Los receptores acoplados a proteína G o de siete dominios transmembrana (GPCRs o 7TMR) constituyen la mayor superfamilia de receptores de membrana involucrados en la transducción de una señal extracelular al interior de la célula. Estos receptores de membrana controlan una gran variedad de procesos fisiológicos entre los que se pueden citar el metabolismo celular, la secreción, la diferenciación y crecimiento celular, respuestas inflamatorias e inmune, así como la neurotransmisión.A partir de los años 90 resurgió con fuerza la idea de la oligomerización entre receptores acoplados a proteína G. Continuamente van apareciendo nuevos trabajos que ya no ponen en duda la formación de dichos oligómeros y lo que es más, en algunos casos existe una relación entre el estado de oligomerización del receptor y su funcionalidad. En esta tesis doctoral se aborda la homo- y la heterodimerización entre receptores de adenosina, dopamina y glutamato desde las más variadas perspectivas y estrategias experimentales. De esta manera se ha estudiado la homodimerización del receptor A2a de adenosina y la presencia de dichos homodímeros a nivel de la superficie celular. También se han demostrado la formación de heterodímeros entre los receptores A1 de adenosina y metabotrópico de glutamato 1alfa, así como entre los receptores A2a de adenosina y metabotrópico de glutamato 5. Por último, también se aportan evidencias de la interacción directa entre receptores A2a de adenosina y D2 de dopamina.La oligomerización entre estos receptores puede ser tanto directa como indirecta, a través de terceras proteínas. Para determinar las proteínas intracelulares que interaccionan con el receptor A2a de adenosina y que pudieran mediar en sus interacciones con otros receptores, se han llevado a cabo experimentos de doble híbrido en levadura. Utilizando el dominio C-terminal del receptor A2a de adenosina como anzuelo para llevar a cabo un screening de una librería de cerebro de ratón, se ha podido determinar su interacción con una proteína del citoesqueleto de actina denominada alfa-actinina. También se ha podido demostrar que esta asociación del receptor A2a con el citoesqueleto de actina juega un papel muy importante en el tráfico del receptor, tanto en su clusterización como internalización inducidas por ligando.Los lipid rafts son microdominios de membrana que contienen altas concentraciones de colesterol y de esfingolípidos, constituyendo regiones de membrana con una alta ordenación y resistentes a la extracción con detergentes no-iónicos. Se aislan como una fracción ligera de membrana o de baja densidad por ultracentrifugación. Las caveolas son pequeñas invaginaciones de la membrana (de 50 a 100 nm de diámetro) que se consideran un subtipo de lipid raft. Estas invaginaciones de la membrana se mantienen estructural y morfológicamente gracias a una familia de proteínas, las caveolinas, de las cuales deriva el nombre de las caveolas. En estos microdominios de la membrana plasmática se segregan diferentes tipos de proteínas, muchas de las cuales están involucradas en la transducción de la señal. Esto ha llevado a postular que dichos microdominios pueden actuar como plataformas de señalización. Como parte del trabajo realizado en esta tesis doctoral, se ha podido demostrar la localización e internalización del receptor A1 de adenosina a través de vesículas de caveolas. Así mismo, también se ha demostrado una interacción funcional entre el receptor metabotrópico de glutamato 1alfa y las caveolinas. Por un lado, el receptor es capaz de modificar la localización subcelular de la caveolina-2beta desde los lipid droplets, o acúmulos intracelulares de lípidos, hacia la membrana plasmática, mientras que la caveolina-1 es capaz de regular la actividad basal o constitutiva del receptor.

Los transportadores heteroméricos de aminoácidos (HAT) están formados por una subunidad ligera (LSHAT) y una subunidad pesada (HSHAT) unidas entre ellas mediante un puente disulfuro.Se han descrito dos HSHATs: rBAT, y 4F2hc. Son glicoproteínas de membrana de tipo II, con un extremo N-terminal intracelular, un único dominio trans-membrana y un extremo C-terminal extracelular homólogo a las alfa-amilasas.Hasta el momento se han identificado 9 LSHATS: 6 se unen a 4F2hc para dar lugar al transportador funcional (LAT-1, LAT-2, y+LAT-1, y+LAT-2, asc-1, xCT), una se une a rBAT (bo,+ AT) y existen dos miembros "huérfanos" (asc-2, AGT-1), que no interaccionan con las HSHATs descritas y que quizás se unen a HSHATs todavía por identificar. Las diferentes LSHAT presentan las siguientes características estructurales y funcionales comunes: 1. Son proteínas altamente hidrofóbicas no glicosiladas. 2. Presentan una predicción de estructura de 12 segmentos trans-membrana, con extremos N y C-terminal intracelulares. Esta topología se ha demostrado para la subunidad ligera xCT, que presenta además un reentrant-loop entre los segmentos trans-membrana 2 y 3, con evidencias funcionales de su proximidad a la vía de translocación de sustrato.3. El residuo de cisteína conservado que interviene en la formación del puente disulfuro se encuentra localizado en el dominio extracelular putativo II.4. Necesitan la coexpresión de la HSHAT para alcanzar la membrana plasmática en un sistema de expresión heterólogo. 5. Confieren la especificidad de transporte al complejo heteromérico, representando una gran diversidad de sustratos y acoplamiento a iones: aminoácidos neutros de tamaño grande (LAT-1, LAT-2), pequeño (asc-1, LAT-2), cargados negativamente (xCT) y aminoácidos básicos y neutros (y+LAT-1, y+LAT-2 y bo,+AT).6. Se comportan como intercambiadores obligatorios con una estequiometría 1:1 y con una afinidad intracelular aparente por el sustrato mucho menor que la extracelular, excepto para el caso asc-1/4F2hc, y quizás asc-2, que se comporta como un intercambiador no obligatorio.7. La LSHAT es capaz de mediar el transporte en ausencia de la subunidad pesada cuando se consigue expresarla en superficie, como ocurre en un sistema reconstituido.rBAT (codificada por el gen SLC3A1) y bo,+AT (codificada por el gen SLC7A9) forman el sistema bo,+, que transporta aminoácidos neutros y básicos. Defectos en este sistema de transporte causan cistinuria. La cistinuria (OMIM 220100) es una enfermedad hereditaria, autosómica recesiva, causada por el defecto en la absorción intestinal y la reabsorción renal de aminoácidos básicos (lisina, arginina, ornitina) y cistina. Debido a su baja solubilidad, la cistina precipita formando cálculos a lo largo del sistema urinario. Los cálculos causan obstrucción, infecciones y, en último término, insuficiencia renal. Mutaciones en SLC3A1 causan cistinuria tipo I (recesiva completa: los heterozigotos no presentan hiperexcreción de aminoácidos) y mutaciones en SLC7A9 causan cistinuria tipo no I (recesiva incompleta: los heterozigotos hiperexcretan los cuatro aminoácidos en menor medida que los homozigotos cistinúricos y raramente llegan a desarrollar cálculos).En esta tesis se ha realizado un análisis mutacional de rBAT (SLC3A1) en familias cistinúricas, y estudios de relación estructura-función con las LSHATS bo,+AT y xCT. Debido al solapamiento de fenotipos encontrado en los portadores con mutaciones en SLC3A1 o SLC7A9, se ha establecido una nueva clasificación de la cistinuria, basada en datos genéticos. Los estudios de relación estructura-función han dado lugar a la identificación de un residuo en xCT (C327) próximo al lugar de unión y/o translocación de sustrato, y a la determinación de la unidad funcional mínima en xCT y bo,+AT, formada por una única subunidad ligera. Con estos resultados, y con los conocimientos que tenemos de esta familia de transportadores, proponemos que en una subunidad ligera coexisten dos vías de translocación asimétricas, una para el influjo, y otra para el eflujo. / Heteromeric amino acid transporters (HATs) are composed by disulfide-linked heavy (HSHAT) and light (LSHAT) subunits. HSHATs are type II membrane glycoproteins with a large extracellular domain and are involved in trafficking of the heterodimer to the plasma membrane. The LSHAT is a polytopic membrane protein that confers transport function and specificity. Two HSHATs are known, rBAT and 4F2hc. rBAT forms system b0,+ with the light subunit b0,+AT. 4F2hc forms two different system L isoforms with LAT1 and LAT2, two different system y+L isoforms with y+LAT1 and y+LAT2, system asc with asc1, and system xC- with xCT.Mutations in rBAT (SLC3A1 gene) or b0,+AT (SLC7A9 gene) cause cistinuria, an autosomal inherited metabolic disorder characterised by impaired transport of cystine and dibasic amino acids in the renal tubule and the gastrointestinal tract. High cystine concentration in the urinary tract often causes the formation of cystine stones. SLC3A1 mutations cause type I cystinuria (recessive form) and SLC7A9 mutations cause non-type I cistinuria (dominant form with incomplete penetrance). Mixed cistinuria has also been described. Mutational analysis in SLC3A1 realized in this thesis, together with mutational analysis in SLC7A9 in 164 families of the International Cystinuria Consortium database, established a new genetic classification: type A, with two mutations in SLC3A1; type B, with two mutations in SLC7A9; and type AB, with one mutation on each gene. Digenic inheritance in two mixed families caused partial phenotype.Little is known about the structure-function relationships of the HATs. Structure-function studies realized in this thesis demonstrate that Cys327 in transmembrane domain 8 of xCT is the target for transport inactivation by sulfhydril reagents. Protection and kinetic experiments suggest that Cys327 is close to the substrate permeation pathway. On the other hand, co-injection of xCT or b0,+AT sensitive (wild type) and insensitive (xCT C327S and b0,+AT C321S) to the inactivation by sulfhydryl reagents, and/or the effect of these reagents on concatamers indicate that the heterodimer is the functional unit of systems b0,+ and xc-. Together, with earlier studies on system b0,+, the results suggest that two asymmetric translocation pathways (export and import) co-exist simultaneously on a single LSHAT subunit.