O desenvolvimento de fungos do gênero Aspergillus e Penicillium em uvas destinadas a produção de vinho pode levar a contaminações por Ocratoxina A (OTA), uma micotoxina internacionalmente conhecida como nefrotóxica e possivelmente carcinogênica para humanos. O experimento realizado avaliou a presença de ocratoxina A, através da Cromatografia em Camada Delgada (CCD) com Detector de Carga Acoplada (DCA), em 88 vinhos da região Sul do Brasil, referentes à safra 2009. As amostras estavam divididas em 75 oriundas do Rio Grande do Sul, 9 de Santa Catarina e 4 do Paraná, 56 da variedade Cabernet Sauvignon e 32 da variedade Merlot. A OTA foi determinada através de imagens adquiridas sob luz UV e quantificada através da utilização do software ImageJ. Duas formas de limpeza foram testadas para recuperação. A média de recuperação com coluna de imunoafinidade foi de 82,33%. Recuperação média para análise com limpeza por NaHCO3 1,25% foi de 76,95%. Os limites de quantificação e detecção foram 0,8 μg/L e 0,2 μg/L, respectivamente. Os resultados apresentaram 5 amostras contaminadas por OTA, com incidência de 5,68%. A variedade Cabernet Sauvignon apresentou 3 amostras positivas e a Merlot 2 amostras. A maior concentração encontrada foi de 0,84 μg/L, em uma das 3 amostras positivas do Rio Grande do Sul. Santa Catarina e Paraná apresentaram 1 amostra positiva cada, e suas concentrações estavam abaixo do limite de quantificação. / The presence of fungi from Aspergillus and Penicillium genera in grapes for wine production can lead to Ochartoxin A (OTA) contaminations, a mycotoxin internationally recognized as nephrotoxic and possibly carcinogen to humans. The experiment evaluated the presence of OTA trough Thin Layer Chromatography (TLC) with Charge Coupled Detector (CCD) in 88 wines from the south region of Brazil, 2009 vintage. Samples were divided in 75 originated from Rio Grande do Sul state, 9 from Santa Catarina and 4 from Paraná, 56 made from Cabernet Sauvignon and 32 from Merlot. OTA was determined trough analysis of acquired images and quantified with the software ImageJ. Two different clean-up were tested for recovery verification. The mean recovery with immunoaffinity column (IAC) was 82.33%. The mean recovery for analysis with NaHCO3 1.25% clean-up was 76.95. The quantification and detection limits were 0.8 μg/L e 0,2 μg.L-1, respectively. The results shown 5 OTA contaminated samples, with 5.68% incidence. Cabernet Sauvignon variety had 3 positive samples and Merlot had 2. The highest concentration found was 0.84 μg.L-1, in one of three positive samples from Rio Grande do Sul. Santa Catarina e paraná had one positive sample each, and concentrations below the quantification limit.

A ocratoxina (OTA) é uma micotoxina que possui propriedades nefrotóxicas, hepatotóxicas, teratogênicas e carcinogênicas. No Brasil, o limite máximo permitido de OTA em vinhos foi estabelecido em 2011 e é 2 μg/L. A ocorrência desta toxina em vinhos está relacionada principalmente à presença de fungos do gênero Aspergillus nas uvas usadas para a vinificação. Deste modo, o objetivo deste estudo foi verificar a influência das etapas de elaboração de vinho Cabernet Sauvignon sobre os níveis de OTA, através de dois diferentes experimentos: (A) vinho elaborado a partir de uvas inoculadas com fungo ocratoxigênico e (B) vinho elaborado com uvas naturalmente contaminadas com OTA. Para os dois experimentos, amostras das etapas mosto, fermentação/maceração, descuba, pós-fermentação, trasfega e maturação foram coletadas em triplicata, durante um período de 5 meses. A OTA foi detectada através da técnica de cromatografia líquida de alta eficiência com detector de fluorescência (CLAE-FL) e o limite de detecção e quantificação foi de 0,06 μg/L e 0,6 μg/L, respectivamente. Durante a vinificação, as etapas que apresentaram maior percentual de redução da toxina foram descuba, pós-fermentação e trasfega. Reduções significativas nos níveis de OTA foram observadas após a conclusão da vinificação. No vinho elaborado com uvas inoculadas com fungo ocratoxigênico observou-se uma redução de 92,6%. Valor similar (92%) foi verificado no vinho produzido com uvas naturalmente contaminadas por OTA. Considerando todo o processo de vinificação, pode-se sugerir que a diminuição dos níveis de OTA foi observada principalmente, devido à adsorção da toxina à parede celular das leveduras. Além disso, a adsorção da toxina aos sólidos em suspensão presentes no vinho durante a elaboração pode ter ocorrido. / The ochratoxin A (OTA) is a mycotoxin with nephrotoxic, hepatotoxic, teratogenic and carcinogenic properties. In Brazil, the permitted maximum limits for the OTA in wines was established in 2011 and is 2 μg/L. The occurence of this toxin in wines is due mainly for presence of fungi from Aspergillus genera in grapes used for winemaking. In this way, the aim of this study was to check the influence of stages of the winemaking process of Cabernet Sauvignon grape on the OTA levels through two different experiments: (A) wine made from grapes inoculated with ochratoxigenic fungi and (B) wine made from grapes naturally contaminated with OTA. For the two experiments, samples of must, fermentation/maceration, drawn-off wine, after fermentation, racking and maturation stages were collected in triplicate, during 5 months. The OTA was detected using high-performance liquid chromatography with fluorecence detector (HPLC-FL) and the limit of detection and limit of quantitation were 0.06 and 0.6 μg/L, respectively. During the winemaking, the stages that show higher toxin reduction were drawn-off wine, after alcoholic fermentation and racking. Significant reductions in OTA levels were observed when winemaking was finished. A reduction of 92.6% was observed in wine made from grapes inoculated with ochratoxigenic fungi. Similar value (92%) was verified in wine made from grapes naturally contaminated with OTA. Considering all winemaking process, we may suggest that the decreasing of OTA levels was observed mainly due to adsorption of the toxin in cell wall of yeast. Furthermore, the adsorption of the toxin in suspended solids present in wine during the winemaking may be occurred.

O desenvolvimento de fungos do gênero Aspergillus e Penicillium em uvas destinadas a produção de vinho pode levar a contaminações por Ocratoxina A (OTA), uma micotoxina internacionalmente conhecida como nefrotóxica e possivelmente carcinogênica para humanos. O experimento realizado avaliou a presença de ocratoxina A, através da Cromatografia em Camada Delgada (CCD) com Detector de Carga Acoplada (DCA), em 88 vinhos da região Sul do Brasil, referentes à safra 2009. As amostras estavam divididas em 75 oriundas do Rio Grande do Sul, 9 de Santa Catarina e 4 do Paraná, 56 da variedade Cabernet Sauvignon e 32 da variedade Merlot. A OTA foi determinada através de imagens adquiridas sob luz UV e quantificada através da utilização do software ImageJ. Duas formas de limpeza foram testadas para recuperação. A média de recuperação com coluna de imunoafinidade foi de 82,33%. Recuperação média para análise com limpeza por NaHCO3 1,25% foi de 76,95%. Os limites de quantificação e detecção foram 0,8 μg/L e 0,2 μg/L, respectivamente. Os resultados apresentaram 5 amostras contaminadas por OTA, com incidência de 5,68%. A variedade Cabernet Sauvignon apresentou 3 amostras positivas e a Merlot 2 amostras. A maior concentração encontrada foi de 0,84 μg/L, em uma das 3 amostras positivas do Rio Grande do Sul. Santa Catarina e Paraná apresentaram 1 amostra positiva cada, e suas concentrações estavam abaixo do limite de quantificação. / The presence of fungi from Aspergillus and Penicillium genera in grapes for wine production can lead to Ochartoxin A (OTA) contaminations, a mycotoxin internationally recognized as nephrotoxic and possibly carcinogen to humans. The experiment evaluated the presence of OTA trough Thin Layer Chromatography (TLC) with Charge Coupled Detector (CCD) in 88 wines from the south region of Brazil, 2009 vintage. Samples were divided in 75 originated from Rio Grande do Sul state, 9 from Santa Catarina and 4 from Paraná, 56 made from Cabernet Sauvignon and 32 from Merlot. OTA was determined trough analysis of acquired images and quantified with the software ImageJ. Two different clean-up were tested for recovery verification. The mean recovery with immunoaffinity column (IAC) was 82.33%. The mean recovery for analysis with NaHCO3 1.25% clean-up was 76.95. The quantification and detection limits were 0.8 μg/L e 0,2 μg.L-1, respectively. The results shown 5 OTA contaminated samples, with 5.68% incidence. Cabernet Sauvignon variety had 3 positive samples and Merlot had 2. The highest concentration found was 0.84 μg.L-1, in one of three positive samples from Rio Grande do Sul. Santa Catarina e paraná had one positive sample each, and concentrations below the quantification limit.

A ocratoxina (OTA) é uma micotoxina que possui propriedades nefrotóxicas, hepatotóxicas, teratogênicas e carcinogênicas. No Brasil, o limite máximo permitido de OTA em vinhos foi estabelecido em 2011 e é 2 μg/L. A ocorrência desta toxina em vinhos está relacionada principalmente à presença de fungos do gênero Aspergillus nas uvas usadas para a vinificação. Deste modo, o objetivo deste estudo foi verificar a influência das etapas de elaboração de vinho Cabernet Sauvignon sobre os níveis de OTA, através de dois diferentes experimentos: (A) vinho elaborado a partir de uvas inoculadas com fungo ocratoxigênico e (B) vinho elaborado com uvas naturalmente contaminadas com OTA. Para os dois experimentos, amostras das etapas mosto, fermentação/maceração, descuba, pós-fermentação, trasfega e maturação foram coletadas em triplicata, durante um período de 5 meses. A OTA foi detectada através da técnica de cromatografia líquida de alta eficiência com detector de fluorescência (CLAE-FL) e o limite de detecção e quantificação foi de 0,06 μg/L e 0,6 μg/L, respectivamente. Durante a vinificação, as etapas que apresentaram maior percentual de redução da toxina foram descuba, pós-fermentação e trasfega. Reduções significativas nos níveis de OTA foram observadas após a conclusão da vinificação. No vinho elaborado com uvas inoculadas com fungo ocratoxigênico observou-se uma redução de 92,6%. Valor similar (92%) foi verificado no vinho produzido com uvas naturalmente contaminadas por OTA. Considerando todo o processo de vinificação, pode-se sugerir que a diminuição dos níveis de OTA foi observada principalmente, devido à adsorção da toxina à parede celular das leveduras. Além disso, a adsorção da toxina aos sólidos em suspensão presentes no vinho durante a elaboração pode ter ocorrido. / The ochratoxin A (OTA) is a mycotoxin with nephrotoxic, hepatotoxic, teratogenic and carcinogenic properties. In Brazil, the permitted maximum limits for the OTA in wines was established in 2011 and is 2 μg/L. The occurence of this toxin in wines is due mainly for presence of fungi from Aspergillus genera in grapes used for winemaking. In this way, the aim of this study was to check the influence of stages of the winemaking process of Cabernet Sauvignon grape on the OTA levels through two different experiments: (A) wine made from grapes inoculated with ochratoxigenic fungi and (B) wine made from grapes naturally contaminated with OTA. For the two experiments, samples of must, fermentation/maceration, drawn-off wine, after fermentation, racking and maturation stages were collected in triplicate, during 5 months. The OTA was detected using high-performance liquid chromatography with fluorecence detector (HPLC-FL) and the limit of detection and limit of quantitation were 0.06 and 0.6 μg/L, respectively. During the winemaking, the stages that show higher toxin reduction were drawn-off wine, after alcoholic fermentation and racking. Significant reductions in OTA levels were observed when winemaking was finished. A reduction of 92.6% was observed in wine made from grapes inoculated with ochratoxigenic fungi. Similar value (92%) was verified in wine made from grapes naturally contaminated with OTA. Considering all winemaking process, we may suggest that the decreasing of OTA levels was observed mainly due to adsorption of the toxin in cell wall of yeast. Furthermore, the adsorption of the toxin in suspended solids present in wine during the winemaking may be occurred.

A vitivinicultura é uma atividade extremamente importante no estado do Rio Grande do Sul, representando cerca de 50% das uvas produzidas e 90% dos vinhos em todo o país. Diferentes gêneros fúngicos são comumente encontrados infectando as bagas, os principais são Alternaria, Botrytis, Cladosporium e Aspergillus. Esta contaminação é influenciada por diferentes fatores, entre eles, características climáticas da região, variedades da uva, tipo de cultivo, entre outros. O gênero Aspergillus destaca-se dos demais, pois as espécies frequentemente encontradas nas uvas, os chamados Aspergillus seção Nigri, são potenciais produtores de Ocratoxina A, micotoxina nefrotóxica e possivelmente carcinogênica para humanos. Os objetivos deste trabalho foram a caracterização micotoxicológica de uvas das variedades Merlot e Cabernet Sauvignon, produzidas em três regiões vitivinícolas do Rio Grande do Sul, coletadas em dois estágios de maturação das bagas. As amostragens foram realizadas no inicio da mudança de cor e na colheita nas regiões da Campanha, Serra do Sudeste e Serra do Nordeste. Foram isolados oito gêneros fúngicos, com destaque para Alternaria, que foi predominante em todas as regiões, estágios de cultivo e nas duas variedades. Os Aspergillus seção Nigri foram predominantes no gênero Aspergillus, representando 88% dos isolados, que se destacaram na região da Campanha e na variedade Cabernet Sauvignon. O período da colheita demonstrou ser critico para a contaminação por Aspergillus negros na variedade Cabernet Sauvignon, enquanto na variedade Merlot, maior frequência desses fungos foi observada durante o início da mudança de cor. Uma cepa de Aspergillus japonicus foi capaz de produzir ocratoxina A na concentração de 148 ng/mL/106 conídios. Não foram encontrados níveis detectáveis de OTA nas amostras de uvas. A caracterização da contaminação fungica e por OTA em uvas cultivadas no estado é relevante para garantir a qualidade destes produtos e a segurança da população consumidora. / The viticulture is an important activity in Brazil. Rio Grande do Sul, the southern state of Brazil, responsible for almost 90% of wines production. Different fungal genera are commonly found infecting the berries, mainly Alternaria, Botrytis, Cladosporium and Aspergillus. Grape infection and fungal growth in influenced by different factors, including climatic characteristics of the region, grape varieties, crop type, among others. Among the genus Aspergillus, Aspergillus section Nigri stands out from the others, because its ability to produce ochratoxin A, mycotoxin with nephrotoxic characteristics and classified as a possible carcinogenic to humans. The aim of this study was the mycological characterization of wine grapes of Merlot and Cabernet Sauvignon varieties, cultivated at three wine producer regions of Rio Grande do Sul, collected during two stages of berries maturation. The sampling was conducted at the early ripeness and harvesting from the Campanha, Serra do Sudeste and Serra do Nordeste regions. Eight fungal genera were isolated, highlighting Alternaria, which was predominant in all regions, growing stages and varieties. Aspergillus section Nigri were prevalent in the genus Aspergillus, representing 88% of the isolates mainly at Campanha region as well as Cabernet Sauvignon veriety. The harvest period proved to be critical for contamination by Aspergillus section Nigri in C. Sauvignon variety; nevertheless, in Merlot, the greater frequency of these fungi was observed at early ripeness. One Aspergillus japonicus isolate was able to produce OTA at a concentration of 148 ng mL-1/106 conidia. No detectable levels of OTA were found in any grape samples. The characterization of fungal and OTA contamination in grapes cultivated in Rio Grande do Sul is extremely important to ensure the quality of these products and consumers safety.

A vitivinicultura é uma atividade extremamente importante no estado do Rio Grande do Sul, representando cerca de 50% das uvas produzidas e 90% dos vinhos em todo o país. Diferentes gêneros fúngicos são comumente encontrados infectando as bagas, os principais são Alternaria, Botrytis, Cladosporium e Aspergillus. Esta contaminação é influenciada por diferentes fatores, entre eles, características climáticas da região, variedades da uva, tipo de cultivo, entre outros. O gênero Aspergillus destaca-se dos demais, pois as espécies frequentemente encontradas nas uvas, os chamados Aspergillus seção Nigri, são potenciais produtores de Ocratoxina A, micotoxina nefrotóxica e possivelmente carcinogênica para humanos. Os objetivos deste trabalho foram a caracterização micotoxicológica de uvas das variedades Merlot e Cabernet Sauvignon, produzidas em três regiões vitivinícolas do Rio Grande do Sul, coletadas em dois estágios de maturação das bagas. As amostragens foram realizadas no inicio da mudança de cor e na colheita nas regiões da Campanha, Serra do Sudeste e Serra do Nordeste. Foram isolados oito gêneros fúngicos, com destaque para Alternaria, que foi predominante em todas as regiões, estágios de cultivo e nas duas variedades. Os Aspergillus seção Nigri foram predominantes no gênero Aspergillus, representando 88% dos isolados, que se destacaram na região da Campanha e na variedade Cabernet Sauvignon. O período da colheita demonstrou ser critico para a contaminação por Aspergillus negros na variedade Cabernet Sauvignon, enquanto na variedade Merlot, maior frequência desses fungos foi observada durante o início da mudança de cor. Uma cepa de Aspergillus japonicus foi capaz de produzir ocratoxina A na concentração de 148 ng/mL/106 conídios. Não foram encontrados níveis detectáveis de OTA nas amostras de uvas. A caracterização da contaminação fungica e por OTA em uvas cultivadas no estado é relevante para garantir a qualidade destes produtos e a segurança da população consumidora. / The viticulture is an important activity in Brazil. Rio Grande do Sul, the southern state of Brazil, responsible for almost 90% of wines production. Different fungal genera are commonly found infecting the berries, mainly Alternaria, Botrytis, Cladosporium and Aspergillus. Grape infection and fungal growth in influenced by different factors, including climatic characteristics of the region, grape varieties, crop type, among others. Among the genus Aspergillus, Aspergillus section Nigri stands out from the others, because its ability to produce ochratoxin A, mycotoxin with nephrotoxic characteristics and classified as a possible carcinogenic to humans. The aim of this study was the mycological characterization of wine grapes of Merlot and Cabernet Sauvignon varieties, cultivated at three wine producer regions of Rio Grande do Sul, collected during two stages of berries maturation. The sampling was conducted at the early ripeness and harvesting from the Campanha, Serra do Sudeste and Serra do Nordeste regions. Eight fungal genera were isolated, highlighting Alternaria, which was predominant in all regions, growing stages and varieties. Aspergillus section Nigri were prevalent in the genus Aspergillus, representing 88% of the isolates mainly at Campanha region as well as Cabernet Sauvignon veriety. The harvest period proved to be critical for contamination by Aspergillus section Nigri in C. Sauvignon variety; nevertheless, in Merlot, the greater frequency of these fungi was observed at early ripeness. One Aspergillus japonicus isolate was able to produce OTA at a concentration of 148 ng mL-1/106 conidia. No detectable levels of OTA were found in any grape samples. The characterization of fungal and OTA contamination in grapes cultivated in Rio Grande do Sul is extremely important to ensure the quality of these products and consumers safety.

A vitivinicultura é uma atividade extremamente importante no estado do Rio Grande do Sul, representando cerca de 50% das uvas produzidas e 90% dos vinhos em todo o país. Diferentes gêneros fúngicos são comumente encontrados infectando as bagas, os principais são Alternaria, Botrytis, Cladosporium e Aspergillus. Esta contaminação é influenciada por diferentes fatores, entre eles, características climáticas da região, variedades da uva, tipo de cultivo, entre outros. O gênero Aspergillus destaca-se dos demais, pois as espécies frequentemente encontradas nas uvas, os chamados Aspergillus seção Nigri, são potenciais produtores de Ocratoxina A, micotoxina nefrotóxica e possivelmente carcinogênica para humanos. Os objetivos deste trabalho foram a caracterização micotoxicológica de uvas das variedades Merlot e Cabernet Sauvignon, produzidas em três regiões vitivinícolas do Rio Grande do Sul, coletadas em dois estágios de maturação das bagas. As amostragens foram realizadas no inicio da mudança de cor e na colheita nas regiões da Campanha, Serra do Sudeste e Serra do Nordeste. Foram isolados oito gêneros fúngicos, com destaque para Alternaria, que foi predominante em todas as regiões, estágios de cultivo e nas duas variedades. Os Aspergillus seção Nigri foram predominantes no gênero Aspergillus, representando 88% dos isolados, que se destacaram na região da Campanha e na variedade Cabernet Sauvignon. O período da colheita demonstrou ser critico para a contaminação por Aspergillus negros na variedade Cabernet Sauvignon, enquanto na variedade Merlot, maior frequência desses fungos foi observada durante o início da mudança de cor. Uma cepa de Aspergillus japonicus foi capaz de produzir ocratoxina A na concentração de 148 ng/mL/106 conídios. Não foram encontrados níveis detectáveis de OTA nas amostras de uvas. A caracterização da contaminação fungica e por OTA em uvas cultivadas no estado é relevante para garantir a qualidade destes produtos e a segurança da população consumidora. / The viticulture is an important activity in Brazil. Rio Grande do Sul, the southern state of Brazil, responsible for almost 90% of wines production. Different fungal genera are commonly found infecting the berries, mainly Alternaria, Botrytis, Cladosporium and Aspergillus. Grape infection and fungal growth in influenced by different factors, including climatic characteristics of the region, grape varieties, crop type, among others. Among the genus Aspergillus, Aspergillus section Nigri stands out from the others, because its ability to produce ochratoxin A, mycotoxin with nephrotoxic characteristics and classified as a possible carcinogenic to humans. The aim of this study was the mycological characterization of wine grapes of Merlot and Cabernet Sauvignon varieties, cultivated at three wine producer regions of Rio Grande do Sul, collected during two stages of berries maturation. The sampling was conducted at the early ripeness and harvesting from the Campanha, Serra do Sudeste and Serra do Nordeste regions. Eight fungal genera were isolated, highlighting Alternaria, which was predominant in all regions, growing stages and varieties. Aspergillus section Nigri were prevalent in the genus Aspergillus, representing 88% of the isolates mainly at Campanha region as well as Cabernet Sauvignon veriety. The harvest period proved to be critical for contamination by Aspergillus section Nigri in C. Sauvignon variety; nevertheless, in Merlot, the greater frequency of these fungi was observed at early ripeness. One Aspergillus japonicus isolate was able to produce OTA at a concentration of 148 ng mL-1/106 conidia. No detectable levels of OTA were found in any grape samples. The characterization of fungal and OTA contamination in grapes cultivated in Rio Grande do Sul is extremely important to ensure the quality of these products and consumers safety.

Submitted by Leonardo Freitas (leonardo.hfreitas@ufpe.br) on 2015-04-09T18:28:06Z No. of bitstreams: 2 TESE MARÍLIA MACIEL.pdf: 3027098 bytes, checksum: 3d287d151c61c2f6ac29afba9e6589a1 (MD5) license_rdf: 9 bytes, checksum: 42dd12a06de379d3ffa39b67dc9c7aff (MD5) / Made available in DSpace on 2015-04-09T18:28:06Z (GMT). No. of bitstreams: 2 TESE MARÍLIA MACIEL.pdf: 3027098 bytes, checksum: 3d287d151c61c2f6ac29afba9e6589a1 (MD5) license_rdf: 9 bytes, checksum: 42dd12a06de379d3ffa39b67dc9c7aff (MD5) Previous issue date: 2013-02-27 / CNPq; EM / As espécies de Aspergillus pertencentes à seção Nigri são caracterizadas pela cor negra da maioria das colônias. A identificação destas espécies é complexa devido à alta diversidade genética. As características morfológicas, fisiológicas, bioquímicas, moleculares e espectrais são ferramentas que podem ser utilizadas na identificação polifásica. Aspergillus niger é a espécie da seção Nigri mais utilizada na indústria. Dentre as enzimas produzidas por este fungo podemos citar as poligalacturonases (PG), que possuem aplicação tecnológica no processamento de alimentos e frutas. Neste trabalho, linhagens de Aspergillus seção Nigri foram avaliadas por uma abordagem polifásica baseada na análise morfológica, bioquímica e espectral por Ionização/Dessorção de Matriz Assistida por Laser Tempo-de-Vôo/Espectrômetro de Massa (MALDI-TOF MS) para sua identificação e caracterização. Os dados obtidos a partir dessa abordagem indicaram que os resultados do MALDI-TOF MS corroboraram os dados da taxonomia clássica e análises bioquímicas. Cerca de 20% e 14% das linhagens de A. niger foram produtoras de ocratoxina A (OTA) e fumonisina B2 (FB2), respectivamente. As linhagens não micotoxigênicas foram avaliadas quanto à capacidade de produzir PG, sendo A. niger URM 5162 que apresentou maiores valores de atividade quando imobilizada em casca de laranja e com o reator operado sem aeração. Após a produção, as PG foram purificadas pelo sistema de duas fases aquosas (SDFA) formado por polietilenoglicol e sais de fosfato (PEG/fosfato). A endopoligalacturonase (endo-PG) e a exo-poligalacturonase (exo-PG) tiveram preferência pela fase superior do sistema (rica em PEG). Para as duas enzimas, os melhores resultados para o coeficiente de partição (K=1,23 para endo-PG e 2,40 para exo-PG), rendimento em atividade (Y=74,04% para endo-PG e 33,33% para exo-PG) e fator de purificação (FP=8,18 para endo-PG e 1,98 para exo-PG), foram obtidos com 12,5% (m/m) de PEG 8000 (g/mol) e concentração de fosfato de 25% (m/m) a pH 6,0, sendo esta a condição considerada como a mais adequada para a purificação das PG produzidas por A. niger URM 5162. A concentração de fosfato e a massa molar do PEG foram as variáveis independentes que mais influenciaram nos valores de K, Y e FP durante a purificação da endo- e exo-poligalacturonase, respectivamente. Diante dos resultados obtidos, observa-se que a utilização de uma abordagem polifásica consistindo de análise morfológica, bioquímica e proteômica, permite uma identificação mais precisa das espécies da seção Nigri. Aspergillus niger URM 5162 é a linhagem promissora para produção de PG, sendo o SDFA uma alternativa interessante e de baixo custo para a purificação destas enzimas.

La ocratoxina A (OTA) es una micotoxina producida por algunas variedades de hongos capaces de contaminar productos agroindustriales como granos, cereales, hortalizas y especias. Este metabolito es altamente tóxico y su ingestión trae consigo efectos adversos, representando una gran amenaza para animales y humanos. Las autoridades internacionales han establecido límites máximos permitidos para el consumo de esta micotoxina, y por esta razón es importante contar con métodos de detección rápidos, efectivos y aplicables al control de calidad en la industria de alimentos. Entre las técnicas tradicionales de detección de micotoxinas se encuentran los métodos basados en cromatografía líquida acoplada a detectores de masas en tándem (LCMS/ MS); sin embargo, son métodos costosos y poco accesibles. Por otro lado, existen métodos basados en inmunoensayos (ELISA) pero no son muy robustos y cuentan con tiempos de vida cortos. Una de las alternativas en el desarrollo de nuevos métodos de detección es el uso de sensores basados en nanoestructuras de metales nobles, las cuales cuentan con excelentes propiedades ópticas debido a la resonancia del plasmón superficial localizado (LSPR). Además, la gran área superficial que presentan estos materiales permite modificarlas químicamente en la superficie con un gran número de moléculas, p.ej. con aptámeros que actúen como agentes de reconocimiento selectivo a analitos de interés. En este trabajo se realizó un procedimiento de modificación de microplacas NUNC® Immobilizer Amino con oligonucleótidos como un aptámero selectivo a OTA y la hebra complementaria a dicho aptámero, a fin de desarrollar un sistema alternativo de detección de OTA, basado en el análisis colorimétrico con nanosensores aptaméricos. El procedimiento también contempló la síntesis de nanoesferas de oro (AuNEs), seguido por la modificación superficial con oligonucleótidos tiolados y su caracterización por espectroscopía UV-Vis y microscopía electrónica. Posteriormente, se evaluaron diferentes parámetros en la optimización del proceso de modificación de microplacas, así como en la hibridación entre los oligonucléotidos presentes en la microplaca y los acoplados a las AuNEs. Con las condiciones óptimas encontradas se realizaron pruebas de concepto para detectar la presencia o ausencia de OTA en solución. El diseño de este método pretende ser la base para la elaboración de un kit que potencialmente facilite el análisis rutinario de control de calidad de alimentos, de manera que se pueda contar rápido y económico en la detección de micotoxinas en alimentos.

Una de las principales causas de contaminación de los alimentos se encuentra ligada a la presencia de hongos y a la producción de toxinas por parte de estos, mayormente denominadas micotoxinas. Una de las más peligrosas es la ocratoxina A (OTA), la cual debido a su alta toxicidad en el organismo ha generado que se establezcan niveles máximos permisibles de consumo por parte de instituciones internacionales. En la actualidad, existen diversas metodologías que permiten la detección de esta toxina. Sin embargo, no es fácil acceder a ellas pues requieren de personal capacitado, equipos costosos y una alta demanda de tiempo. Este trabajo plantea el desarrollo de un biosensor a base de nanovarillas de oro y aptámeros como una alternativa en la detección de OTA, que sea más accesible que los métodos convencionales. En primer lugar, se realizó la síntesis de las nanovarillas de oro empleando el método de semillas reportado por Ratto y colaboradores. De esta forma se obtuvo varillas de aproximadamente 54 nm x 17 nm; las cuales fueron caracterizadas mediante espectroscopía UV-Vis-NIR y microscopía electrónica de transmisión. En segundo lugar, se implementó el proceso de funcionalización de las nanovarillas de oro para el desarrollo del biosensor. Se optimizó el número de centrifugaciones y la concentración del aptámero, y se utilizó como molécula de relleno al 2- mercaptoetanol. En estas etapas, se monitoreó el desplazamiento y el ancho de la banda plasmónica mediante UV-Vis-NIR y los cambios en los espectros Raman para determinar las mejores condiciones de funcionalización. En tercer lugar, se evaluó el desempeño del sensor con diferentes concentraciones de la toxina (0, 0.25, 0.5, 2, 4 μM) por medio de espectroscopía UV-Vis-NIR y espectroscopía Raman. Con esta última, se identificó las señales vibracionales características tanto del aptámero como del 2-mercaptoetanol. Finalmente, se empleó el método de calibración multivariante de mínimos cuadrados parciales para construir un modelo de cuantificación de OTA a partir de los espectros obtenidos. Se concluye que mediante espectroscopia Raman es posible discernir hasta 0.25 μM (100 ppb) de la toxina; mientras que por espectroscopía UVVis- NIR, solo es posible diferenciar a partir de 2 μM (800 ppb).