FundaÃÃo Cearense de Apoio ao Desenvolvimento Cientifico e TecnolÃgico / CoordenaÃÃo de AperfeiÃoamento de Pessoal de NÃvel Superior / Estudo farmacolÃgico do Ãleo essencial de Croton nepetaefolius Baill. sobre o mÃsculo liso traqueal e vascular e sobre as propriedades eletrofisiolÃgicas de neurÃnios fÃsicos de gÃnglio celÃaco. Pedro Jorge Caldas MagalhÃes, Tese de Doutorado em Farmacologia, UFC, 2002. Croton nepetaefolius Baill à um arbusto aromÃtico do Nordeste brasileiro, conhecido como âmarmeleiro sabiÃâ, utilizado na medicina popular como antiespasmÃdico e carminativo. Os principais constituintes do seu Ãleo essencial sÃo 1,8-cineol, metil-eugenol, xantoxilina e terpineol. Recentemente, demonstraram-se propriedades antiespasmÃdica intestinal, hipotensiva, antiinflamatÃria e analgÃsica para o Ãleo essencial do Croton nepetaefolius (OECN). Neste trabalho, caracterizamos os efeitos farmacolÃgicos do OECN sobre o mÃsculo liso respiratÃrio e vascular de rato e cobaio e sobre o funcionamento elÃtrico de neurÃnios de gÃnglio celÃaco de cobaio. Usamos preparaÃÃes in vitro de vasos sanguÃneos de ratos e cobaios machos (aorta e vasos mesentÃricos) e anÃis de traquÃia, mantidos em soluÃÃo nutridora, aerada, pH 7,4, a 37 oC, para registro isomÃtrico das contraÃÃes musculares. Usamos tambÃm gÃnglios celÃacos intactos de cobaios, mantidos em temperatura ambiente in vitro, para os registros eletrofisiolÃgicos pela tÃcnica do microeletrodo intracelular. In vivo, avaliamos as aÃÃes do OECN sobre a pressÃo arterial mÃdia e alguns parÃmetros cardÃacos, respiratÃrios e hematolÃgicos em ratos. O OECN (0,1 - 1000 microgrma/ml) relaxou o tÃnus basal (5 mM [K+]) e o tÃnus aumentado por K+ (60 mM) em traquÃia de cobaio, de maneira dependente de concentraÃÃo (CE50 de 4 e 63 micrograma/ml, respectivamente). Em tecidos de cobaios previamente sensibilizados, o OECN (300 e 600 micrograma/ml), reduziu a contraÃÃo induzida pela apresentaÃÃo do antÃgeno sensibilizante (ovalbumina). Na faixa de concentraÃÃo de 100 a 400 micrograma/ml, bloqueou as contraÃÃes induzidas por histamina e PGF2 alfa. O OECN inibiu as contraÃÃes induzidas por histamina, carbacol e KCl com CI50 na faixa de 100 - 130 micrograma/ml. Em aorta de rato e cobaio, relaxou a contraÃÃo induzida por 60 mM de K+ (CI50 de 32 e 200 micrograma/ml, respectivamente). Em rato, mas nÃo em cobaio, este relaxamento foi parcialmente inibido pela retirada do endotÃlio vascular ou pela adiÃÃo de 100 micrograma M de L-NAME. Em aorta de cobaio, o OECN inibiu as contraÃÃes independentes de Ca2+, induzidas por dibutirato de forbol e por K+ hiperosmolar na soluÃÃo nutridora. O OECN diminuiu preferencialmente a pressÃo arterial em ratos DOCA-sal do que em ratos nefrectomizados e, bloqueou mais potentemente as contraÃÃes induzidas pela fenilefrina em aorta de rato DOCA do que dos animais nefrectomizados. O OECN, metil-eugenol e terpineol, aumentam o fluxo de lÃquido pela circulaÃÃo mesentÃrica de rato, sendo este efeito parcialmente inibido pela presenÃa de L-NAME. Em nenhuma dessas preparaÃÃes o OECN produziu hiperpolarizaÃÃo do potencial transmembrana. Em neurÃnios fÃsicos de gÃnglio celÃaco de cobaio, o OECN diminuiu significativamente o aumento da excitabilidade produzido pela histamina sem alterar as propriedades passivas e ativas dos neurÃnios. Em conclusÃo, o OECN relaxa o mÃsculo liso das vias aÃreas, à um agente hipotensor e vasorelaxante e diminui a excitabilidade induzida por histamina em neurÃnios autonÃmicos. Seus efeitos sÃo, provavelmente, intracelulares ou mediados por proteÃna quinase C. / Croton nepetaefolius is an aromatic bush found in brazilian Northeast region, called âmarmeleiro sabiÃâ, and it is used in folk medicine as an antispasmodic and carminative agent. Its essential oil is comprised of 1,8-cineole, methyl-eugenol, xanthoxylin, terpineol and others constituents. Recent studies showed some pharmacological activities of the essential oil of Croton nepetaefolius (EOCN) as an intestinal antispasmodic, hypotensive, anti-inflammatory and analgesic agent. Our aim in this work was to evaluate the effects of EOCN on airway and vascular smooth muscle and also on autonomic neurons. We used in vitro models of rat and guinea-pig isolated vessels and guinea-pig tracheal rings for isometric recording of the smooth muscle contractions. Guinea-pig celiac ganglion, was used for intracellular microelectrode recording of electricophysiological signals. Moreover, mean arterial pressure, cardiovascular, respiratory and hematologic parameters were measured in vivo in rats. EOCN (0,1 â 1000 microgram/ml) relaxed basal and K+-increased guinea-pig tracheal tonus (EC50 = 4 and 63 microgram/ml, respectively), in a concentratation-dependent manner. In ovalbumin-sensitized guinea-pig tissues, EOCN inhibited the antigen-induced contraction. EOCN (100 - 400 microgram/ml) blocked the histamine- and PGF2alpha -induced contractions. The contractions induced by histamine, carbacol and KCl were inhibited by EOCN with IC50s between 100-130 microgram/ml. In rat and guinea-pig aortic rings, EOCN relaxed the 60 mM K+-induced contractions (IC50 = 32 and 200 microgram/ml, respectively). Only in rat tissues, this EOCN-induced relaxation was partially inhibited by both L-NAME (100 microgram M) or endothelium lack. In guinea-pig aortic rings, EOCN inhibited the Ca2+-independent phorbol esther- and hyperosmotic K+- induced contractions. EOCN, preferably, diminished the mean arterial pressure and inhibited the aortic rings phenylephrine-induced contractions in DOCA-salt treated rats rather than uninephrectomized rats. Both EOCN, methyl-eugenol and terpineol increased the flow through rat mesenteric bed. This effect was partially blocked by L-NAME (50 microgram M). EOCN did not produce hyperpolarization of the transmembrane potential. In celiac ganglion phasic neurons, EOCN signicantly inhibited the histamine-induced increase of the neuronal excitability. In conclusion, EOCN is an airway smooth muscle relaxant, hypotensor and vasorelaxant agent, and it is a blocker of the stimulant histamine activity on autonomic neurons. Its effects are, probably, mediated by an intracellular action or protein C kinase modulation.

[pt] O principal objetivo deste trabalho foi o desenvolvimento de métodosespectrofluorimétricos e de cromatografia líquida de alta eficiência em fase reversa(RP-HPLC, reversed-phase liquid chromatography) para análise de óleosessenciais cítricos (OEC). Para este fim, microemulsões livres de surfactante(SFMEs, surfactante-free microemulsions) foram utilizadas como uma abordagempara o tratamento das amostras.Primeiramente, a região de formação das SFMEs foi avaliada para diferentesproporções água:OE (1:4, 1:2, 1:1, 2:1, 4:1, m/m) na presença de propano-1-ol eoctan-1-ol (10:3 m/m). Titulações condutométricas indicaram agregados micelarescontendo OE (microemulsão do tipo óleo-em-água) para a proporção 4:1 (compartículas dispersas de raio hidrodinâmico de 95,7 ± 5,3 nm). Nessas condições, afluorescência aumentou, permitindo o uso da espectroscopia de fluorescência 3Dpara obtenção de padrões de impressão digital que foram utilizados para análisediscriminante de nove marcas brasileiras, juntamente com análise de componentes principais com desdobramento dos dados (UPCA, unfold principal components analysis). Uma variância cumulativa de 96,7 por cento foi obtida para os três primeiros componentes principais e os gráficos de pontuação mostraram uma localização distinta para cada grupo. Um estudo preliminar também mostrou a capacidade desses sistemas em avaliar condições de armazenamento e adulteração. O impacto das condições de armazenamento foi realizado ao longo de 21 dias expostos à luz, com resultados mostrando grandes diferenças espectrais em comparação com uma amostra armazenada em frasco âmbar a 22 graus C. A adulteração de OEs por fortificação com óleo de canola e óleo mineral foi detectada em diferentes níveis (1, 5, 10 e 20 por cento, m/m) e, além das diferenças espectrais, observou-se uma mudança na estabilidade da micro emulsão. Em uma segunda etapa do estudo, esses sistemas foram replicados para diferentes OEC, incluindo laranja doce e azeda, tangerina, limão e grape fruit. Estudos foram empregados para avaliar condições ótimas para a formação do sistema, visando abranger todos os OECs avaliados sem comprometer a reprodutibilidade da medição. A nova condição SFME adotada foi de 15 microL da fase oleosa contendo OE e octan-1-ol (1:2 v/v), 19 mL de água e propan-1-ol até o volume final de 25 mL. Além do baixo consumo de amostra, obteve-se um aumento significativo na fluorescência, apesar da menor proporção da fase oleosa. Os dados da matriz de excitação-emissão foram utilizados para análise de agrupamento. OUPCA foi aplicado com sucesso, com uma variância cumulativa de 99,5 por cento para os três primeiros componentes principais. A decomposição dos auto vetores revelou uma influência significativa dos comprimentos de onda de excitação/emissão de336/436 nm. Análises complementares por HPLC confirmaram a relação entre fluoróforos e a fração não volátil, característica dos OECs. A combinação de baixo consumo de amostra e alto teor de água torna a aplicação desses sistemas vantajosa para a diferenciação de OECs. A transparência e a baixa viscosidade também são consideradas aspectos positivos. Em uma terceira e última etapa, o efeito do meio de amostragem na análise de polimetoxiflavo nas (PMFs) no OE de laranja doce por RP-HPLC foi avaliado, utilizando o conhecimento adquirido nas etapas anteriores em relação à formação de sistemas SFMEs. Este estudo teve como foco a análise de PMFs presentes na fração não volátil do OE de laranja doce, que inclui tetra-O-metil-scutelareína, sinensetina, tangeretina, nobiletina e heptametoxiflavona. Dois métodos utilizando eluição isocrática com diferentes fases móveis, (A) água/metanol e (B)água/acetonitrila, foram empregados usando detecção absorciométrica e fluorimétrica. O meio de amostragem influenciou significativamente a eluição cromatográfica, afetando potencialmente a largura dos picos e o tempo de retenção, especialmente para tangeretina, onde um aumento de 300 e 103 por cento na intensidade de pico foi obtido para as fases móveis A e B, quando misturas com octan-1-ol foram utilizadas. Devido à coeluição entre nobiletina e tetra-O-metil scutelareína observada com a fase móvel A, o método foi validado utilizando a fase móvel B(acetonitrila/água, 50:50 por cento, v/v). A detecção de fluorescência forneceu valores delimites de detecção e quantificação mais baixos para sinensetina (1 e 3 microg mL-1) enobiletina (13 e 44 microg mL-1) do que os relatados na literatura. O método foi aplicado a amostras comerciais de OE de laranja doce, fornecendo resultados consistentes para todas as PMFs. / [en] The main goal of this work was the development of spectrofluorimetric and reversed-phase high-performance liquid chromatography (RP-HPLC) methods for citrus essential oils (CEO) analysis. For this purpose, surfactant-free microemulsions (SFMEs) were used as an approach for sample treatment. First, the SFME formation region was studied at different water:EO weight proportions (1:4, 1:2, 1:1, 2:1, 4:1 w/w) in the presence of propan-1-ol and octan-1-ol (10:3 w/w). Conductometric titrations indicated micellar aggregates containing EO (oil-in-water microemulsion) for the 4:1 proportion (droplets of hydrodynamic radius of 95.7 ± 5.3 nm). In such conditions, fluorescence increased allowing the use of 3D fluorescence spectroscopy to obtain spectroscopic fingerprint pattern that was used aiming discriminant analysis, considering nine EO Brazilian brands, along with unfold principal component analysis(UPCA). A cumulative variance of 96.7 percent was obtained for the first three principal components and score plots showed distinct location for each group. Preliminary study showed the capability of these systems in evaluating storage conditions, and adulteration. The impact of storage conditions was made over 21 days exposed to light with results showing large spectral differences compared to a sample stored in amber flask at 22 degrees C. Adulteration of EOs by canola and mineral oil fortification was detected at different levels (1, 5, 10 and 20 percent, w/w) and, in addition to the spectral differences, a change in microemulsion stability was observed. In a second stage of the study, these systems were replicated for different CEOs, including sweet and sour orange, tangerine, lemon, and grapefruit. Studies were employed to assess optimal conditions for system formation, aiming to encompass all evaluated CEOs without compromising measurement reproducibility. The new SFME condition adopted was 15 microL of the oily phase containing EO and octan-1-ol (1:2 v/v), 19 mL of water, and propan-1-ol up to the 25 mL final volume. In addition to low sample consumption, a significant increase in fluorescence was achieved, despite the lower proportion of the oily phase. Excitation-emission matrix data were utilized for clustering analysis. UPCA was successfully applied, with cumulative variance of 99.5 percent for the first three principal components. Eigenvectors decomposition revealed a significant influence of the 336/436 nm excitation/emission wavelengths. Complementary analyses by HPLC confirm the relationship between fluorophores and the non-volatile fraction, characteristic of CEOs. The combination of low sample consumption and high-water content makes the application of these systems advantageous for CEO differentiation. Transparency and low viscosity are also considered positive aspects. In a third and final stage, the effect of the sampling medium on the analysis of polymethoxyflavones (PMFs) in sweet orange EO by RP-HPLC was evaluated, utilizing the knowledge acquired in previous stages regarding the formation of SFME systems. This study was focused on analyzing PMFs present in the non-volatile fraction of sweet orange EO, which includes tetra-O-methyl-scutellarein, sinensetin, tangeretin, nobiletin, and heptamethoxyflavone. Two methods utilizing isocratic elution with different mobile phases, (A) water/methanol and (B) water/acetonitrile, were employed using absorciometric and fluorimetric detection. The sampling medium significantly influenced chromatographic elution, potentially affecting peak width and retention time, especially for tangeretin, where a 300 percent and 103 percent increase in peak intensity was obtained for mobile phases A and B, respectively, when mixtures with octan-1-ol were used. Due to co-elution between nobiletin and tetra-O-methyl scutelarein observed with mobile phase A, the method was validated using mobile phase B (acetonitrile and water 50:50 percent, v/v). Fluorescence detection provided lower LOD and LOQ values for sinensetin (1 and 3 microg mL -1 ) and nobiletin (13 and 44 microg mL -1 ) than reported in the literature. The method was applied to commercial sweet orange EOs samples, yielding consistent results for all PMFs.