Tesis por compendio / La presente tesis doctoral titulada "Design of new nanostructured systems with applications in the field of recognition and diagnosis" está enfocada en el diseño y síntesis de nuevos materiales híbridos con función de puerta molecular. El primer capítulo presenta el diseño de un nuevo nanodispositivo para la detección de Bisfenol A una toxina letal. Se han utilizado nanopartículas de sílice mesoporosas cargadas con rodamina B y funcionalizadas con grupos isocianato. El diseño se basa en la utilización de un aptámero, que reconoce a Bisfenol A, como puerta molecular. Este aptámero une a la superficie de las nanopartículas bloqueando los poros. Únicamente en presencia de Bisfenol A, se activa la liberación del colorante, que puede medirse mediante espectroscopia de fluorescencia. Hasta el momento, no se había descrito ningún material que utilizara el concepto de puerta molecular para la detección fluorogénica de Bisfenol A. En el siguiente capítulo se han diseñado nuevos nanodispositivos para la detección de Ocratoxina A, una molécula carcinógena. Se compone de nanopartículas de sílice mesoporosa donde los poros se tapan con un aptámero específico para este analito. Estas nanopartículas se cargan con rodamina B y su superficie se funcionaliza con grupos isocianato o amino, que permiten unir el aptámero por vía covalente o electrostática respectivamente. En presencia de la molécula Ocratoxina A, el aptámero la reconoce separándose de la superficie y permitiendo la liberación del colorante que puede analizarse mediante espectroscopia de fluorescencia. El sistema presenta elevada eficacia en medios reales, además de aportar un método sencillo y de bajo coste para poder realizar los análisis. En otro capítulo de la tesis, se ha desarrollado un nanodispositivo para la detección de cocaína basado en soportes de alúmina anódica nanoporosa, cargados con el colorante rodamina B y donde los poros se cierran usando un aptámero específico para cocaína. En presencia del estupefaciente, el aptámero se desplaza de la superficie nanoporosa, permitiendo que la rodamina B salga del interior de los poros a la disolución. El sistema responde en medios reales. Además, la reutilización del soporte de alúmina fue estudiada. En el siguiente capítulo un nuevo nanodispositivo capaz de detectar ADN de Candida albicans es desarrollado. Se ha empleado alúmina anódica nanoporosa como soporte, se ha cargado con rodamina B y funcionalizado con grupos isocianato. Una secuencia específica para C. albicans, bloquea los poros. De este modo, en presencia de ADN de C. albicans el oligonucleótido presenta más afinidad por el ADN que por la unión a la superficie de alúmina funcionalizadas, se separa de la superficie produciendo la liberación del colorante en el medio exterior. Se ha realizado un amplio estudio de este sistema en presencia de ADN de otros patógenos, demostrándose la gran selectividad. Finalmente, el sistema se ha validado en muestras reales de pacientes infectados por C. albicans, obteniendo resultados excelentes que mejoran en tiempo a los que de manera rutinaria se utilizan para su detección. El sistema desarrollado ha sido protegido a través de una patente. En el séptimo capítulo de la tesis se describe la síntesis, caracterización y capacidades sensoras de nanopartículas de sílice para la detección de miRNA-145. El diseño en nanopartículas de sílice mesoporosas cargadas con rodamina B, funcionalizadas con grupos isocianato o amino y que emplean varias secuencias específicas y selectivas a este miRNA para bloquear los poros de las nanopartículas. En presencia de miRNA-145, la formación de estructuras entre las secuencias y el miRNA-145 desencadena la liberación del colorante que puede seguirse por espectroscopia de fluorescencia. Además, se muestra el funcionamiento del sistema en suero humano. Se trata de un método simple, transportable que puede ser fácilmente mod / The present doctoral thesis entitled "Design of new nanostructured systems with applications in the field of recognition and diagnosis" is focused on the design and synthesis of new hybrid materials with molecular gate function. The first chapter presents the design of a new nanodevice for the detection of Bisphenol A, lethal toxin. Mesoporous silica nanoparticles loaded with rhodamine B and functionalized with isocyanate groups have been used. The design is based on the use of an aptamer, which recognizes Bisphenol A, as a molecular gate. This aptamer is attached to the surface of the nanoparticles blocking the pores. Only in the presence of Bisphenol A, the release of the dye is activated, which can be measured by fluorescence spectroscopy. Until now, any material using the molecular gate concept for the fluorogenic detection of Bisphenol A has been described. In the next chapter, new nanodevices have been designed for the detection of Ochratoxin A, a carcinogenic molecule. It is composed of mesoporous silica nanoparticles where the pores are capped with a specific aptamer for this analyte. These nanoparticles are loaded with rhodamine B and its surface is functionalized with isocyanate or amino groups, which allow the aptamer to be attched covalently or electrostatically, respectively. In the presence of the molecule, the aptamer recognizes it by displacemen from the surface and allowing the release of the dye that can be measured by fluorescence spectroscopy. The system has high efficiency in real media, in addition to providing a simple and low cost method to perform the measurements. In another chapter, a nanodevice has been developed for the detection of cocaine based on nanoporous anodic alumina supports, loaded with the rhodamine B dye and where the pores are closed using a specific aptamer for cocaine. In the presence of the narcotic drug, the aptamer is displaced from the nanoporous surface, allowing rhodamine B to escape from the interior of the pores to the solution. The system responds in real media. In addition, the reuse of alumina support was studied. In the next chapter a new nanodevice capable of detecting DNA from Candida albicans is developed. Nanoporous anodic alumina has been used as support, loaded with rhodamine B and functionalized with isocyanate groups. A specific sequence for C. albicans blocks the pores. Thus, in the presence of C. albicans DNA, the oligonucleotide has more affinity for the DNA than for functionalized alumina surface binding, it is separated from the surface producing the release of the dye in the external medium. An extensive study of this system has been carried out in the presence of DNA from other pathogens, demonstrating the great selectivity. Finally, the system has been validated in real samples of patients infected by C. albicans, obtaining excellent results that improve in time to those that are routinely used for their detection. The developed system has been protected through a patent. The seventh chapter of the thesis describes the synthesis, characterization and sensory capacities of silica nanoparticles for the detection of miRNA-145. The design in mesoporous silica nanoparticles loaded with rhodamine B, functionalized with isocyanate or amino groups and using several specific and selective sequences to this miRNA to block the pores of the nanoparticles. In the presence of miRNA-145, the formation of structures between the sequences and the miRNA-145 triggers the release of the dye that can be followed by fluorescence spectroscopy. In addition, the functioning of the system in human serum is shown. It is a simple, transportable method that can be easily modified for different types of miRNA. / La present tesi doctoral titulada "Design of new nanostructured systems with applications in the field of recognition and diagnosis" està enfocada en el disseny i síntesi de nous materials híbrids amb funció de porta molecular. El primer capitol presenta el disseny d'un nou nanodispositiu per a la detecció de Bisfenol A una toxina letal. S'han utilitzat nanopartícules de sílice mesoporoses carregades amb rodamina B i funcionalitzades amb grups isocianat. El disseny es basa en l'utilització d'un aptàmer, que reconeix específicament al Bisfenol A, com a porta molecular. Aquest aptàmer s'uneix a la superfície de les nanopartícules bloquejant els porus. Únicament en presència de Bisfenol A, s'activa l'alliberament del colorant, que pot mesurar-se mitjançant espectroscòpia de fluorescència. Fins el moment, no s'havia descrit cap material que utilitzara el concepte de porta molecular per a la detecció fluorogènica de Bisfenol A. En el següent capítol s'han dissenyat dos nous nanodispositius per a la detecció d'Ocratoxina A, una molècula carcinògena. El sistema es compon de nanopartícules de sílice mesoporosa on els porus es tapen amb un aptàmer específic per a aquest analit. Aquestes nanopartícules es carreguen amb rodamina B i la seua superfície es funcionalitza amb grups isocianat o amino, que permeten unir l'aptàmer per via covalent o electrostàtica respectivament. En presència de la molècula d'Ocratoxina A, l'aptàmer reconeix l'analit separant-se de la superfície i permetent l'alliberament del colorant que pot analitzar-se mitjançant espectroscòpia de fluorescència. El sistema presenta elevada eficàcia en medis reals, a més d'aportar un mètode senzill i de baix cost per a poder realitzar les anàlisis. En un altre capítol de la tesi, s'ha desenvolupat un nanodispositiu per a la detecció de cocaïna basat en suports d'alúmina anòdica nanoporosa, carregats amb el colorant rodamina B i on els porus es tanquen fent servir un aptàmer específic per a cocaïna. En presència de l'estupefaent, l'aptàmer es desplaça de la superfície nanoporosa, permetent que la rodamina B ixca de l'interior dels porus a la dissolució. El sistema respon en medis reals. A més, també es va estudiar la possible reutilització del suport d'alúmina. En el següent capítol s'ha desenvolupat un nou nanodispositiu capaç de detectar ADN de Candida albicans. En particular, s'ha emprat alúmina anòdica nanoporosa com a suport, que s'ha carregat amb rodamina B i funcionalitzat amb grups isocianat. Per al bloqueig dels porus s'ha utilitzat una seqüència d'oligonucleòtids específica per a Candida albicans. D'aquesta manera, en presència d'ADN de Candida albicans l'oligonucleòtid presenta més afinitat per l'ADN que per la unió a la superfície d'alumina funcionalitzada, es separa de la superfície produint l'alliberament del colorant al medi exterior. S'ha realitzat un ampli estudi d'aquest sistema en presència d'ADN d'altres patògens, demostrant-se la gran selectivitat. Finalment, el sistema s'ha validat en mostres reals de pacients infectats per Candida albicans, obtenint resultats excel¿lents que milloren en temps als que de manera rutinària s'utilitzen per a la seua detecció. El sistema desenvolupat ha sigut protegit a través d'una patent. En el setè capítol de la tesi es descriu la síntesi, caracterització i capacitats sensores de nanopartícules de sílice per a la detecció de miRNA-145. El disseny en nanopartícules de sílice mesoporoses carregades amb rodamina B, funcionalitzades amb grups isocianat o amino i que empren diverses seqüències específiques i selectives a aquest miRNA per bloquejar els porus de les nanopartícules. En presència de miRNA-145, la formació d'estructures entre les seqüències i el miRNA-145 desencadena l'alliberament del colorant que pot seguir-se per espectroscòpia de fluorescència. A més, es mostra el funcionament del sistema en sèrum humà. Es t / Ribes Momparler, Á. (2018). DESIGN OF NEW NANOSTRUCTURES SYSTEMS WITH APPLICATIONS IN THE FIELD OF RECOGNITION AND DIAGNOSIS [Tesis doctoral]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/107954 / Compendio

[ES] La presente tesis "Vías de inmovilización de biomoléculas sobre SU-8 y otras superficies poliméricas para su utilización en biosensado óptico sin marcaje" tiene como objetivo el diseño, desarrollo y evaluación de diferentes métodos de anclaje de biorreceptores en distintos materiales, en formato de micromatriz, con aplicación en biosensado. En la actualidad sigue siendo un área de creciente interés desarrollar nuevos sistemas de análisis para la detección de analitos, más sensibles y selectivos, con tiempos de análisis reducidos, miniaturizables y automatizables. Estos desarrollos pueden aplicarse en dispositivos biosensores que encuentran su aplicación en campos tan diversos como diagnóstico clínico, medicina forense y medio ambiente. Con el objetivo de desarrollar biosensores con prestaciones mejoradas se estudiaron estrategias de inmovilización de sondas sobre el soporte de ensayo basadas en el empleo de hidrogeles. En una primera fase, los desarrollos se realizaron usando tecnología de micromatrices de fluorescencia, que permite utilizar una menor cantidad de muestra y analizar múltiples analitos y muestras a la vez, reduciendo el tiempo de análisis y el coste Posteriormente, los desarrollos ya optimizados se emplearon para la puesta a punto de un biosensor óptico sin marcaje de tipo BICELL (Biophotonic Sensing Cells) en colaboración con la UPM (Universidad Politecnica de Madrid), que se aplicaron a sistemas modelo y a problemas reales. Asimismo, y en colaboración con el Centro de Tecnología Nanofotónica de la UPV, se implementó la estrategia de inmovilización a través del uso de hidrogeles, en biosensores ópticos sin marcaje constituidos por guías de ondas corrugadas. En este caso, además de la inmovilización a través de hidrogeles, se estudió un método de inmovilización covalente de fragmentos de anticuerpos que permitió su fijación orientada y muy próxima a la superficie del sensor. La tesis se estructura en seis capítulos. En el Capítulo 1 se da una visión general del concepto de biosensado, atendiendo a las distintas clasificaciones y los diferentes aspectos que hay que considerar en su diseño. En el Capítulo 2 se plantean los objetivos generales y particulares de la tesis. El Capítulo 3 plantea la aplicación de dos hidrogeles fotoinducidos derivados de fosforicolina y dextrano para mejorar la inmovilización de biomoléculas en formato micromatriz, sobre superficies planas y usando el formato de micromatriz de fluorescencia para realizar ensayos de detección con proteínas y oligonucleótidos. La polimerización del gel y el anclaje de las sondas se lleva a cabo simultáneamente mediante la utilización de reacciones fotoinducidas empleando la química click de acoplamiento tiol-eno. En el Capítulo 4 se implementa el método desarrollado en micromatriz con uno de los hidrogeles en dos tipos de biosensores interferométricos sin marcaje fabricados en SU-8. Con ambos sensores se detecta CRP en suero con muy buena sensibilidad (, LOD de 21 pg/mL). Por otro lado, esta estrategia se ensaya también en sensores nanofotónicos basados en guías de ondas corrugadas con resultados prometedores. En este capítulo también se pone a punto y se evalúa en tiempo real la inmovilización de fragmentos de anticuerpo sobre la superficie del sensor nanofotónico, mediante la reacción de acoplamiento tiol-eno inducida por luz UV. La monitorización en tiempo real permite demostrar el papel indispensable de la luz en el proceso de inmovilización. Utilizando esta aproximación se ensaya la detección sin marcaje de tres biomarcadores cardíacos de interés (CRP, cTnI/T y Mioglobina). El quinto capítulo se dedica a la descripción detallada de todos los procedimientos experimentales que se llevan a cabo en los Capítulos 3 y 4. Finalmente, el Capítulo 6 recoge las conclusiones alcanzadas a partir de los resultados obtenidos en el desarrollo de la tesis doctoral. / [EN] This thesis "Biomolecule immobilization approaches on SU-8 and other polymer surfaces for label-free optical biosensing" aims to design, develop and evaluate different methods for anchoring bioreceptors in different materials, in a microarray format, with application in biosensing. Currently, it is still an area of growing interest to develop new analysis systems for the detection of biomolecules, being more sensitive and selective, with reduced analysis time, miniaturizable and automatable. These developments can be applied in biosensing devices that find utility in fields as diverse as clinical diagnosis, forensic medicine and environmental monitoring. To develop biosensors with improved performance, here strategies for immobilization of probes on the test support based on the use of hydrogels were studied. In a first phase, the developments were carried out using microarray technology, which uses lower amount of sample and can analyze multiple targets and samples at the same time, reducing tests time and cost. Subsequently, the optimized developments were used to develop, in collaboration with UPM (Polytechnic University of Madrid), a label-free optical biosensor based onBICELLs (Biophotonic Sensing Cells), which were applied to model systems and real samples. Likewise, and in collaboration with the Nanophotonic Technology Center at UPV, the hydrogel-based immobilization strategy was implemented in other label-free nanophotonic biosensors consisting of corrugated waveguides. In this case, in addition to immobilization through hydrogels, we studied a method of covalent immobilization of antibody fragments that allowed them to be oriented and very close to the sensor surface. Thus the thesis is organized into six chapters. Chapter 1 gives an overview of the concept of biosensing, and takes into account the different classifications and different items that must be considered in its design. Chapter 2 sets out the general and particular objectives of the thesis. Chapter 3 discusses the application of two photoinduced hydrogels, derived from phosphoricoline and dextran, respectively, to improve the immobilization of biomolecules in microarray format, on planar surfaces and using the fluorescence microarray format to perform detection assays with proteins and oligonucleotides. The polymerization of the gel and the anchoring of the probes are carried out using photoinduced reactions using the thiol-ene coupling click chemistry, and derivatives, performing both steps simultaneously. In Chapter 4 the method developed with one of the hydrogels in microarray format is transferred to two types of SU-8 based interferometric label-free biosensors. Both biosensors detected CRP in blood serum with very good sensitivity (LOD de 21 pg/mL). Besides, this strategy is also tested on nanophotonic sensors based on corrugated waveguides with promising results. In this chapter, immobilization of antibody fragments on the surface of the nanophotonic sensor is also performed and assessed in real time by the UV light-induced thiol-ene coupling reaction. Real-time monitoring shows the essential role of light in the immobilization process. Using this approach, the label-free detection of three cardiac biomarkers of interest (CRP, cTnI / T and Myoglobin) is tested. The fifth chapter is devoted to the detailed description of all the experimental procedures that are carried out in chapters 3 and 4. Finally, Chapter 6 collects the conclusions reached from the results obtained in the development of the doctoral thesis. / [CA] La present tesi "Vies d'immobilització de biomolècules sobre SU-8 i altres superfícies polimèriques per a la seva utilització en biosensado òptic sense marcatge" té com a objectiu el disseny, desenvolupament i avaluació de diferents mètodes d'ancoratge de bioreceptors en diferents materials, en format de micromatriu , amb aplicació en biosensat. En l'actualitat segueix sent una àrea de creixent interès desenvolupar nous sistemes d'anàlisi per a la detecció de biomolècules, que siguen més sensibles i selectius, amb temps d'anàlisi reduïts, miniaturizables i automatitzables. Aquests desenvolupaments poden aplicar-se en dispositius biosensors que troben la seva utilitat en camps tan diversos com diagnòstic clínic, medicina forense i medi ambient. Amb l'objectiu de desenvolupar biosensors amb prestacions millorades es van estudiar estratègies d'immobilització de sondes sobre el suport d'assaig basades en l'ús de hidrogels. En una primera fase, els desenvolupaments es van realitzar usant tecnologia de micromatrius, que permet utilitzar una menor quantitat de mostra i analitzar múltiples dianes i mostres alhora, reduint el temps d'anàlisi i el cost Posteriorment, els desenvolupaments ja optimitzats es van emprar per a la posada a punt d'un biosensor òptic sense marcatge de tipus BICELL (Biophotonic Sensing Cells) en col·laboració amb la UPM (Universitat Politècnica de Madrid), que es van aplicar a sistemes model i als problemes reals. Així mateix, i en col·laboració amb el Centre de Tecnologia Nanofotònica de la UPV, es va implementar l'estratègia d'immobilització a través de l'ús de hidrogels, en biosensors òptics sense marcatge constituïts per guies d'ones corrugades. En aquest cas, a més de la immobilització mitjançant hidrogels es va estudiar un mètode d'immobilització covalent de fragments d'anticossos que va permetre la seva unió orientada i molt propera a la superfície del sensor. Així donç, la tesi s'estructura en sis capítols. En el capítol 1 es dóna una visió general delconcepte de biosensat, atenent les diferents classificacions i els diferents aspectes que cal considerar en el seu disseny. En el capítol 2 es plantegen els objectius generals i particulars de la tesi. El Capítol 3 planteja l'aplicació de dos hidrogels fotoinduïts derivats de fosforicolina i dextrà respectivament per millorar la immobilització de biomolècules en format micromatriu, sobre superfícies planes i usant el format de micromatriu de fluorescència per a realitzar assajos de detecció amb proteïnes i oligonucleòtids. La polimerització dell gel i l'ancoratge de les sondes es porta a terme simultàniament mitjançant la utilització de reaccions fotoinducides emprant la química click d'acoblament tiol-eno, i derivades. En el capítol 4 s'implementa el mètode desenvolupat en micromatriu amb un dels hidrogels en dos tipus de biosensors interferométricos sense marcatge basats en SU-8. Amb tots dos sensors es detecta CRP en sèrum sanguini amb molt bona sensibilitat (LOD de 21 pg/mL). D'altra banda, aquesta estratègia s'assaja també en sensors nanofotònics basats en guies d'ones corrugades amb resultats prometedors. En aquest capítol també es posa a punt i s'avalua en temps real la immobilització de fragments d'anticòs sobre la superfície del sensor nanofotònic, mitjançant la reacció d'acoblament tiol-eno induïda per llum UV. El monitoratge en temps real permet demostrar el paper indispensable de la llum en el procés d'immobilització. Utilitzant aquesta aproximació s'assaja la detecció sense marcatge de tres biomarcadors cardíacs d'interès (CRP, cTnI / T i Mioglobina). El cinquè capítol es dedica a la descripció detallada de tots els procediments experimentals que es duen a terme en els capítols 3 i 4. Finalment, el Capítol 6 recull les conclusions assolides a partir dels resultats obtinguts en el desenvolupament de la tesi doctoral. / Agradecer a la financiación de esta investigación por Garantía Juvenil, FEDER y los proyectos del MINECO CTQ / 2016/75749‐R y TEC / 2017/84846‐R. Además, fue apoyado por el Programa Horizonte 2020 de la Unión Europea en el marco del proyecto H2020‐PHC‐634013 (PHOCNOSIS). / Díaz Betancor, Z. (2020). Vías de inmovilización de biomoléculas sobre SU-8 y otras superficies poliméricas para su utilización en biosensado óptico sin marcaje [Tesis doctoral]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/149576