first (Cap 1) and second nucleotide (Cap 2). This capping provides a molecular signature for the discrimination of endogenous versus exogenous mRNA. In the cell, MDA5, a cytoplasmic sensor, recognizes exogenous uncapped RNA and activate type I interferons (IFNs) production to establish an antiviral state. To evade innate immune response, some viruses have evolved mechanisms to mimics cap 1/2.HIV-1 does not encode a 2'O-MTase activity. However, owing to its interaction with TRBP, FTSJ3 is recruited at the 5' end of the viral genome and methylates TAR RNA in vitro. When capped by FTSJ3, TAR does not induce type I IFNs anymore when transfected in monocytic cell line U937. Conversely, HIV-1 viruses produced in FTSJ3 knock-down cells triggers type I IFNs expression through MDA5 sensing. This virus is attenuated, expressed in low amounts because of a block at the level of HIV-1 nuclear import. This study shows that FTSJ3 is recruited to HIV-1 5' end TAR sequence by TRBP and facilitates HIV-1 replication. HIV-1 RNA capping allows HIV-1 escape from MDA5 sensing and type I IFN induction. This study highlights a new way of HIV-1 escape from innate immune system.

La récente définition de Brachypodium distachyon comme modèle des graminées en fait un organisme de choix pour l'étude de leur paroi cellulaire, en particulier dans le cadre de leur utilisation comme matière première renouvelable pour le bioéthanol de seconde génération. Les lignines, dont les trois unités (H, G et S) proviennent de la polymérisation des monolignols, sont associées aux acides hydroxycinnamiques dans la paroi des céréales et représentent l'obstacle majeur à l'exploitation industrielle de la biomasse lignocellulosique. L'acquisition de connaissances sur les mécanismes dirigeant leur mise en place et leur organisation permettrait d'identifier des facteurs modulant les rendements de production qui y sont associés. Quatre familles de gènes ont été étudiées et l'implication dans la voie de biosynthèse des monolignols de trois gènes a été montrée : BdF5H2 possède une activité férulate-5-hydroxylase permettant la synthèse des précurseurs des unités S des lignines, BdCOMT3 est l'isoforme principale des acide cafféique O-Méthyltransférases et sa perte partielle de fonction cause une diminution de la quantité de lignine, la modification du rapport S/G et une baisse de quantité d'acide p-coumarique dans deux lignées mutantes indépendantes. Enfin, BdCAD1 est l'isoforme principale des alcools cinnamylique déshydrogénases : sa perte de fonction dans deux lignées indépendantes cause la diminution de la quantité globale de lignine et d'acide p-coumarique, une baisse du rapport S/G ainsi que l'accumulation de sinapaldéhyde. Par ailleurs ces deux lignées présentent des rendements de saccharification augmentés de plus d'un quart par rapport au sauvage.

Les stilbènes sont les métabolites de défense majeurs de la vigne, qui sont également connus pour leurs nombreuses propriétés pharmacologiques. Tirant parti du récent séquençage du génome de la vigne, l’objectif de ce travail est de caractériser les familles de gènes impliqués dans la biosynthèse des stilbènes chez la vigne, et de préciser leur rôle dans les défenses contre le mildiou (Plasmopara viticola). La première étape de la biosynthèse des stilbènes est catalysée par la stilbène synthase (STS), pour former le resvératrol. L’analyse détaillée du génome de la vigne a permis d’identifier 48 gènes STS, dont 32 gènes potentiellement fonctionnels. La caractérisation fonctionnelle d’une sélection de gènes représentatifs de la diversité de la famille suggère que l’ensemble des 32 gènes STS code pour des protéines ayant réellement une activité stilbène synthase. L’analyse évolutive des gènes STS montre que la famille est très contrainte, sans trace de néo-fonctionnalisation. La famille des STS de la vigne représente donc un exemple unique d’une famille de plus de 30 gènes codant pour des protéines de fonction identique, et la signification biologique de cette expansion est discutée. Une seconde enzyme importante du métabolisme des stilbènes est la resvératrol O-méthyltransférase (ROMT). La ROMT est impliquée dans la méthylation du resvératrol pour former le ptérostilbène, un composé hautement fongitoxique qui pourrait jouer un rôle important dans les mécanismes de défenses de la vigne. Notre analyse de la famille ROMT montre qu’elle est constituée de 17 gènes, dont deux seulement (VvROMT1 et VvROMT2) semblent impliqués dans la synthèse de ptérostilbène. L’expression de ces deux gènes est induite suite à une infection par P. viticola au niveau des feuilles de vigne. Deux autres gènes de la famille, VvROMT12 et VvROMT13, sont exprimés constitutivement au niveau des racines, et ne semblent pas répondre au stress. Des analyses métabolomiques sur des plants de Nicotiana benthamiana transgéniques exprimant ces deux ROMT ainsi que des tests enzymatiques in vitro ont été réalisés afin de déterminer la fonction des gènes ROMT12 et 13. L’ensemble de ces résultats fait apparaître une amplification remarquable des gènes impliqués dans la synthèse des stilbènes chez la vigne et ouvrent la voie à l’étude détaillée de la régulation de cette voie importante du métabolisme de défense de la vigne. / Stilbenes are major defense metabolites in grapevine (Vitis vinifera), which are known for their many pharmacological properties. Taking advantage of the recent sequencing of the grapevine genome, the aim of this work is to characterize genes families involved in stilbene biosynthesis, in order to clarify the role of these defense compounds in the interaction with downy mildew (Plasmopara viticola). The first step of stilbene biosynthesis is catalyzed by stilbene synthase (STS), to yield resveratrol. Our annotation of the STS gene family identified 48 STS genes, including at least 32 potentially functional ones. This unusual expansion of the STS family is original, since it is not found in other stilbene-producing plants. Functional characterization of a selection of STS proteins indicates that all STS genes are likely to encode enzymes with STS activity. Evolutionary analysis of the STS gene family revealed that STS evolution is dominated by purifying selection, with no evidence for neofunctionalization. STS family then represents a unique example a family of more than 30 genes encoding proteins with identical function, and the biological significance of this amplification is discussed. A second important enzyme in stilbene metabolism is resveratrol O-methyltransferase (ROMT), involved in the methylation of resveratrol to yield pterostilbene. This highly fungitoxic compound is believed to play an important role in grapevine defense metabolism. Our analysis of the ROMT family identified 17 genes, two of them only (VvROMT1 and VvROMT2) being involved in pterostilbene biosynthesis. qPCR analyses have shown an induction of the expression of these two genes after an inoculation of P. viticola on grapevine leaves. Two others genes, VvROMT12 and VvROMT13, are constitutively expressed in grapevine roots, and do not seem to respond to stress. Metabolomic analysis on transgenic Nicotiana benthamiana plants expressing these two ROMT genes, together with in vitro enzymatic assays, have been performed in order to determine the function of ROMT12 and ROMT 13. All together, these results show a remarkable amplification of genes involved in stilbene biosynthesis in grapevine. This work paves the way for detailed analyses of the regulation of this important pathway of grapevine defense metabolism.

Les stilbènes sont les métabolites de défense majeurs de la vigne, qui sont également connus pour leurs nombreuses propriétés pharmacologiques. Tirant parti du récent séquençage du génome de la vigne, l'objectif de ce travail est de caractériser les familles de gènes impliqués dans la biosynthèse des stilbènes chez la vigne, et de préciser leur rôle dans les défenses contre le mildiou (Plasmopara viticola). La première étape de la biosynthèse des stilbènes est catalysée par la stilbène synthase (STS), pour former le resvératrol. L'analyse détaillée du génome de la vigne a permis d'identifier 48 gènes STS, dont 32 gènes potentiellement fonctionnels. La caractérisation fonctionnelle d'une sélection de gènes représentatifs de la diversité de la famille suggère que l'ensemble des 32 gènes STS code pour des protéines ayant réellement une activité stilbène synthase. L'analyse évolutive des gènes STS montre que la famille est très contrainte, sans trace de néo-fonctionnalisation. La famille des STS de la vigne représente donc un exemple unique d'une famille de plus de 30 gènes codant pour des protéines de fonction identique, et la signification biologique de cette expansion est discutée. Une seconde enzyme importante du métabolisme des stilbènes est la resvératrol O-méthyltransférase (ROMT). La ROMT est impliquée dans la méthylation du resvératrol pour former le ptérostilbène, un composé hautement fongitoxique qui pourrait jouer un rôle important dans les mécanismes de défenses de la vigne. Notre analyse de la famille ROMT montre qu'elle est constituée de 17 gènes, dont deux seulement (VvROMT1 et VvROMT2) semblent impliqués dans la synthèse de ptérostilbène. L'expression de ces deux gènes est induite suite à une infection par P. viticola au niveau des feuilles de vigne. Deux autres gènes de la famille, VvROMT12 et VvROMT13, sont exprimés constitutivement au niveau des racines, et ne semblent pas répondre au stress. Des analyses métabolomiques sur des plants de Nicotiana benthamiana transgéniques exprimant ces deux ROMT ainsi que des tests enzymatiques in vitro ont été réalisés afin de déterminer la fonction des gènes ROMT12 et 13. L'ensemble de ces résultats fait apparaître une amplification remarquable des gènes impliqués dans la synthèse des stilbènes chez la vigne et ouvrent la voie à l'étude détaillée de la régulation de cette voie importante du métabolisme de défense de la vigne.

La récente définition de Brachypodium distachyon comme modèle des graminées en fait un organisme de choix pour l’étude de leur paroi cellulaire, en particulier dans le cadre de leur utilisation comme matière première renouvelable pour le bioéthanol de seconde génération. Les lignines, dont les trois unités (H, G et S) proviennent de la polymérisation des monolignols, sont associées aux acides hydroxycinnamiques dans la paroi des céréales et représentent l’obstacle majeur à l’exploitation industrielle de la biomasse lignocellulosique. L’acquisition de connaissances sur les mécanismes dirigeant leur mise en place et leur organisation permettrait d’identifier des facteurs modulant les rendements de production qui y sont associés. Quatre familles de gènes ont été étudiées et l’implication dans la voie de biosynthèse des monolignols de trois gènes a été montrée : BdF5H2 possède une activité férulate-5-hydroxylase permettant la synthèse des précurseurs des unités S des lignines, BdCOMT3 est l’isoforme principale des acide cafféique O-Méthyltransférases et sa perte partielle de fonction cause une diminution de la quantité de lignine, la modification du rapport S/G et une baisse de quantité d’acide p-coumarique dans deux lignées mutantes indépendantes. Enfin, BdCAD1 est l’isoforme principale des alcools cinnamylique déshydrogénases : sa perte de fonction dans deux lignées indépendantes cause la diminution de la quantité globale de lignine et d’acide p-coumarique, une baisse du rapport S/G ainsi que l’accumulation de sinapaldéhyde. Par ailleurs ces deux lignées présentent des rendements de saccharification augmentés de plus d’un quart par rapport au sauvage. / Brachypodium distachyon was recently adopted as an experimental model for grass species. As such, it is used to study grass cell wall, in particular in the context of their use as renewable feedstock for the production of second generation bioethanol. Lignins are polymers of three main units (H, G and S) originating from the polymerization of monolignols, and are linked to hydroxycinnamic acids in grasses. They constitute the main bottleneck to industrial processes targeting lignocellulosic biomass and improving the understanding of the mechanisms directing their structure and deposition could lead to the identification of the factors modulating associated production yields. Four gene families were studied and the involvement of three genes in the monolignols biosynthetic pathway was shown: BdF5H2 displays a ferulate-5-hydroxylase activity enabling the synthesis of the S lignin units, BdCOMT3 is the main caffeic acid O-methyltransferase and its partial loss of function in two independent mutant lines leads to the reduction of lignin content, the modification of the S/G units ratio and a decrease in p-coumaric acid accumulation. BdCAD1 is the main cinnamyl alcohol dehydrogenase isoform: its loss of function in two independent mutant lines results in a decrease in lignin content and of the S/G ratio and the accumulation of sinapaldehyde. Moreover, these two lines display significatively increased saccharification yields.

Le métabolisme des phénylpropanoïdes est un métabolisme secondaire spécifique au règne végétal. Il conduit, à partir de la phénylalanine, à la synthèse d'une grande variété de substances telles que les anthocyanes, les isoflavonoïdes, les stilbènes, des esters d'acides hydroxycinnamiques, ou encore à la lignine. Ces métabolites secondaires interviennent dans la pigmentation florale ou encore la protection des tissus végétaux contre divers stress biotiques et abiotiques. Quant à la lignine, elle assure rigidité aux parois cellulaires végétales et imperméabilité aux tissus conducteurs. La lignine est un polymère tridimensionnel constitué de trois unités monomériques qui possèdent le même squelette carboné phénylpropane mais diffèrent par leur degré de méthoxylation et d'hydroxylation. Une partie de mon travail de thèse a consisté à étudier la relation structure/fonction de la caféoyl-coenzyme A O-méthyltransférase (CCoAOMT) de N. tabacum, responsable de l'introduction de la première des deux fonctions méthyles. Des études bioinformatiques couplées à des approches de biochimie et de mutagenèse dirigée, nous ont permis de modéliser l'interaction de la CCoAOMT avec son substrat, le caféoyl-CoA. Trois acides aminés du site actif ont notamment été identifiés comme intervenant dans la reconnaissance spécifique de la chaîne latérale de CoA. J'ai également caractérisé, chez N. tabacum, une nouvelle acyltransférase à activité HydroxyCinnamoyl-CoA : shikimate/quinate hydroxycinnamoyl Transférase (HCT) impliquée dans le métabolisme des phénylpropanoïdes. Nous avons montré que l'enzyme HCT recombinante synthétisait, in vitro, les substrats de l'hydroxylation en position 3 du noyau aromatique. De plus, la répression de l'expression du gène HCT par le «VIGS» conduit à un ralentissement de la croissance des plantes, à une perturbation importante du pool d'acide chlorogénique, ainsi qu'à une diminution de la quantité et à une modification de la composition de la lignine synthétisée.