O relógio biológico de plantas é uma rede regulatória de grande relevância para a adaptação dos organismos ao ambiente. Essa rede é composta por diversas vias de controle transcricional e pós-transcricional que se retroalimentam e geram ritmos biológicos. O controle exercido pelo relógio pode ser observado nos mais diversos aspectos da fisiologia e desenvolvimento de plantas. No presente projeto de pesquisa foi investigada a relação entre o relógio biológico e a sinalização por auxinas, uma classe de fitohormônios, em cana-de-açúcar. Foram utilizadas técnicas de expressão gênica, como RT-qPCR, para definição de um protocolo robusto de avaliação de respostas transcricionais a auxinas em plântulas de cana-de-açúcar geradas por organogênese direta. Após 1h da aplicação de 80 µM auxina sintética ácido 1-naftalenoacético, foi possível observar controle transcricional evidente exercido pela aplicação de auxina sobre alguns genes. Também foi observado variação na resposta obtida, dependendo do horário do ciclo circadiano em que o estímulo era oferecido. Esse fenômeno de controle temporal sobre a resposta a um estímulo é chamado gating, sendo de grande relevância para a atuação do relógio biológico de plantas. A partir dessas observações foram realizadas análises de expressão gênica em larga escala, usando oligoarranjos, para compreensão mais aprofundada da conexão entre o relógio biológico e a sinalização por auxinas em cana-de-açúcar. Entre os genes diferencialmente expressos após estímulo com auxina, foi verificado grande presença de genes relacionados a respostas contraestresse biótico. Além disso, as respostas observadas devem estar sobre o controle do relógio biológico de cana-de-açúcar. Diversos genes relacionados a combate a infecções, como quitinases e taumatinas, tiveram sua expressão alterada após aplicação de auxinas, sendo possível observar diferenças no padrão de expressão dos genes dependendo do horário em que auxina era aplicada. Dessa forma, o relógio biológico de cana-de-açúcar, a partir da sinalização por auxinas, deve exercer controle sobre as respostas a estresses bióticos nesse organismo. Os dados obtidos são inéditos e podem contribuir para o aumento da produtividade de cana-de-açúcar assim como para o desenvolvimento de novas ferramentas biotecnológicas focadas nesse cultivar, o qual apresenta grande relevância econômica / The circadian clock is a regulatory network with great relevance to fitness of plants. This network creates biological rhythms, influencing plants metabolism and their interaction with the environment. The clock is composed of interlocking feedback transcriptional and post-transcriptional pathways. In the presente study, we investigated the interconnection between circadian clock and signaling through auxins, a group of phytohormones with great impact to plant biology. Using RT-qPCR, it was established a protocol to measure transcriptional responses after synthetic auxin 1-naphtalenacetic acid (NAA) treatment. The biological material used was leaves of sugarcane plantlets generated by direct organogenesis. After 1h treatment with 80 µM NAA, we observed obvious transcriptional responses in sugarcane plantlets. It was also possible to detect alterations of transcriptional responses according to the moment when the stimulus was offered. This temporal control is called gating and is of great relevance to plant circadian clocks. We then performed transcriptomic analysis, using oligoarrays, to get a deeper understanding of the results obtained. Indeed, it was verified that auxin stimulus is connected to biotic stress transcriptional responses and that these responses are clock-controlled. Transcripts coding for proteins like chitinases and thaumatins, which are related to biotic stress responses, were differentially expressed after auxin treatment. Also, the response of most genes was daytime-dependent. We conclude that sugarcane circadian clock, through auxin signaling, might exert control under biotic stressresponses in sugarcane. The data obtained are novelty and may contribute to increase sugarcane productivity and/or to development of new biotechnological tools dedicated to this cultivar.

O relógio biológico de plantas é uma rede regulatória de grande relevância para a adaptação dos organismos ao ambiente. Essa rede é composta por diversas vias de controle transcricional e pós-transcricional que se retroalimentam e geram ritmos biológicos. O controle exercido pelo relógio pode ser observado nos mais diversos aspectos da fisiologia e desenvolvimento de plantas. No presente projeto de pesquisa foi investigada a relação entre o relógio biológico e a sinalização por auxinas, uma classe de fitohormônios, em cana-de-açúcar. Foram utilizadas técnicas de expressão gênica, como RT-qPCR, para definição de um protocolo robusto de avaliação de respostas transcricionais a auxinas em plântulas de cana-de-açúcar geradas por organogênese direta. Após 1h da aplicação de 80 µM auxina sintética ácido 1-naftalenoacético, foi possível observar controle transcricional evidente exercido pela aplicação de auxina sobre alguns genes. Também foi observado variação na resposta obtida, dependendo do horário do ciclo circadiano em que o estímulo era oferecido. Esse fenômeno de controle temporal sobre a resposta a um estímulo é chamado gating, sendo de grande relevância para a atuação do relógio biológico de plantas. A partir dessas observações foram realizadas análises de expressão gênica em larga escala, usando oligoarranjos, para compreensão mais aprofundada da conexão entre o relógio biológico e a sinalização por auxinas em cana-de-açúcar. Entre os genes diferencialmente expressos após estímulo com auxina, foi verificado grande presença de genes relacionados a respostas contraestresse biótico. Além disso, as respostas observadas devem estar sobre o controle do relógio biológico de cana-de-açúcar. Diversos genes relacionados a combate a infecções, como quitinases e taumatinas, tiveram sua expressão alterada após aplicação de auxinas, sendo possível observar diferenças no padrão de expressão dos genes dependendo do horário em que auxina era aplicada. Dessa forma, o relógio biológico de cana-de-açúcar, a partir da sinalização por auxinas, deve exercer controle sobre as respostas a estresses bióticos nesse organismo. Os dados obtidos são inéditos e podem contribuir para o aumento da produtividade de cana-de-açúcar assim como para o desenvolvimento de novas ferramentas biotecnológicas focadas nesse cultivar, o qual apresenta grande relevância econômica / The circadian clock is a regulatory network with great relevance to fitness of plants. This network creates biological rhythms, influencing plants metabolism and their interaction with the environment. The clock is composed of interlocking feedback transcriptional and post-transcriptional pathways. In the presente study, we investigated the interconnection between circadian clock and signaling through auxins, a group of phytohormones with great impact to plant biology. Using RT-qPCR, it was established a protocol to measure transcriptional responses after synthetic auxin 1-naphtalenacetic acid (NAA) treatment. The biological material used was leaves of sugarcane plantlets generated by direct organogenesis. After 1h treatment with 80 µM NAA, we observed obvious transcriptional responses in sugarcane plantlets. It was also possible to detect alterations of transcriptional responses according to the moment when the stimulus was offered. This temporal control is called gating and is of great relevance to plant circadian clocks. We then performed transcriptomic analysis, using oligoarrays, to get a deeper understanding of the results obtained. Indeed, it was verified that auxin stimulus is connected to biotic stress transcriptional responses and that these responses are clock-controlled. Transcripts coding for proteins like chitinases and thaumatins, which are related to biotic stress responses, were differentially expressed after auxin treatment. Also, the response of most genes was daytime-dependent. We conclude that sugarcane circadian clock, through auxin signaling, might exert control under biotic stressresponses in sugarcane. The data obtained are novelty and may contribute to increase sugarcane productivity and/or to development of new biotechnological tools dedicated to this cultivar.

Trabalhos recentes indicam que a maior parte do transcriptoma de células de mamíferos é composto por RNAs não-codificadores de proteínas (ncRNAs). Nosso grupo tem identificado e caracterizado ncRNAs longos (>200 nt), sem splicing, expressos em regiões intrônicas de genes codificadores de proteína. Contudo, a biogênese, processamento e localização sub-celular desta classe de RNAs permanecem desconhecidos. Este trabalho teve como objetivos i) investigar a contribuição da RNA Polimerase II (RNAP II) na transcrição de ncRNAs intrônicos, ii) avaliar a meia-vida destes ncRNAs em relação a mRNAs, e iii) verificar a distribuição sub-celular de ncRNAs intrônicos. Os resultados obtidos indicaram que ncRNAs intrônicos são predominantemente transcritos pela RNAP II a partir de regiões promotoras funcionalmente semelhantes as que controlam a transcrição de mRNAs. Ensaios de estabilidade revelaram que, em média, ncRNAs intrônicos possuem meia-vida igual ou maior (3,4h a 4,2h) do que mRNAs (3,1h). A maior parte dos ncRNAs intrônicos possui estrutura cap 5\', sugerindo que sejam estabilizados para desempenhar papéis na biologia da célula que não dependam de um rápido turnover. A maior parte dos ncRNAs intrônicos é exportada para o citoplasma, indicando que devam exercer alguma função biológica neste compartimento. Em conjunto, este trabalho fornece informações novas a respeito da biogênese, estabilidade e localização sub-celular ncRNAs intrônicos expressos em células humanas, contribuindo para avançar o conhecimento sobre esta classe de transcritos celulares. / Recent studies have shown that most of the mammalian transcriptome is comprised of non-coding RNAs (lncRNAs). Our group has identified and characterized long (>200 nt), unspliced lncRNAs expressed in intronic regions of protein coding genes. However, the biogenesis, processing, stability and subcellular localization of members from this RNA class remain unknown. The aims of this work were i) to investigate the contribution of RNA Polymerase II (RNAP II) to the transcription of intronic, ii) to evaluate the half-life of these ncRNAs relative to mRNAs, and iii) determine their subcellular distribution. Our results indicate that intronic ncRNAs are predominantly transcribed by RNAP II from promoter regions functionally similar to those that control the transcription of mRNAs. Stability assays revealed that intronic ncRNAs have an average half-life equal or greater (3.4h to 4.2h) than mRNAs (3.1h). The majority of intronic ncRNAs have 5\' cap modification suggesting that these transcripts are stabilized, possibly to exert roles in the biology of the cell that does not depend on a rapid turnover. Although intronic ncRNAs do not encode proteins, most of these transcripts are transported to the cytoplasm which indicates that they may perform some biological function in this compartment. Altogether, this study reveals with novel information regarding the biogenesis, stability and subcellular localization of intronic ncRNAs expressed in human cells, thus contributing to advance the knowledge on this class of cellular transcripts.

Trabalhos recentes indicam que a maior parte do transcriptoma de células de mamíferos é composto por RNAs não-codificadores de proteínas (ncRNAs). Nosso grupo tem identificado e caracterizado ncRNAs longos (>200 nt), sem splicing, expressos em regiões intrônicas de genes codificadores de proteína. Contudo, a biogênese, processamento e localização sub-celular desta classe de RNAs permanecem desconhecidos. Este trabalho teve como objetivos i) investigar a contribuição da RNA Polimerase II (RNAP II) na transcrição de ncRNAs intrônicos, ii) avaliar a meia-vida destes ncRNAs em relação a mRNAs, e iii) verificar a distribuição sub-celular de ncRNAs intrônicos. Os resultados obtidos indicaram que ncRNAs intrônicos são predominantemente transcritos pela RNAP II a partir de regiões promotoras funcionalmente semelhantes as que controlam a transcrição de mRNAs. Ensaios de estabilidade revelaram que, em média, ncRNAs intrônicos possuem meia-vida igual ou maior (3,4h a 4,2h) do que mRNAs (3,1h). A maior parte dos ncRNAs intrônicos possui estrutura cap 5\', sugerindo que sejam estabilizados para desempenhar papéis na biologia da célula que não dependam de um rápido turnover. A maior parte dos ncRNAs intrônicos é exportada para o citoplasma, indicando que devam exercer alguma função biológica neste compartimento. Em conjunto, este trabalho fornece informações novas a respeito da biogênese, estabilidade e localização sub-celular ncRNAs intrônicos expressos em células humanas, contribuindo para avançar o conhecimento sobre esta classe de transcritos celulares. / Recent studies have shown that most of the mammalian transcriptome is comprised of non-coding RNAs (lncRNAs). Our group has identified and characterized long (>200 nt), unspliced lncRNAs expressed in intronic regions of protein coding genes. However, the biogenesis, processing, stability and subcellular localization of members from this RNA class remain unknown. The aims of this work were i) to investigate the contribution of RNA Polymerase II (RNAP II) to the transcription of intronic, ii) to evaluate the half-life of these ncRNAs relative to mRNAs, and iii) determine their subcellular distribution. Our results indicate that intronic ncRNAs are predominantly transcribed by RNAP II from promoter regions functionally similar to those that control the transcription of mRNAs. Stability assays revealed that intronic ncRNAs have an average half-life equal or greater (3.4h to 4.2h) than mRNAs (3.1h). The majority of intronic ncRNAs have 5\' cap modification suggesting that these transcripts are stabilized, possibly to exert roles in the biology of the cell that does not depend on a rapid turnover. Although intronic ncRNAs do not encode proteins, most of these transcripts are transported to the cytoplasm which indicates that they may perform some biological function in this compartment. Altogether, this study reveals with novel information regarding the biogenesis, stability and subcellular localization of intronic ncRNAs expressed in human cells, thus contributing to advance the knowledge on this class of cellular transcripts.